La gomisina N inhibeix la melanogènesi mitjançant la regulació de les vies de senyalització PI3K/Akt i MAPK/ERK als melanòcits

Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Resum: Gomisin N, s'ha demostrat que un dels compostos de lignan que es troben a Schisandra Chinensis posseeix activitats antioxidants, antitumorals i antiinflamatòries en diversos estudis. Aquí informem, per primera vegada, de l'eficàcia anti-melanogènica de Gomisin N en mamífers cèl·lules, així com en embrions de peix zebra. La gomisina N va reduir significativament el contingut de melanina sense toxicitat cel·lular. Encara que no era capaç de modular l'activitat catalítica del bolettirosinasain vitro,Gomisin Nva regular a la baixa els nivells d'expressió de proteïnes clau que funcionenmelanogènesi. Receptor de melanocortina 1 regulat per la gomisina N (MC1R), adenilil ciclasa 2, factor de transcripció associat a la microftàlmia (MITF), tirosinasa,tirosinasaproteïnes relacionades amb --1(TRP-1) i proteïnes relacionades amb la tirosinasa-2 (TRP{-2). A més, les cèl·lules Melan-A tractades amb Gomisin N van mostrar un augment dels nivells de p-Akt i p-ERK, la qual cosa implica que l'activació de les vies PI3K/Akt i MAPK/ERK pot funcionar per inhibir.melanogènesi. També vam validar que Gomisin va reduir la producció de melanina reprimint l'expressió de MITF,tirosinasa, TRP-1 i TRP-2en cèl·lules humanes i de ratolí, així com en el desenvolupament d'embrions de peix zebra. Col·lectivament, concloem queGomisin Ninhibeix la síntesi de melanina reprimint l'expressió de MITF i melanogenicenzymes, probablement mitjançant la modulació de les vies PI3K/Akt i MAPK/ERK.

Paraules clau:Schisandra Chinensis;Gomisin N; lignan;melanogènesi; blanqueig de la pell

El cistanche té funció per blanquejar la pell

1. Introducció

La melanina és un pigment que es troba a la majoria dels òrgans dels animals, com ara la pell, els cabells, els ulls, l'oïda interna, els ossos, el cor i el cervell [1,2].Melanogènesiés un procés complex on hi intervenen múltiples vies de senyalització. El receptor de melanocortina 1 (MC1R) és un regulador clau enmelanogènesi, senyalitzant a través dels seus lligands com l'hormona estimulant dels melanòcits (MSH) i l'hormona adrenocorticotròpica (ACTH) [3]. La melanina de la pell és biosintetitzada pels melanòcits de l'epidermis i després es transfereix als queratinòcits, on tenen un paper important en la protecció de la pell absorbint la radiació UV de la llum solar i eliminant els radicals lliures reactius [4,5]. La síntesi i transferència de melanina a la pell i els fol·licles pilosos està regulada per la disponibilitat dels seus precursors [6]. La L-tirosina i la L-dihidroxifenilalanina (L-DOPA), els principals substrats dels enzims melanogènics, també funcionen com a reguladors semblants a les hormones en la melanogènesi [7]. D'altra banda, la sobreproducció de melanina provoca preocupacions indesitjables per a la pell com les pigues i el melasma [8,9]. La melanogènesi pot afectar el comportament dels melanòcits normals i malignes modulant les propietats elàstiques de les cèl·lules [10]. Tot i que els receptors de serotonina i melatonina expressats a les cèl·lules cutànies tenen un paper clau en el manteniment de l'homeòstasi cel·lular, la producció excessiva de melanina mitjançant canvis hormonals incontrolats pot causar condicions patològiques a la pell [11].

Així, s'han fet grans esforços per dilucidar els mecanismes moleculars que controlen la melanogènesi com a pas principal per tractar els trastorns de la pell hiperpigmentària. A més, diversos tipus deblanqueig de la pellEls agents que inhibeixen la síntesi de melanina s'han identificat a partir d'extractes vegetals i no vegetals i s'han utilitzat comercialment en cosmecèutics [12,13]. Els agents blanquejants més utilitzats inclouen hidroquinona, mequinol, arbutina, àcid kòjic, àcid ascòrbic i àcid retinoic [12, 14]. Tanmateix, hi ha diverses limitacions del seu ús en el tractament dels símptomes aguts o crònics d'hiperpigmentació en humans. Per exemple, la hidroquinona, tot i que s'ha utilitzat durant molt de temps per a la depigmentació des de la dècada de 1960, pot causar irritació de la pell i dermatitis de contacte [15,16]. També provoca danys a l'ADN augmentant la producció d'espècies reactives d'oxigen i el desenvolupament d'ocronosi exògena en cèl·lules de mamífers [17, 18]. Altres conegutstirosinasaEls inhibidors com l'àcid kojic i l'àcid ascòrbic no només tenen una mala penetració, estabilitat i eficàcia per blanquejar la pell, sinó que també poden causar citotoxicitat, dermatitis i eritema a causa de l'ús a llarg termini [19,20]. En aquest sentit, hi ha una necessitat creixent de desenvolupar agents blanquejants més segurs i efectius per tractar la hiperpigmentació de la pell humana. Les herbes naturals utilitzades en la medicina tradicional poden proporcionar fonts alternatives per identificar nous agents blanquejants que controlen els passos claumelanogènesiamb menys o cap efecte secundari [21].

Schisandra chinensis, també coneguda com a baia de sabor fi del nord, es troba naturalment al nord-est de la Xina, l'extrem-est de Rússia, Japó i Corea [22]. Aquesta planta s'ha utilitzat durant molt de temps per al tractament de la ceguesa nocturna, la cremada de la pell, la inflamació asèptica i les malalties del fetge en la medicina oriental tradicional [23,24]. S'ha demostrat que l'extracte de fruita de S. chinensis i els seus compostos de lignan tenen diversos efectes farmacològics en línies cel·lulars murines. Per exemple, Schisandra A i C tenen efectes antioxidants, mentre que Schisandra B té activitats antifibròtiques, antiinflamatòries, antioxidants i antiapoptòtiques [25]. Un altre compost de lignanGomisin NS'ha informat que (Figura 1A) suprimeix l'apoptosi induïda per l'estrès oxidatiu mitjançant la inhibició de l'alliberament del citocrom C dels mitocondris al citoplasma, la divisió de la caspasa 3 i PARP i la transició de la permeabilitat mitocondrial induïda per Ca2 més en cardiomiòcits de rata H9c2 [7,8]. Curiosament, diversos estudis que utilitzen models de ratolí i línies cel·lulars de la pell humana han revelat el potencial terapèutic de S. chinensis per tractar els trastorns de la pell. Lee et al. va informar que l'extracte de metanol de la fruita de S. chinensis va alleujar els símptomes de la dermatitis de contacte reduint la producció de citocines proinflamatòries com TNF- i IFN- quan s'aplicaven tòpicament [8,24]. Kang et al. va demostrar que l'extracte d'aigua de Schisandra Fructus va inhibir l'activació d'IκB, suprimint així la producció de TNF-, IL-6 i GM-CSF a la línia de mastòcits humans HMC-1 [26]. Aquestes troballes ens van portar a postular que els lignans de S. chinensis poden afectar les funcions de les cèl·lules de la pell de manera més àmplia. En aquest estudi, hem intentat investigar els papers putatius deGomisin N, un dels principals compostos de lignans de S. Chinensis, en la regulaciómelanogènesi, avaluant així el seu potencial ús com a agent acosmecèutic. Aquí, ho informemGomisin Ninhibeix la biosíntesi de melanina sense toxicitat cel·lular en cèl·lules humanes i de ratolí, així com en embrions de peix zebra.

2. Resultats

2.1. Efectes de la gomisina N sobre la formació de melanina i la viabilitat cel·lular

Per verificar els efectes de Gomisin N sobremelanogènesi, vam tractar melanòcits de ratolí amb diferents concentracions deGomisin Ndurant 72 h, i després es van avaluar els canvis en el contingut de melanina. El tractament amb Gomisin va reduir el contingut de melanina tant a la línia cel·lular de melanòcits normals Melan-A com a les cèl·lules de melanoma B16F10 de manera dependent de la dosi sense toxicitat cel·lular (figura 1B, C). Vam observar que la Gomisin N inhibia la producció de melanina induïda per MSH a les cèl·lules B16F10, que era comparable amb els resultats obtinguts pel tractament amb PTU [27] (Figura 1C). Per avaluar si la reducció de melanina sobreGomisin NEl tractament es deu a la disminució de l'activitat de la tirosinasa, vam realitzar un assaig de tinció de L-DOPA en cèl·lules de melanòcit epidèrmic humà normal (NHEM). Com es mostra a la figura 1E, les cèl·lules NHEM tractades amb Gomisin N van mostrar nivells reduïts de L-DOPA en comparació amb les cèl·lules no tractades. Tanmateix, l'efecte inhibidor de la Gomisin N sobre la producció de melanina no va ser significatiu a les cèl·lules MNT-1 de melanoma humà (figura 1D) .

2.2. Efectes de la gomisina N sobre l'activitat de la tirosinasa

Per examinar siGomisin Ninhibeixtirosinasaactivitat in vitro, hem utilitzat tirosinasa de bolets i lisats de cèl·lules de melanoma B16. L'àcid kòjic, un conegut inhibidor de la tirosinasa, es va utilitzar com a control positiu. Quan es va tractar amb tirosinasa de bolets, mentre que l'àcid kòjic va reduir significativament l'activitat enzimàtica, Gomisin N no va induir cap canvi en la conversió de L-DOPA a dopacrom (figura 2A). Tanmateix, quan es va tractar amb cèl·lules de melanoma B16, Gomisin N va provocar una disminució. entirosinasaactivitat del lisat cel·lular de manera dependent de la dosi (figura 2B). A més, quan es cotracta amb -MSH en cèl·lules B16,Gomisin Nva revertir l'augment de la formació de dopacrom estimulat per -MSH (figura 3C). En particular, la gomisina N semblava ser més eficaç que l'àcid kòjic per inhibir la cèl·lula.activitat tirosinasade cèl·lules B16 a l'estímul -MSH. Aquestes troballes impliquen que l'efecte inhibidor de GomisinN sobre la producció de melanina observat en cèl·lules humanes i de ratolí (figura 1) no es deu a la seva funció per inhibir directament l'activitat catalítica de la tirosinasa. No obstant això, encara és possible que la Gomisin N reguli l'expressió de la tirosinasa o altres proteïnes que tenen un paper clau enmelanogènesi.

2.3. Efectes de la gomisina N sobre la inactivació de la via de senyalització MC1R

Hem intentat dilucidar el mecanisme subjacent responsable de l'efecte inhibidor de GomisinN sobre la producció de melanina. Ho vam raonarGomisin Npodria regular les proteïnes de senyalització que estan implicadesmelanogènesii així inhibir la síntesi de melanina. El receptor de melanocortina 1 (MC1R) és un receptor amelanocític acoblat a proteïna G que funciona com a regulador clau en la síntesi de melanina. L'activació de MC1R pel seu lligand -MSH o hormona adrenocorticotròpica (ACTH) condueix a un augment de l'adenilil ciclasa, que al seu torn regula els nivells de cAMP intracel·lular [2, 3]. En conseqüència, el nivell transcripcional de MITF augmenta mitjançant la via de la proteïna quinasa-C (PKA)/proteïna d'unió a l'element sensible (CREB) [2, 28]. Per avaluar l'efecte regulador de la Gomisin N en la via de senyalització MC1R, vam comprovar els nivells d'expressió de MC1R i les seves molècules de senyalització aigües avall després de tractar cèl·lules Melan-A amb Gomisin N. Vam observar que la Gomisin N regulava significativament els nivells de proteïnes tant de MC1R com de l'adenil ciclasa 2. de manera dependent de la dosi (figura 3A-C). Com era d'esperar,Gomisin NLes cèl·lules tractades també van mostrar nivells de proteïnes reduïts de MITF i els seus objectius coneguts tirosinasa, TRP -1 i TRP -2 (figura 3A, D-G). Aquestes troballes suggereixen que la Gomisin N inhibeix els enzims productors de melanina inactivant MITF mitjançant la via de senyalització MC1R.

2.4. Efectes de la gomisina N sobre la fosforilació d'Akt i ERK1/2 a les cèl·lules Melan-A

Se sap que les vies PI3K/Akt i MAPK/ERK estan implicades en la melanogènesi que regula MITF per transcripció o post-transcripció [29, 30]. Per avaluar si GomisinN afecta aquestes vies de senyalització, es va avaluar l'estat de fosforilació d'Akt i ERK1/2 mitjançant l'anàlisi de Western blot. Com es mostra a la figura 3H-J, tractament amb dosis altes (30 µM) deGomisin Nva millorar significativament la fosforilació tant d'Akt com d'ERK. Aquestes dades indiquen que l'efecte inhibidor de la Gomisina N sobremelanogènesiÉs probable que estigui associat amb les vies P13K/Akt i MAPK/ERK.

2.5. Melanogènesi inhibida de la gomisina N en embrions de peix zebra

A continuació, vam voler examinar si Gomisin N és eficaç per inhibirmelanogènesien viu. Per això, vam tractar embrions de peix zebra amb Gomisin N durant 72 h a concentracions d'1, 10, 20 i 30 µM, i després vam mesurar els nivells d'expressió de proteïnes melanogèniques. Vam observar que el tractament amb Gomisin N va inhibir la formació de melanina en el desenvolupament d'embrions de peix zebra.Gomisin NEls embrions tractats van mostrar una reducció del contingut de melanina de manera dependent de la concentració en comparació amb el control no tractat (figura 4). També vam trobar que els nivells de proteïnes detirosinasa, MITF, TRP-1 i TRP-2 es van reduir amb el tractament amb Gomisin N (figura 5). Aquests resultats demostren que la Gomisin N inhibeix la melanogènesi in vivo mitjançant la regulació del factor de transcripció MITF i els seus objectius.tirosinasa, TRP-1 i TRP-2.

2.6. Gomisin N va revertir la melanogènesi induïda per rapamicina en la MNT humana-1

Tot i que Gomisin N va inhibir significativamentmelanogènesia les cèl·lules Melan-A i B16, així com als embrions de peix inzebra, no vam observar el seu efecte sobre les cèl·lules de melanoma MNT-1 humanes. Esperàvem que l'efecte de la gomisina N es pogués detectar a les cèl·lules MNT-1 en la condició en què la melanogènesi estigui regulada per un estímul adequat. S'ha demostrat que la rapamicina indueix la melanogènesi augmentant l'activitat de la tirosinasa i els nivells de proteïnes de MITF, tirosinasa, TRP-1 i TRP-2 [31], parcialment mitjançant l'activació de l'autofàgia [32]. Hem controlat els nivells detirosinasa, MITF, TRP-1 i TRP-2 en cèl·lules MNT-1 mitjançant anàlisi Western blot, després del cotractament amb Gomisin N andrapamicina. El tractament amb rapamicina va induir significativament els nivells de MITF, TRP-1 i TRP-2, però no va tenir cap efecte sobretirosinasanivells (figura 6). Tanmateix, el tractament amb Gomisin N va revertir significativament els efectes de la rapamicina sobre MITF, TRP-1 i TRP-2 de manera dependent de la concentració. L'efecte invers deGomisin Ncontra la rapamicina era més prometedor a la concentració de 20 i 30 µM que a 10 µM. Aquests resultats suggereixen que la gomisina N inhibeixmelanogènesia les cèl·lules de melanoma MNT-1 humanes mitjançant la regulació del factor de transcripció MITF i els seus objectius TRP-1 i TRP-2.

3. Discussió

La funció principal de la melanina és protegir les cèl·lules de la pell contra la radiació UV [33–35]. La hiperpigmentació, resultat d'una sobreproducció de melanina a la pell, provoca problemes cosmètics no desitjats i s'associa amb dermatitis i càncer de pell. Diversos informes han suggeritmelanogènesicom a objectiu important per tractar el melanoma metastàtic [36,37]. Per tant, hi ha una necessitat creixent de desenvolupar agents anti-melanogènics que regulen la melanogènesi sense toxicitat cel·lular [38]. Hi ha diverses vies implicades en la melanogènesi de la pell [39,40]. En unir-se al lligand, MC1R millora l'activitat de l'adenilil ciclasa, que posteriorment augmenta els nivells intracel·lulars d'AMPc [41, 42]. S'ha informat àmpliament de l'activació depenent de cAMP de la via PKA/CREB per regular els nivells transcripcionals de MITF, millorant així la síntesi de melanina [43]. MITFfunciona com a regulador principal dels tres enzims melanogènics principals tirosinasa, TRP-1 i TRP-2en vertebrats [3,21,44]. Aquests enzims són proteïnes transmembrana localitzades a la membrana melanosomal dels melanòcits. La tirosinasa regula el pas que limita la velocitatmelanogènesiconvertint la L-tirosinasa en L-DOPA [23]. TRP-1 i TRP-2 també tenen un paper important en la síntesi de melanina, tot i que les seves funcions no s'entenen del tot.

En aquest estudi, Gomisin N, un compost de lignan de S. chinensis va mostrar activitat despigmentant sense toxicitat cel·lular. La gomisina N va inhibir la síntesi de melanina en línies cel·lulars de mamífers cultivades així com en embrions de peix zebra. La gomisina N semblava ser més eficaç que la PTU de control positiu que inhibeix la producció de melanina a les cèl·lules Melan-A (figura 1B). La gomisina N va reduir el contingut de melanina de manera dependent de la concentració. En comparació amb el grup control no tractat, 10 µM deGomisin Nva reduir el contingut de melanina en un 40 per cent, sense toxicitat cel·lular. L'activitat anti-melanogènica de 10-µM Gomisin N era comparable a la de 100-µM PTU a les cèl·lules Melan-A. De la mateixa manera, la gomisina semblava ser més potent que la PTU a les cèl·lules B16F10 activades per -MSH, on els efectes de 5- i10-µM Gomisin N eren comparables amb els de 10- i {{12 }} µM PTU, respectivament (Figura 1C). Les cèl·lules NHEM tractades amb Gomisin N presentaven nivells reduïts de L-DOPA, cosa que suggereix que la GomisinN inhibeixtirosinasaactivitat en cèl·lules cultivades (figura 1E). Aquestes troballes ens van portar a investigar més el mecanisme subjacent pel qual la gomisina N inhibeix la melanogènesi.

Hem examinat siGomisin NModula directament l'activitat catalítica detirosinasain vitro. A diferència de l'àcid kòjic, Gomisin N no va mostrar efectes inhibidors sobre l'activitat de la tirosinasa dels bolets (Figura 2A). No obstant això, l'activitat de la tirosinasa cel·lular en els lisats de cèl·lules de melanoma B16 es va reduir significativament per Gomisin N tant amb tractament amb -MSH com sense (figura 2B, C). Es va trobar que la inhibició de l'activitat de la tirosinasa cel·lular de Gomisin N a l'estímul -MSH era més significativa que la de l'àcid kòjic de control positiu (figura 2C).

Vam postular que la funció anti-melanogènica de la Gomisina N podria produir-se mitjançant la regulació transcripcional o post-transcripcional de la tirosinasa i les proteïnes relacionades amb la tirosinasa (TRP). Per validar-ho, vam mesurar els nivells d'expressió de molècules de senyalització a la via MC1R, un determinant important quantitat i qualitat de la producció de melanina als melanòcits. Com era d'esperar, vam observar que Gomisin N reduïa els nivells de MC1R i adenilil ciclases 2 a les cèl·lules Melan-A (figura 3A-C). A més,Gomisin Nva regular a la baixa l'expressió de MITF i les seves proteïnes objectiu, incloses la tirosinasa, TRP-1 i TRP-2 (figura 3A, D-G). Aquests resultats suggereixen que els nivells reduïts de contingut de melanina després del tractament amb Gomisin N resulten de la desactivació de la via MC1R.

D'altra banda, les vies PI3K/Akt i MAPK/ERK poden fosforilar MITF i, per tant, modular la seva activitat post-transcripcional [45]. Tanmateix, l'efecte global de l'activació de les vies PI3K/Akt i MAPK/ERK enmelanogènesiés controvertit. Tant les vies PI3K/Akt com les MAPK/ERK s'activen constitutivament en els melanomes humans a causa de mutacions acumulades [46]. Se sap que la despigmentació mediada per C2-ceramida a les cèl·lules Mel-Ab es produeix mitjançant una reducció dels nivells de p-Akt [47]. Hi ha diversos compostos naturals que activen la melanogènesi mitjançant la regulació dels nivells de p-ERK a les cèl·lules de melanoma B16 [28]. En canvi, també hi ha proves que els nivells elevats de p-ERK i p-Akt inhibeixen la síntesi de melanina [28,48]. La inregulació de la complexitat de la melanogènesi es pot explicar parcialment pel fet que la fosforilació millora l'activitat transcripcional de MITF, però simultàniament indueix la degradació de MITF depenent del proteosoma de la ubiquició [26,49–51]. Les nostres dades van mostrar que tant els nivells de p-Akt com de p-ERK estaven regulats en cèl·lules Melan-A tractades amb Gomisin N (figura 3H-J). Això implica que les vies PI3K/Akt i MAPK/ERK poden contribuir a la inhibició de la producció de melanina.

Vam validar encara més l'activitat anti-melanogènica de Gomisin N en el model in vivo del peix zebra. Els embrions de peix zebra tractats amb Gomisin N van mostrar una reducció significativa de la pigmentació de la melanina (Figura 4). A més, Gomisin N va disminuir notablement els nivells detirosinasa, MITF, TRP-1 i TRP-2 en el desenvolupament d'embrions de peix zebra. Aquestes troballes en conjunt suggereixen queGomisin Nindueix la despigmentació mitjançant la regulació a la baixa de l'expressió de MITF i enzims melanogènics in vivo. L'activitat anti-melanogènica de la gomisina N es va confirmar encara més en cèl·lules MNT-1 de melanoma humà estimulades per rapamicina. Tot i que la Gomisin N només va provocar petits canvis en el contingut de melanina a les cèl·lules MNT-1 (figura 1D), va ser eficaç per revertir la regulació a l'alça induïda per la rapamicina de MITF, TRP-1 i TRP-2 en de manera dependent de la concentració (figura 6A, C–E). En conjunt, l'efecte regulador deGomisin Nsobre MITF i enzims melanogènics es va trobar de manera reproducible en cèl·lules de ratolí i humans, així com en embrions de peix zebra.

En resum, aquest treball suggereix que Gomisin N pot tenir un gran potencial com a novel·lablanqueig de la pellagent. La gomisina N sembla inhibirmelanogènesireprimint l'expressió de MITF a través de la via MC1R, en lloc de modular directament l'activitat catalítica detirosinasai TRP. Tot i que encara queden per dilucidar els mecanismes detallats, és probable que la despigmentació induïda per Gomisin N estigui associada amb l'activació de les vies PI3K/Akt i MAPK/ERK (figura 7).

4. Materials i Mètodes

4.1. Materials

RPMI1640 es va comprar a Gibco-BRL (Gaithersburg, MD, EUA). El medi d'Eagle modificat de Dulbecco (DMEM), el sèrum boví fetal (FBS) i la penicil·lina-estreptomicina (PS) es van comprar a Hyclone (Carlsbad, CA, EUA). El medi de creixement de melanòcits es va comprar a PromoCell (Heidelberg, Alemanya). Fluorur de fenilmetilsulfonil (PMSF), 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetat (TPA), àcid kòjic, 1-fenil-2-tiourea (PTU), tirosinasa de bolets, 3,{{ 9}}dihidroxi-l-fenilalanina (L-DOPA), -MSH, sulfòxid de dimetil (DMSO) i paraformaldehid es van comprar a SigmaChemical Co. (St. Louis, MO, EUA).Gomisin NEl compost va ser proporcionat per Chul Young Kim (Universitat de Hanyang, Ansan, Corea). La rapamicina es va comprar a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA).

4.2. Cultiu cel·lular

La línia cel·lular de melanoma de ratolí B16F10 es va proporcionar del Korean Cell Line Bank (Seül, Corea). Les cèl·lules Melan-A de melanòcits murins [52] van ser un regal generós del doctor Byeong Gon Lee (l'Institut SkinResearch, Amore Pacific Co., Yongin). -si, Corea). Les cèl·lules de melanoma MNT-1 humans van ser proporcionades generosament per Aeyeong Lee (collage de medicina a la Universitat de Dongguk, Goyang-si, Corea). Els melanòcits epidèrmics humans normals primaris (NHEM) es van comprar a PromoCell (Heidelberg, Alemanya). Les cèl·lules Melan-A es van cultivar en medi RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad, CA, EUA) complementat amb un 10 per cent de FBS, un 1 per cent de PS i 200 nM de TPA. Es va utilitzar DMEM complementat amb un 10 per cent de FBS i un 1 per cent de PS per mantenir les cèl·lules Melan-A i les cèl·lules NHEM. Totes les cèl·lules es van incubar a 37 ◦ C en una incubadora al 5 per cent de CO2.

4.3. Mesura del contingut de melanina

Les cèl·lules Melan-A es van sembrar en una placa 24-pou (1 × 105 cèl·lules/pou), tractada ambGomisin N, i després es va incubar durant 72 h. Després de 72 h, es va mesurar el contingut de melanina tal com es va descriure anteriorment [53]. Breument, després d'eliminar el medi de cultiu, les cèl·lules es van rentar tres vegades amb PBS. A continuació, es va afegir una solució d'hidròxid de sodi (1 ml, 1 N) a cada pou per dissoldre la melanina. L'absorbància a 405 nm es va mesurar mitjançant un lector de microplaques. Aquest assaig es va repetir amb cèl·lules B16F10 (2 × 104 cèl·lules/pou) i cèl·lules MNT-1 seguint el mateix mètode.

4.4. Anàlisi Western Blot

Les cèl·lules Melan-A es van sembrar en plats de 100 mm (1 × 106 cèl·lules/plat) i es van tractar amb 1, 5 o 10 µMGomisin Ndurant tres dies a 37 ◦C. Les cèl·lules es van rentar amb PBS i després es van collir amb un rascador. Les cèl·lules separades es van posar en 1 ml de PBS i es van centrifugar a 75 00 rpm durant 5 min. Després d'eliminar la solució superior, els pellets de cèl·lules es van lisar amb tampó de lisi (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0,1% SDS, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,02 per cent d'azida de sodi, 0,5 per cent de desoxicolat de sodi, 100 µg/mL de PMSF, 1 g/mL d'aprotinina) durant 24 h a 4 ◦C. Les proteïnes totals es van extreure mitjançant una ultracentrífuga a 12,000 rpm durant 30 min a 4◦C. El contingut de proteïnes es va mesurar mitjançant l'assaig de Bradford. Les proteïnes (30 µg) es van separar mitjançant un gel d'electroforesi en gel de dodecilsulfat de sodi-poliacrilamida (SDS-PAGE) al 10% i es van transferir a la membrana d'anitrocel·lulosa. La membrana es va bloquejar durant 1 h amb llet desnatada al 5 per cent en solució salina tamponada amb Tris amb Tween-20 (TBST) i després es va incubar durant 12 h a 4 ◦C amb anticossos primaris dirigits a -tubulina (Santa Cruz, CA, EUA). ), MITF (senyalització cel·lular, Danvers, MA, EUA), tirosinasa (senyalització cel·lular), ERK (senyalització cel·lular), fosfo-ERK (senyalització cel·lular), AKT (senyalització cel·lular), fosfo-AKT (senyalització cel·lular), MC1R ( Santa Cruz), adenilil ciclases 2 (Santa Cruz), TRP-1 (Santa Cruz) i TRP-2 (Santa Cruz). Després d'eliminar els anticossos primaris, les membranes es van rentar tres vegades amb TBST i es van incubar amb secundaris. anticossos (conill anti-cabra IgG-HRP; ratolí anti-conill HRP, Santa Cruz) durant 1 h. Les membranes es van tractar amb reactiu de quimioluminescència millorat mitjançant el sistema d'imatge ChemiDoc XRS plus (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). L'anàlisi densitomètrica de les bandes es va realitzar mitjançant el programari Image MasterTM 2D Elite (versió 3.1, GE Healthcare, Chicago, IL, EUA).

4.5. Assaig d'activitat de la tirosinasa

Estimar l'efecte inhibidor de la gomisina N sobre els boletstirosinasaactivitat, la tirosinasa es va incubar amb 1, 5 o 10 µMGomisin No el control positiu àcid kòjic. Cada mostra es va dissoldre en metanol. La L-DOPA (8, 3 mM) i la tirosinasa de bolets (125 U) es van diluir en tampó fosfat de 80 mM (pH 6, 8). Es van barrejar 40 µL de cada mostra i 120 µL de L-DOPA en una placa de 96-pou, seguida de l'addició de 40 µL de tirosinasa de bolets diluïda. A continuació, es van incubar les plaques durant 15 min i es va mesurar l'absorbància a 490 nm mitjançant un lector de microplaques.

TirosinasaL'activitat dels lisats de cèl·lules de melanoma B16 es va mesurar amb o sense tractament amb -MSH, tal com es va descriure anteriorment per Ohguchi et al. [54], amb lleugeres modificacions. El lisat cel·lular es va preparar tal com es descriu anteriorment a la part d'anàlisi de Western Blot. Les proteïnes totals del sobrenedant es van mesurar mitjançant un assaig de Bradford utilitzant albúmina sèrica bovina com a estàndard [55]. Es va diluir una quantitat igual de proteïnes i es va utilitzar per a l'assaig d'activitat de la tirosinasa.

inhibir l'activitat de la tirosinasa

4.6. Tinció de L-DOPA en cèl·lules NHEM

Les cèl·lules NHEM es van sembrar en una placa de {{{0}}pous i es van incubar durant 72 h amb Gomisin N. Les cèl·lules es van fixar amb un 4% de paraformaldehid durant 40 min, seguit d'un tractament amb un 0,1% de Triton X{ {6}} durant 2 min. Es va afegir L-DOPA (0,1 per cent) a cada pou, seguit d'incubació durant 2 h. Després d'eliminar la solució, les cèl·lules es van rentar dues vegades amb PBS. Les imatges van ser fotografiades al microscopi.

4.7. Experiments amb peix zebra

Els embrions de peix zebra es van obtenir del Banc de recursos de peix zebra (Daegu, Corea). Els embrions es van tractar amb Gomisin N durant 72 h. L'efecte despigmentant deGomisin Nen embrions de peix zebra es va observar sota l'estereomicroscopi. Per a l'anàlisi de Western blot, els embrions tractats amb Gomisin N es van lisar mitjançant tampó de lisi, a partir del qual es van preparar proteïnes totals tal com s'ha esmentat anteriorment.

5. Conclusions

El nostre resultat recolza l'opinió que Gomisin N té un alt potencial d'ús com a aliment funcional iblanqueig de la pellagent.Gomisin Nés un dels principals compostos de lignan de S. Chinensis. De fet, S. Chinensis és un medicament a base d'herbes que s'utilitza per a la curació de moltes malalties humanes. No obstant això, calen estudis epidemiològics addicionals per demostrar la seguretat de Gomisin N a la pell. En conseqüència, els estudis in vivo i els assaigs clínics podran demostrar més clarament l'eficàcia de GomisinN. En conclusió, aquest estudi suggereix queGomisin Npot ser un potencial agent hipopigmentari i naturalblanqueig de la pellcandidat a la indústria cosmètica.

cistanche millorar el blanqueig

Referències

1. Alaluf, S.; Atkins, D.; Barrett, K.; Blount, M.; Carter, N.; Heath, A. L'impacte de la melanina epidèrmica en les mesures objectives del color de la pell humana. Pigment Cell Res. 2002, 15, 119–126. [CrossRef] [PubMed]

2. D'Mello, SA; Finlay, GJ; Baguley, BC; Askarian-Amiri, ME Vies de senyalització en la melanogènesi. Int. J.Mol. Ciència. 2016, 17, 1144. [CrossRef] [PubMed]

3. Slominski, A.; Tobin, DJ; Shibahara, S.; Wortsman, J. Pigmentació de melanina a la pell dels mamífers i la seva regulació hormonal. Physiol. Rev. 2004, 84, 1155–1228. [CrossRef] [PubMed]

4. Herrling, T.; Jung, K.; Fuchs, J. El paper de la melanina com a protector contra els radicals lliures a la pell i el seu paper com a indicador de radicals lliures en el cabell. Spectrochim Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. 2008, 69, 1429–1435. [CrossRef] [PubMed]

5. Brozyna, AA; Jozwicki, W.; Roszkowski, K.; Filipiak, J.; Slominski, AT El contingut de melanina en melanomametastasis afecta el resultat de la radioteràpia. Oncotarget 2016, 7, 17844–17853. [CrossRef] [PubMed]

6. Slominski, A.; Wortsman, J.; Plonka, PM; Schallreuter, KU; Paus, R.; Tobin, DJ Pigmentació del fol·licle pilós.J. Investig. Dermatol. 2005, 124, 13–21. [CrossRef] [PubMed]

7. Slominski, A.; Zmijewski, MA; Pawelek, J. L-tirosina i L-dihidroxifenilalanina com a reguladors semblants a les hormones de les funcions dels melanòcits. Melanoma de cèl·lules pigmentàries Res. 2012, 25, 14–27. [CrossRef] [PubMed]

8. Lee, AY Avenços recents en la patogènesi del melasma. Melanoma de cèl·lules pigmentàries Res. 2015, 28, 648–660. [CrossRef][PubMed]9. Speeckaert, R.; van Gele, M.; Speeckaert, MM; Lambert, J.; van Geel, N. The biology of hyperpigmentationsyndromes. Melanoma de cèl·lules pigmentàries Res. 2014, 27, 512–524. [CrossRef] [PubMed]

10. Slominski, RM; Zmijewski, MA; Slominski, AT El paper del pigment de melanina en el melanoma. Exp. Dermatol.2015, 24, 258–259. [CrossRef] [PubMed]11. Slominski, A.; Wortsman, J.; Tobin, DJ El sistema serotoninèrgic/melatoninèrgic cutani: Assegurar-se sota el sol. FASEB J. 2005, 19, 176–194. [CrossRef] [PubMed]

12. Sarkar, R.; Arora, P.; Garg, KV Cosmeceuticals per a la hiperpigmentació: què hi ha disponible? J. Estètica cutània. Surg. 2013, 6, 4–11. [CrossRef] [PubMed]

13. Miyamura, Y.; Coelho, SG; Wolber, R.; Miller, SA; Wakamatsu, K.; Zmudzka, BZ; Ito, S.; Smuda, C.;Passeron, T.; Choi, W.; et al. Regulació de la pigmentació de la pell humana i respostes a la radiació ultraviolada. Pigment Cell Res. 2007, 20, 2–13. [CrossRef] [PubMed]

14. Davis, EC; Callender, VD Hiperpigmentació postinflamatòria: una revisió de l'epidemiologia, les característiques clíniques i les opcions de tractament de la pell de color. J. Clin. Esteta. Dermatol. 2010, 3, 20–31. [PubMed]

15. Sales-Campos, H.; Souza, PR; Peghini, BC; da Silva, JS; Cardoso, CR Una visió general dels efectes moduladors de l'àcid oleic en la salut i la malaltia. Mini. Reverent Med. Chem. 2013, 13, 201–210. [CrossRef] [PubMed]

16. Parvez, S.; Kang, M.; Chung, HS; Cho, C.; Hong, MC; Shin, MK; Bae, H. Enquesta i mecanisme dels agents de pigmentació i alleugeriment de la pell. Phytother. Res. 2006, 20, 921–934. [CrossRef] [PubMed]

17. Luo, L.; Jiang, L.; Geng, C.; Cao, J.; Zhong, L. Genotoxicitat induïda per hidroquinona i dany oxidatiu de l'ADN a les cèl·lules HepG2. Chem. Biol. Interactuar. 2008, 173, 1–8. [CrossRef] [PubMed]

18. Enguita, FJ; Leitao, AL Hidroquinona: contaminació ambiental, toxicitat i respostes microbianes. BioMed Res. Int. 2013, 2013, 542168. [CrossRef] [PubMed]

19. Draelos, ZD Preparats per aclarir la pell i la polèmica de la hidroquinona. Dermatol. Allà. 2007, 20.308–313. [CrossRef] [PubMed]

20. Koo, JH; Lee, I.; Yun, SK; Kim, HU; Park, BH; Park, JW L'oli d'onagra saponificat redueix la melanogènesi a les cèl·lules de melanoma B16 i redueix la pigmentació de la pell induïda pels UV en humans. Lípids 2010,45, 401–407. [CrossRef] [PubMed]

21. Cordell, GA; Colvard, MD Productes naturals i medicina tradicional: engegar un paradigma. J. Nat. Prod.2012, 75, 514–525. [CrossRef] [PubMed]

22. Panossian, A.; Wikman, G. Farmacologia de Schisandra Chinensis Bail: Una visió general de la investigació i els usos russos en medicina. J. Etnofarmacol. 2008, 118, 183–212. [CrossRef] [PubMed]

23. Chen, P.; Pang, S.; Yang, N.; Meng, H.; Liu, J.; Zhou, N.; Zhang, M.; Xu, Z.; Gao, W.; Chen, B.; et al. Efectes beneficiosos de Schisandrin B sobre la funció cardíaca en ratolins model d'infart de miocardi. PLoS ONE 2013, 8,e79418. [CrossRef] [PubMed]

24. Lee, HJ; Jo, S.; Ryu, J.; Jeong, HS; Lee, G.; Ryu, MH; Jung, MH; Kim, H.; Kim, BJ Efectes de SchisandraChinensis Turcz. fruita en dermatitis de contacte induïda per dinitrofluorobenzè en ratolins. Mol. Med. Informe 2015,12, 2135–2139. [CrossRef] [PubMed]

25. Chun, JN; Cho, M.; Així, jo.; Jeon, JH Els efectes protectors de l'extracte de fruita de Schisandra Chinensis i els seus lignans contra les malalties cardiovasculars: una revisió dels mecanismes moleculars. Fitoterapia 2014, 97, 224–233.[CrossRef] [PubMed]

26. Kang, OH; Chae, HS; Choi, JH; Choi, HJ; Parc, PS; Cho, SH; Lee, GH; Així, HY; Choo, YK;Kweon, OH; et al. Efectes de l'extracte d'aigua de Schisandra Fructus sobre l'alliberament de citocines d'una línia de cèl·lules mastòriques humanes. J. Med. Food 2006, 9, 480–486. [CrossRef] [PubMed]

27. Poma, A.; Bianchini, S.; Miranda, M. Inhibició de la producció de micronuclis induïts per L-tirosina per feniltiourea en cèl·lules de melanoma humà. Mutat. Res. 1999, 446, 143–148. [Ref creuat]

28. Kim, HJ; Kim, IS; Dong, Y.; Lee, IS; Kim, JS; Kim, JS; Woo, JT; Cha, BY Efecte inductor de la melanogènesi de la cirsimaritina mitjançant l'augment del factor de transcripció associat a la microftàlmia i l'expressió de la tirosinasa. Int. J. Mol. Ciència. 2015, 16, 8772–8788. [CrossRef] [PubMed]

29. Busca, R.; Abbe, P.; Mantoux, F.; Aberdam, E.; Peyssonnaux, C.; Eychene, A.; Ortonne, JP; Ballotti, R. Rasmediates the cAMP-dependent activation of extracellular signal-regulated kinases (ERKs) in melanocytes.EMBO J. 2000, 19, 2900–2910. [CrossRef] [PubMed]

30. Busca, R.; Ballotti, R. AMP cíclic un missatger clau en la regulació de la pigmentació de la pell. Pigment Cell Res.2000, 13, 60–69. [CrossRef] [PubMed]

31. Ha, YS; Cho, HY; Lim, TY; Park, DH; Kim, HM; Yoon, J.; Kim, JG; Kim, CY; Yoon, TJ Inducció de la melanogènesi per rapamicina en cèl·lules de melanoma MNT-1 humanes. Ann. Dermatol. 2012, 24, 151–157. [CrossRef][PubMed]

32. Yun, WJ; Kim, EY; Park, JE; Jo, SY; Bang, SH; Chang, EJ; Chang, SE La cadena 3 proteïna associada a microtúbuls està implicada en la melanogènesi mitjançant la regulació de l'expressió MITF als melanòcits. Ciència. Informe.2016, 6, 19914. [CrossRef] [PubMed]

33. Spritz, RA; Audició, VJ, Jr. Trastorns genètics de la pigmentació. Adv. Brunzit. Genet. 1994, 22, 1–45. [PubMed]

34. Kadekaro, AL; Chen, J.; Yang, J.; Chen, S.; Jameson, J.; Swope, VB; Cheng, T.; Kadakia, M.; Abdel-Malek, l'hormona estimulant dels melanòcits Z. suprimeix l'estrès oxidatiu mitjançant la via de senyalització mediada per ap53-en els melanòcits humans. Mol. Càncer Res. 2012, 10, 778–786. [CrossRef] [PubMed]

35. Wasmeier, C.; Hume, AN; Bolasco, G.; Seabra, MC Melanosomes d'un cop d'ull. J. Cell Sci. 2008, 121,3995–3999. [CrossRef] [PubMed]

36. Brozyna, AA; Jozwicki, W.; Carlson, JA; Slominski, AT La melanogènesi afecta la supervivència global i sense malaltia en pacients amb melanoma en estadi III i IV. Brunzit. Patol. 2013, 44, 2071–2074. [CrossRef] [PubMed]

37. Slominski, A.; Kim, TK; Brozyna, AA; Janjetovic, Z.; Brooks, DL; Schwab, LP; Skobowiat, C.; Jozwicki, W.; Seagroves, TN El paper de la melanogènesi en la regulació del comportament del melanoma: la melanogènesi condueix a l'estimulació de l'expressió HIF-1 i les vies acompanyants depenents de HIF. Arc. Bioquímica. Biofísica. 2014, 563,79–93. [CrossRef] [PubMed]

38. Kim, HJ; Lee, JH; Shin, MK; Hyun Leem, K.; Kim, YJ; Lee, MH Efecte inhibidor de la melanogènesi d'extracció de Gastrodia elata en cèl·lules de melanoma HM3KO. J. Cosmet. Ciència. 2013, 64, 89–98. [PubMed]

39. Hemesath, TJ; Preu, ER; Takemoto, C.; Badalian, T.; Fisher, DE MAP quinasa enllaça el factor de transcripció Microftàlmia amb la senyalització c-Kit als melanòcits. Natura 1998, 391, 298–301. [PubMed]

40. Preu, ER; Ding, HF; Badalian, T.; Bhattacharya, S.; Takemoto, C.; Yao, TP; Hemesath, TJ; Fisher, senyalització específica de DELlineage en melanòcits. L'estimulació del C-kit recluta p300/CBP a la microftàlmia.J. Biol. Chem. 1998, 273, 17983–17986. [CrossRef] [PubMed]

41. Bertolotto, C.; Abbe, P.; Hemesath, TJ; Bille, K.; Fisher, DE; Ortonne, JP; Ballotti, R. Producte de microftalmiagen com a transductor de senyal en la diferenciació de melanòcits induïda per cAMP. J. Cell Biol. 1998, 142.827–835. [CrossRef] [PubMed]

42. Pogenberg, V.; Ogmundsdottir, MH; Bergsteinsdottir, K.; Schepsky, A.; Phung, B.; Deineko, V.; Milewski, M.;Steingrimsson, E.; Wilmanns, M. Dimerització restringida de cremallera de leucina i especificitat del reconeixement de l'ADN del regulador principal de melanòcits MITF. Genes Dev. 2012, 26, 2647–2658. [CrossRef] [PubMed]

43. Flaherty, KT; Hodi, FS; Fisher, DE De gens a fàrmacs: estratègies dirigides per al melanoma. Nat. Rev. Càncer2012, 12, 349–361. [CrossRef] [PubMed]

44. Lee, TH; Seo, JO; Baek, SH; Kim, SY Efectes inhibidors del resveratrol sobre la síntesi de melanina en la pigmentació induïda per l'ultraviolat B a la pell de cobaya. Biomol. Allà. 2014, 22, 35–40. [CrossRef] [PubMed]

45. Su, TR; Lin, JJ; Tsai, CC; Huang, TK; Yang, ZY; Wu, MO; Zheng, YQ; Su, CC; Wu, YJ Inhibició de la melanogènesi per àcid gàl·lic: possible implicació de les vies PI3K/Akt, MEK/ERK i Wnt/-cateninsignaling a les cèl·lules B16F10. Int. J. Mol. Ciència. 2013, 14, 20443–20458. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Yajima, I.; Kumasaka, MEU; Thang, ND; Goto, Y.; Takeda, K.; Yamashita, O.; Iida, M.; Ohgami, N.;Tamura, H.; Kawamoto, Y.; et al. Senyalització RAS/RAF/MEK/ERK i PI3K/PTEN/AKT en la progressió i teràpia del melanoma maligne. Dermatol. Res. Practiqueu. 2012, 2012, 354191. [CrossRef] [PubMed]

47. Kim, DS; Kim, SY; Lluna, SJ; Chung, JH; Kim, KH; Cho, KH; Park, KC Ceramide inhibeix la proliferació cel·lular mitjançant la inactivació d'AKT/PKB i disminueix la síntesi de melanina a les cèl·lules Mel-Ab. Pigment Cell Res. 2001, 14, 110–115. [CrossRef] [PubMed]

48. Kim, JH; Baek, SH; Kim, DH; Choi, TY; Yoon, TJ; Hwang, JS; Kim, MR; Kwon, HJ; Lee, CHRegulació de la síntesi de melanina tenint A i la seva aplicació al model de llamps in vivo. J.Investiga. Dermatol. 2008, 128, 1227–1235. [CrossRef] [PubMed]

49. Hartman, ML; Czyz, M. MITF en el melanoma: mecanismes darrere de la seva expressió i activitat. Cell Mol.Life Sci. 2015, 72, 1249–1260. [CrossRef] [PubMed]

50. Kim, DS; Hwang, ES; Lee, JE; Kim, SY; Kwon, SB; Park, KC Esfingosina-1-fosfat disminueix la síntesi de melanina mitjançant l'activació sostinguda d'ERK i la posterior degradació del MITF. J. Cell Sci. 2003, 116,1699–1706. [CrossRef] [PubMed]

51. Xu, W.; Gong, L.; Haddad, MM; Bischof, O.; Campisi, J.; Sí, ET; Medrano, EE Regulació dels nivells de proteïna MITF del factor de transcripció associat a la microftàlmia mitjançant l'associació amb l'enzim conjugant la ubiquitina hUBC9. Exp. Res cel·lular 2000, 255, 135–143. [CrossRef] [PubMed]

52. Bennett, DC; Cooper, PJ; Hart, IR Una línia de melanòcits de ratolí no tumorigènics, singènics amb el melanoma B16 i que requereixen un promotor del tumor per al creixement. Int. J. Càncer 1987, 39, 414–418. [CrossRef][PubMed]

53. Meira, WV; Heinrich, TA; Cadena, SM; Martinez, GR La melanogènesi inhibeix la respiració a les cèl·lules del melanoma B16-F10, mentre que millora el contingut de cèl·lules mitocondrials. Exp. Res cel·lular 2017, 350, 62–72. [CrossRef][PubMed]

54. Ohguchi, K.; Tanaka, T.; Iliya, I.; Ito, T.; Iinuma, M.; Matsumoto, K.; Akao, Y.; Nozawa, Y. Gnetol com a inhibidor de la potenttirosinasa del gènere Gnetum. Biosci. Biotecnologia. Bioquímica. 2003, 67, 663–665. [CrossRef] [PubMed]

55. Uchida, R.; Ishikawa, S.; Tomoda, H. Inhibició de l'activitat de la tirosinasa i la pigmentació de la melanina per 2-hidroxitirosol. Acta Pharm. Sinica B 2014, 4, 141–145. [CrossRef] [PubMed]