La nefropatia per immunoglobulina A es caracteritza per respostes immunitàries humorals anticommensals

Nefropatia IgA(IgAN) ésuna de les principals causes d'insuficiència renal, però se sap poc sobre elimmunopatogènesi d'aquesta malaltia. IgAN es caracteritza per la deposició d'IgA a laglomèruls renals, però no es coneix l'origen i l'estímul per a la producció d'IgA. Les dades clíniques i experimentals suggereixen un paper perrespostes immunitàries aberrantsa la microbiota de la mucosa a IgAN, i en alguns països amb alta prevalença de la malaltia, l'amigdalectomia es considera una teràpia estàndard. Per avaluar la relació entre la microbiota i les respostes immunes de les mucoses, vam caracteritzar la microbiota de les amígdales en pacients amb IgAN versus participants del grup control no relacionats amb la llar iva identificar un augment del transport del gènereNeisseria i IgA sèrica dirigida a Neisseria elevada en pacients amb IgAN. Hem traduït inversament aquestes troballes en IgAN experimental impulsada per la sobreexpressió de BAFF en ratolins transgènics BAFF susceptibles a la infecció per Neisseria mitjançant la introducció d'un transgène CEACAM-1 humanitzat (B × hC-Tg). La colonització de ratolins B × hC-Tg amb Neisseria va produir nivells augmentats d'IgA sistèmica específica de Neisseria. Utilitzant un assaig ELISPOT personalitzat, vam descobrir cèl·lules secretores d'IgA específiques anti-Neisseria dins dels ronyons d'aquests ratolins. Aquestes troballes suggereixen un paper per a les respostes immunes mucoses aberrants impulsades per citocines als patobionts orofaríngs, com ara Neisseria, en la immunopatogènesi d'IgAN. A més, en presència d'excés de BAFF, la IgA específica del patobiont es pot produir in situ dins del ronyó.

NOU HERBES PERNEFROPATIA IGAPER LACAUSA DE LA INSUFICIÈNCIA RENOL

Introducció

Els mecanismes subjacents a la patogènesi de la nefropatia per IgA (IgAN) són poc coneguts, però és una de les causes més freqüents d'insuficiència renal. La "hipòtesi de múltiples èxits" àmpliament acceptada per al desenvolupament d'IgAN se centra en la producció d'IgA1-patògens amb deficiència de galactosa que contenen complexos immunitaris a la circulació i es dipositen dins dels glomèruls renals de pacients amb IgAN (1). La font (és a dir, els teixits limfoides associats a la mucosa i/o la medul·la òssia) i els estímuls per a la producció de complexos immunitaris no es coneixen. Recentment hem demostrat que les cèl·lules plasmàtiques que produeixen IgA de l'intestí poden migrar a teixits del sistema no immune, com el cervell inflamat en el model experimental d'encefalitis d'esclerosi múltiple, canviant radicalment les opinions predominants sobre les propietats de les cèl·lules plasmàtiques (2). Per tant, és temptador especular que les cèl·lules secretores d'IgA derivades de la mucosa també es podrien reclutar a altres òrgans, com ara el ronyó.

L'evidència clínica i experimental suggereix un vincle entre IgAN i les exposicions microbianes de la mucosa. Els pacients amb IgAN experimenten hematúria macroscòpica simultàniament amb faringitis (3), i l'amigdalectomia es considera l'atenció estàndard per als pacients amb IgAN al Japó (4-6). Els nostres estudis anteriors d'un model d'IgAN murí suggereixen que la colonització microbiana comensal és essencial per al desenvolupament d'IgAN en ratolins que sobreexpressen el membre de la família TNF BAFF (7, 8). Aquest model comparteix moltes característiques amb la IgAN humana, inclosa la IgA subglicosilada; mesures clíniques i histològiques de la lesió renal, com la proteinúria; i glomerulonefritis dominant IgA (7, 8). El locus TNFSF13 (ABRIL) es va vincular posteriorment a IgAN en estudis d'associació a tot el genoma (9). Com que APRIL i BAFF comparteixen receptors similars, l'eix BAFF/APRIL ha estat implicat en la patogènesi de la malaltia IgAN.

Per tant, vam plantejar la hipòtesi que en l'entorn d'alts nivells de BAFF/APRIL, les cèl·lules secretores d'IgA derivades de la mucosa es recluten al ronyó i contribueixen al desenvolupament d'IgAN. Per provar aquesta hipòtesi, vam caracteritzar els perfils del microbioma de les amígdales i les femtes d'una gran cohort de pacients amb IgAN en comparació amb els participants del grup control no relacionats amb la llar. Hem identificat un augment del transport d'amígdales de Neisseria i una producció millorada d'IgA dirigida a anti-Neisseria a la sang de la nostra cohort de pacients. Hem traduït aquestes observacions a un model experimental d'IgAN i hem trobat que nivells elevats de BAFF provocaven una resposta immune sistèmica esbiaixada per IgA millorada a l'exposició a Neisseria de la mucosa. Vam observar una major expressió d'ARN que codifica la variant secretada-empalmada d'IgA als ronyons dels nostres ratolins experimentals, cosa que suggereix la transcripció local d'IgA. Utilitzant un ELISPOT personalitzat, vam descobrir que les cèl·lules secretores d'IgA específiques anti-Neisseria eren detectables als ronyons d'aquests ratolins. Els nostres resultats van demostrar que una resposta desadaptativa de l'hoste a un organisme comensal es va associar amb la malaltia IgAN i el reclutament de cèl·lules secretores d'IgA específiques de comensal al ronyó.

Resultats

L'anàlisi de l'ARNr del 16s revela alteracions en el microbioma amigdal·lar de pacients amb IgAN en comparació amb controls sans.

Tenint en compte l'associació entre faringitis i hematúria a IgAN (4), vam comparar la microbiota amigdal·lar i femta d'una cohort de pacients amb IgAN (n=93) amb la d'individus sans i no relacionats amb la llar (n {{3}). }) utilitzant la seqüenciació 16S rRNA V4. Les característiques clíniques es proporcionen a la taula 1. No vam observar diferències estadísticament significatives en la diversitat de Shannon o la riquesa taxonòmica entre els casos i les mostres d'amígdales de control saludable (figura suplementària 1; material suplementari disponible en línia amb aquest article; https://doi.org/ 10.1172/jci.insight.141289DS1). El gènere amigdal·lar dominant difereix entre casos i controls (figura 1A), amb una tendència cap a diferències a Neisseria com a gènere dominant a les mostres d'amígdales IgAN (prova χ2, P=0.15). Per tant, vam avaluar la diferència d'abundància relativa (RA) de Neisseria (Figura 1B) i vam confirmar la presència d'una abundància significativament més gran de Neisseria amígdala a IgAN en comparació amb els controls (2-test t no ajustat P {{19} }.002). No es van observar diferències en la diversitat o la riquesa taxonòmica de la microbiota de les femtes a IgAN en comparació amb els controls (figura suplementària 2).

Les respostes immunes humorals a Neisseria estan esbiaixades cap a IgA versus IgG en pacients amb IgAN. A partir de les diferències observades en l'abundància microbiana amigdal·lar, vam plantejar la hipòtesi que els pacients poden presentar títols alterats d'anticossos anticomensals a la seva circulació. Com que Neisseria representava el gènere més abundant en pacients, vam mesurar les respostes humorals anti-Neisseria, avaluant la proporció d'IgA anti-Neisseria i IgG anti-Neisseria al sèrum. Aquesta relació s'informa com a resposta mitjana d'IgA/IgG contra un panell de 4 espècies de Neisseria com mensals (anti–N. lactamica, N. sicca, N. cinerea i N. flavescens) i 4 gingivitis patògenes de N. men (Nme) soques (90/18311, H4476, 208 i 860800). Tal com es mostra a la figura 2, els pacients amb IgAN van mostrar un augment de la proporció de títols d'anticossos anti-Neisseria IgA/IgG plasmàtics. Es va observar un augment dels títols d'IgA contra Neisseria en resposta tant a soques patògenes de Nme com a soques comensals (figura suplementària 3). Per tant, els pacients amb IgAN van mostrar un biaix cap a la generació d'una resposta IgA millorada a una varietat d'espècies comensals de Neisseria i soques Nme en comparació amb controls sans.

Efecte de la sobreexpressió de BAFF sobre la resposta immune a Nme en ratolins transgènics BAFF. Abans vam informar que la citocina APRIL (TNFSF13) estava elevada en el sèrum de pacients amb IgAN en comparació amb els controls de 2 cohorts independents (8). Vam confirmar que APRIL estava elevat en pacients amb IgAN a la cohort actual (mediana 1,98 vs. 1,55; IQR 1,75, {{10}},38; P <0,01). A més, vam observar una correlació positiva entre els nivells sèrics d'APRIL i la proteinúria (ρ=0.28 de Spearman, P=0.01). Com en el nostre estudi anterior, no vam observar diferències en els nivells sèrics de BAFF.

APRIL s'uneix a TACI, un receptor de TNF que promou un canvi de classe a IgA (10). TACI també és estimulat per multimers d'ordre superior de BAFF, i la sobreexpressió de BAFF en ratolins transgènics BAFF (BAFF-Tg) és suficient per estimular TACI, imitant així un senyal APRIL/TACI (11). És important destacar que, a mesura que envelleixen, els ratolins BAFF Tg presenten una malaltia semblant a IgAN caracteritzada per IgA subglicosilada al sèrum, deposició d'IgA al ronyó, proteinúria elevada i patologia renal (8). Prèviament vam demostrar que la microbiota és un cofactor essencial que promou la deposició de complexos immunitaris IgA als ronyons de BAFF sobre els ratolins BAFF-Tg de pressió (8). Això implica que una interacció hoste-microbioma pot tenir un paper en l'etiologia de l'IgAN, almenys en ratolins. Tanmateix, en els nostres estudis anteriors, no vam avaluar si candidats microbians específics podrien accelerar la patogènesi de la malaltia semblant a IgAN en ratolins BAFF-Tg.

Per tant, a continuació vam explorar la possibilitat que es puguin observar respostes immunes esbiaixades per IgA dirigides a Neisseira en ratolins que sobreexpressen BAFF. El nom infecta l'epiteli mitjançant el receptor CEACAM-1. Com que Name s'unirà als humans però no al ratolí CEACAM-1 hem creuat ratolins BAFF-Tg amb ratolins que expressen la forma humana de CEACAM-1 (hC-Tg) per generar ratolins transgènics dobles (B × hC- Tg). Els ratolins transgènics i els seus controls de camarada es van infectar nasalment amb Nme, i posteriorment es van recollir sèrums i rentats nasals per analitzar-los. Tal com es mostra a la figura 3A, tot i que els ratolins hC-Tgneg (WT) no van ser colionitzats de manera apreciable per Nme, hC-Tg i B × hC-Tg van mostrar taxes similars de colonització de Nme (80% enfront del 100%, P {{{ 15}} NS) i càrregues bacterianes similars (192,9 vs. 116,7, P=NS) als 5 dies després de la infecció. Aquestes dades indiquen que els ratolins B × hC-Tg no tenien taxes alterades de colonització de Nme en comparació amb els ratolins WT.

Anteriorment hem demostrat que es necessiten 2 infeccions nasals per induir immunitat contra una tercera infecció nasal posterior en ratolins hC-Tg (12). Per determinar si els ratolins B × hC-Tg presentaven una millora de l'eliminació de Nme en comparació amb els controls de hC-Tg, vam infectar nasalment ratolins dues vegades, els dies 1 i 14. A les 24 hores després de la infecció secundària, la taxa d'infecció dels ratolins hC-Tg i Els ratolins B × hC-Tg van ser similars (85% vs. 80%), demostrant una manca d'immunitat neutralitzant induïda per 1 exposició prèvia de Nme (figura 3B). Això implica que la sobreexpressió de BAFF no va eliminar la necessitat de 2 infeccions per induir la protecció contra la colonització al nostre model de ratolí.

Atès que no hi havia cap impacte evident de la sobreexpressió de BAFF en la susceptibilitat nasal a Nme, vam analitzar la resposta d'anticossos del ratolí a la colonització de Nme. Primer, vam avaluar la resposta local d'IgA i IgG a Nme. La IgG específica de Nme nasal, tal com es va avaluar en el líquid de rentat nasofarínge, no es va detectar en cap ratolí, i els títols nasals d'IgA anti-Nme eren similars tant per als ratolins B × hC-Tg com per a hC-Tg (figura 3C). A continuació estem mesurant la resposta d'anticossos sistèmics a la infecció per Nme. Després de la segona infecció nasal, tant els ratolins hC-Tg com els B × hC-Tg van mostrar una resposta IgG específica de Nme en sèrum per sobre de la línia de base, amb els ratolins hC-Tg que presentaven un títol mitjà d'IgG anti-Nme 2- vegades més gran que que en els ratolins B × hC-Tg (164 ng/mL vs. 54,6 ng/mL) (Figura 3D). En canvi, els ratolins B × hC-Tg van mostrar un títol mitjà d'IgA anti-Nme al sèrum que era 10- vegades més gran que en els controls hC-Tg (321,7 ng/mL enfront de 33,09 ng/mL) (Figura 3E) . En conjunt, els nostres resultats van demostrar que, mentre que la resposta local d'IgA a Nme era comparable entre els ratolins hC-Tg i B × hC-Tg, la resposta immune humoral sistèmica a l'exposició nasal a Nme estava esbiaixada per IgA en ratolins B × hC-Tg (figura 3F).

Efecte de la colonització de Nme sobre IgA als ronyons de ratolins BAFF-Tg. Atès que els nivells sistèmics d'IgA específics de Nme es van elevar significativament als ratolins BAFF-Tg, vam plantejar la hipòtesi que una combinació del transgen BAFF i la infecció per Nme podria accelerar la patologia renal en comparació amb els ratolins BAFF-Tg no infectats. Per tant, es va avaluar l'expansió mesangial glomerular tenyint seccions de ronyó amb àcid periòdic-Schiff (PAS). Utilitzant una puntuació semicuantitativa d'expansió mesangial, vam observar una tendència no significativa cap a una major expansió mesangial en els ratolins B × hC-Tg (figura 4, A i B).

A continuació, vam examinar l'impacte de la infecció per Nme en la deposició d'IgA al ronyó, el distintiu diagnòstic d'IgAN. Mitjançant la immunohistoquímica, no es va detectar la deposició d'IgG mesangial en cap ratolí (dades no mostrades). A més, no vam observar IgA mesangial als ronyons de ratolins WT o hC-Tg. En canvi, els ratolins B × hC-Tg i BAFF-Tg van mostrar deposició d'IgA a zones d'expansió mesangial PAS + (secció representativa de la figura 4C). Per a una anàlisi més quantitativa, es va avaluar l'expressió de l'ARNm que codifica la forma d'empalmament secretada d'IgA mitjançant PCR quantitativa als ronyons de tots els grups de ratolins (figura 4D). Hi va haver una diferència significativa en l'expressió de la forma d'empalmament secretada d'IgA entre grups (Kruskal-Wallis 1-via ANOVA, P=0.01), amb ratolins transgènics dobles (B). × hC-Tg) demostrant nivells significativament més alts d'expressió d'IgA en comparació amb altres grups experimentals (la prova de comparació múltiple de Dunn va ajustar P <0, 05 per a totes les comparacions). Aquests resultats van mostrar que la colonització de ratolins BAFF-Tg amb Nme va donar lloc a una expressió augmentada d'IgA dins del propi ronyó.

Després d'haver descobert recentment que les cèl·lules secretores d'IgA derivades de la mucosa migren al teixit cerebral en ratolins amb encefalitis experimental (2), vam plantejar la hipòtesi que l'expressió intrarrenal de l'ARNm d'IgA podria reflectir la presència de cèl·lules productores d'IgA anticommensals que han migrat des del lloc de exposició inicial al patobiont. Per tant, vam dissenyar un assaig ELISPOT personalitzat per detectar cèl·lules secretores d'anticossos específiques de Nme. Les plaques ELISPOT d'alta afinitat es van recobrir amb Nme mort per calor i es van incubar amb una suspensió unicel·lular de cèl·lules immunitàries derivades del ronyó dels nostres ratolins experimentals; Posteriorment es van afegir anticossos de detecció d'IgA conjugats amb HRP. Vam descobrir que es van identificar cèl·lules secretores d'IgA específiques de Nme al parènquima renal de ratolins infectats per Nme, principalment en l'entorn d'augment dels nivells de BAFF (ratolins B × hC-Tg, figura 5).

Figure 1. Tonsil microbiota. (A) The most abundant genus (>2 × l'abundància relativa del següent gènere més abundant) en els hisops d'amígdales en pacients amb IgAN va ser Neisseria. Cada color representa un gènere individual, i l'eix y indica la proporció de mostres amb aquest gènere com l'organisme més abundant (χ2, P=0.18). (B) L'abundància relativa del gènere Neisseria va ser significativament més alta en IgAN en comparació amb els individus de control sans coincidents amb la llar (2-test t sense ajustar P=0.002).