L'espectrometria de masses en tàndem d'alta resolució identifica un patró de gangliòsids particular en pacients amb malaltia renal diabètica precoç de pacients amb diabetis mellitus tipus 2

Resum:

Tenint en compte la valuosa informació que proporcionen els glicoesfingolípids commarcadors molecularsi les limitades dades disponibles per a la seva detecció i caracterització en pacients que la pateixenMalaltia renal diabètica tipus 2(DKD), hem desenvolupat i implementat un mètode superior basat en espectrometria de masses (MS) d'alta resolució (HR) i MS en tàndem (MS/MS) per a la determinació de gangliòsids a l'orina dePacients DKD. Aquest estudi es va centrar en: (i) provar la viabilitat i el rendiment de la HR MS i MS/MS en el mapeig iseqüenciació de gangliòsids renals en DM tipus 2pacients; (ii) determinació dels canvis en elgangliòsid d'orina de DKDpacients adiferents estadis de la malaltia-normo-, micro- i macroalbuminúria-en un assaig comparatiu amb controls sans. A causa de l'alta resolució i la precisió de la massa, el cribratge comparatiu de MS va revelar que l'estat de sialilació dels components dels gangliòsids; la seva modificació per O-acetil, CH3COO−, O-fucosil i O-GalNAc; així com la composició de la ceramida representen possibles marcadors per a la detecció precoç de DKD, l'avaluació de la progressió de la malaltia i el tractament de seguiment. A més, la investigació estructural de MS/MS va demostrar que GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18:0) i GT1b(d18:1/18:{{ 23}}) els isòmers s'associen amb la macroalbuminúria, la qual cosa mereix una investigació addicional en relació amb el seu paper en la DKD.

Paraules clau: nanoelectrospray; espectrometria de masses en tàndem d'alta resolució; projecció; anàlisi de fragmentació; malaltia renal diabètica; biomarcadors de gangliòsids

1. Introducció

La diabetis mellitus tipus 2 (DM) continua sent un repte terapèutic amb una prevalença global en constant augment, malgrat els avenços científics en aquest camp. Associat a danys macrovasculars i microvasculars devastadors a llarg termini, la DM tipus 2 condueix a un augment de la mortalitat. La malaltia renal diabètica (DKD) és la causa més freqüent de malaltia renal en fase terminal (ESRD) als països desenvolupats i en desenvolupament [1,2]. Així, la detecció precoç de la DKD i la gestió òptima de la DM tipus 2 són crucials per reduir les complicacions, la morbiditat i la mortalitat. Actualment, el diagnòstic i la progressió de la DKD es basa en la mesura de l'albuminúria i la reducció constant de la taxa de filtració glomerular (eGFR), ambdós paràmetres que mostren una predicció modesta de l'estat renal futur. La història natural de la DKD inclou diverses etapes clíniques, incloent-hi les següents: hiperfiltració glomerular precoç, aparició de microalbuminúria o macroalbuminúria, disminució de la taxa de filtració glomerular i ESRD. Tanmateix, investigacions recents consideren que l'albuminúria és un marcador de deteriorament de la condició [3].

En l'última dècada, s'ha mostrat un interès particular en el concepte subtelocèntric, segons el qual el túbul proximal i el compartiment tubulointersticial podrien tenir un paper essencial en l'inici i la progressió de la DKD [4–6]. En aquest context, el desenvolupament de biomarcadors glicòmics pronòstics i predictius està guanyant una atenció creixent i s'ha convertit en el focus de molts grups de recerca al llarg dels anys [7–11].

Els gangliòsids representen una classe particular de glicoesfingolípids amb una estructura complexa identificada en tots els teixits i fluids corporals i especialment abundant al sistema nerviós central (SNC) [12]. Com a constituents essencials de les membranes de la bicapa cel·lular neuronal, els gangliòsids tenen un paper vital en el desenvolupament, la maduració i l'envelliment del cervell, mediant l'adhesió cel·lular, l'activació, la proliferació, la motilitat i el creixement. Els gangliòsids consisteixen en una ceramida de composició diferent respecte a la base esfingoide, residus d'àcids grassos arrelats a la capa externa de la membrana i una cadena d'oligosacàrids sialilats que cobreix la membrana i que participen en interaccions específiques i essencials amb altres molècules de l'entorn. Mitjançant la rotació normal de la superfície cel·lular, coneguda com a "eliminació de la superfície cel·lular", els gangliòsids s'alliberen, fins a cert punt, a l'espai intercel·lular.

Com que se sap que l'expressió, la distribució i l'estructura dels gangliòsids són específiques de cèl·lules i teixits i que varien durant el desenvolupament, la maduració, l'envelliment i, sobretot, en estats patològics [12], els gangliòsids es consideren entre els més valuosos. marcadors diagnòstics i agents terapèutics prospectius.

S'han aplicat diversos mètodes que utilitzen fragments de biòpsia de sèrum o ronyó per a la identificació de gangliòsids renals en pacients amb DM tipus 2, com ara la immunocoloració de capa fina [7,8], la cromatografia de capa fina d'alt rendiment (HPTLC) [9], l'espectrofotometria [10] ] i espectrometria de masses (MS) [11].

Tenint en compte la valuosa informació que poden proporcionar els gangliòsids com a marcadors moleculars del teixit neuronal [12] i les dades limitades disponibles fins ara en la detecció i caracterització de glicoesfingolípids a l'orina de pacients amb DKD, hem desenvolupat i implementat un mètode superior basat en sobre nanoelectrospray (nanoESI) MS d'alta resolució (HR) per a la determinació de gangliòsids a l'orina de pacients amb DM. Aquesta opció per a HR MS es va guiar pels avantatges que ofereix aquest mètode en l'anàlisi de les mescles complexes de gangliòsids extrets de l'orina humana. L'elevat poder de resolució de l'instrument: (i) permet la detecció d'ions de valors m/z propers, que d'altra manera no es podrien discriminar en una mostra multicomponent heterogènia que conté espècies de diverses longituds i arquitectures de la cadena de glicans i composicions diferents del ceramida; (ii) elimina bàsicament la necessitat de separar la mescla mitjançant mètodes cromatogràfics líquids o electroforètics abans de l'anàlisi de MS; (iii) proporciona una alta precisió de massa, que augmenta considerablement la fiabilitat de la identificació estructural; i (iv) ofereix no només una millor visió de la complexitat del gangliosidoma associat a la DM, sinó també dades sobre les espècies amb un paper potencial biomarcador basat en l'alta confiança en la determinació de massa tant per als ions moleculars com per als fragments.

Aquest estudi pilot, amb l'objectiu de caracteritzar gangliòsids d'orina amb papers biomarcadors en eldiagnòstic precoç de DKD, es va centrar a: (a) provar la viabilitat i el rendiment de HR MS i tàndem MS (MS/MS) mitjançant la dissociació induïda per col·lisions d'alta energia (HCD) en el mapeig de gangliòsids renals en pacients amb DM tipus 2; (b) determinació dels canvis en l'expressió de barreges de gangliòsids nadius de les mostres d'orina de pacients amb DM tipus 2 en un assaig comparatiu amb controls sans i caracterització dels biomarcadors descoberts. Amb aquesta finalitat, vam optimitzar una plataforma bioanalítica moderna basada en nanoESI HR MS en un instrument Orbitrap ajustat per funcionar en mode d'ions negatius tant en el cribratge MS com en la fragmentació MS/MS per a una anàlisi estructural detallada.

2. Resultats i discussions

2.1. Cribratge comparatiu de les mostres per nanoESI HR MS

Les mostres de gangliòsids A1, A2, A3 i C van ser infusionades per nanoESI una darrere l'altra en un Orbitrap MS i es van examinar en mode d'ions negatius en idèntiques condicions instrumentals. En cada cas, el senyal de corrent iònic total (TIC) es va adquirir durant 2 min, generant espectres a partir de l'acumulació de 100 exploracions. A causa de l'alta sensibilitat del mètode, fins i tot en les condicions de temps emprades, els espectres de masses adquirits presentaven una alta relació senyal-soroll i un ric patró d'ions moleculars.

L'avaluació de les dades de cartografia generades en les mateixes condicions va revelar diferències significatives en el nombre i el tipus de components de gangliòsids expressats a les mostres A1, A3 i C, mentre que no es van observar diferències entre les mostres A1 i A2. Aquests resultats es resumeixen a la Taula 1, que enumera comparativament les estructures identificades a les mescles natives A1, A3 i C, juntament amb els valors experimentals de m/zexp dels senyals detectats i els valors teòrics de m/zteor corresponents a les estructures proposades.

L'alta resolució i la precisió de massa de la plataforma MS emprada va millorar la discriminació i la identificació basada en mesures precises de massa de no menys de 37 components diferents de gangliòsids i fucogangliosids d'orina a les tres mostres. Les espècies descobertes pertanyen a 15 classes diferents, incloses les modificacions de la cadena principal de glicans (taula 2), i se'ls va assignar una excel·lent precisió de massa mitjana de 4 ppm.

Una avaluació detallada de les estructures de la taula 1 va revelar que, de totes les mostres, la barreja A3, que correspon a la macroalbuminúria (per tant, a una etapa avançada de DKD), conté el nombre més alt de compostos gangliòsids diferents, és a dir, 19, seguida de la mostra C, amb 12 espècies diferents, i la mostra A1, amb 10.

En comparació amb les mostres A1 i C, A3 també: (i) inclou el nombre més elevat d'espècies amb la cadena O-glican més llarga pertanyent a la classe G1 i la diversitat més destacada de composicions de ceramida; (ii) presenta el nombre més alt de classes de gangliòsids expressades-12 classes enfront de només 6 a la mostra A1 i 6 a la mostra C, respectivament; (iii) conté el major nombre de gangliòsids, que presenten un nucli de sacàrid alterat per O-acetil no carbohidrat, així com modificacions biològicament rellevants d'O-fucosil i O-GalNAc de carbohidrats; (iv) és l'únic extracte urinari que conté estructures de gangliòsids modificades per la fixació d'O-GalNAc, és a dir, GalNAc-GS1 (t18:1/18:0), detectat com una molècula de quatre capes desprotonada i sodiada a m/z 1176,8266 , i GalNAc-GQ1(d18:1/18:0), com a molècula doblement desprotonada a m/z 1310.1271. Com és visible a la figura 1a-c, que mostra la proporció de les classes de gangliòsids expressades a les tres mostres, i a l'histograma comparatiu que es mostra a la figura 2, l'extracte A3 mostra un estat de sialilació particular, dominat per polisialocompostos. Excepte la gangliotetraosa monosialilada GM1 (d18:1/16:1) detectada com a [M-2H+] 2− a m/z 756,9{078 i la GM3 monosialilada (d18:0/24: 0) detectada com una molècula doblement desprotonada a m/z 645,3956, les altres 17 espècies contenen més d'un residu de Neu5Ac a la seva part de glicà. A més, com que es van descobrir no menys de set trisialo GT1, quatre pentasialo GQ1 i fins i tot un GS1 heptasialilat, òbviament, al costat del nombre augmentat i la diversitat d'estructures, la longitud dels nuclis de glicà i les seves modificacions perifèriques, l'alta sialilació global. contingut representa una altra característica específica de la macroalbuminúria.

Taula 1. Les espècies de gangliòsids es van identificar en mostres A1, A3 i C mitjançant el cribratge (-) nanoESI Orbitrap MS. d: base esfingoide dihidroxilada; t: base esfingoide trihidroxilada.

També sorgeix una observació clínicament rellevant de l'assaig comparatiu A1 vs. C. Mentre que a la mostra de control, C, el grau de sialilació més alt dels gangliòsids detectats és de quatre, identificats mitjançant dues gangliotetraosa tetrasialilada GQ1 que difereixen en la composició de la seva aglicona lipídica, a la mostra A1, el grau de sialilació més alt és de quatre. Al costat dels gangliòsids di-, tri- i tetrasialilats, la barreja A1 conté una pentasialo gangliotetraosa GP1(d18:1/18:0), detectada com a ió [M{{-4H+ ] 4− a m/z 676,5569, a la qual se li va assignar l'excel·lent precisió de massa de 2,95 ppm. Aquestes dades relacionades amb l'estat de sialilació de les mostres investigades mostren que el grau de sialilació dels gangliòsids renals segueix el tret C < A1 < A2=A3, una observació que emfatitza la precocitat d'aquestes modificacions, fins i tot en l'etapa de normoalbuminúria de Pacients amb DM tipus 2. El grau de sialilació augmenta amb la progressió de la malaltia, fet que el converteix en un paràmetre molecular a tenir en compte no només per a la detecció precoç de DKD sinó també per a l'avaluació deProgressió DKDieficàcia del tractament.

Taula 2. Vista tabulada de les classes de gangliòsids d'orina identificades juntament amb la seva expressió diferencial en mostres A1, A3 i C. Símbols: x=la classe s'ha detectat; -=la classe no s'ha detectat.

Una inspecció detallada de la constitució de l'aglicon revela que, llevat de les marcades diferències en la composició de la cadena de glicans, els gangliòsids expressats a les tres mostres també presenten diferències en l'estructura de les seves ceramides. Les alteracions més evidents de la part lipídica estan relacionades amb el procés menys comú de trihidroxilació de bases esfingoides, que es produeix a les mescles de gangliòsids A1 i A3, i la longitud inusual de les cadenes d'àcids grassos, presents únicament en A3. Es va trobar que cadascuna de les mostres A1 i A3 contenia dues espècies amb bases esfingoides trihidroxilades de la ceramida. Per tant, GT1(t18:0/18:0) i GT1(t18:0/2{0:0) es van descobrir a la mostra A1, mentre que la més Es van trobar estructures complexes GT1 (t18:1/24:3) i Fuc-GT3 (t18:1/18:3) trihidroxiladas a la mostra A3.

Notablement, la mostra A3 també mostra evidències d'espècies que contenen àcids grassos de cadena molt llarga (VLCFA). Un VLCFA es considera una estructura de lípids poc freqüents que inclou de 23 a 27 àtoms de carboni a la cadena d'àcids grassos. Es van detectar quatre espècies inusuals de VLCFA que porten 24 àtoms de carboni a la cadena d'àcids grassos a la mostra A3: GM3(d18:0/24:{{10}}), GT1(t18:1). /24:3), O-Ac GT1(d18:0/24:0) i Fuc-GT1(d18:0/24:0), dels quals una estructura també presenta la poc comuna trihidroxilació de bases esfingoides i tres enllaços dobles a la cadena d'àcids grassos, mentre que dues estructures presenten enllaços al nucli de glicà del grup O-Ac i del grup fucosil, respectivament.

Aquestes característiques de les porcions de ceramida en les mostres A1 i A3, que no es van trobar a la mostra control; les similituds entre l'A1 i l'A2; i les notables diferències detectades a l'A3 suggereixen que, al costat de la composició en carbohidrats i l'estat de sialilació, l'estructura de la part lipídica en gangliòsids renals és un altre possible marcador de DKD precoç. A més, les modificacions en la composició de la ceramida sembla que depenen de les etapes de l'albuminúria; Les ceramides complexes, que presenten trihidroxilació de la base esfingoide i VLCFA semblen estar relacionades amb les etapes avançades d'albuminúria. Tenint en compte que el nombre poc comú de tres dobles enllaços a la cadena d'àcids grassos només es va trobar a la mostra A3 mitjançant dues espècies diferents, Fuc-GT3(t18:1/18:3) i GT1(t18:1/24:3), aparentment, el mecanisme de formació de doble enllaç també està relacionat amb la progressió de la DKD.

Els efectes negatius que exerceix l'acumulació de lípids dins del ronyó, tant a nivell glomerular com tubular, són específics de la cèl·lula. A més, la lipotoxicitat està associada a diversos tipus de lípids, entre els quals els gangliòsids tenen un paper central [13].

El contingut renal dels gangliòsids, entre altres classes de lípids, va augmentar dins dels podòcits, així com de les cèl·lules del túbul proximal, en un model de ratolí DN [14]. Els túbuls proximals poden estar exposats a nivells elevats de lípids urinaris, inclosos els gangliòsids, a causa de l'augment del contingut d'àcids grassos per molècula d'albúmina al començament de la DKD [15]. Les conseqüències directes de l'acumulació de lípids dins dels segments de la nefrona estan relacionades amb modificacions estructurals i funcionals, que condueixen a un processament deteriorat de l'albúmina al començament de la DM tipus 2.

La gran majoria dels estudis que se centren en la caracterització dels gangliòsids renals es basen en models experimentals de nefropatia diabètica. Segons el nostre coneixement, aquest és el primer estudi translacional humà des de la investigació bàsica fins a l'aplicabilitat clínica per informar sobre un patró de gangliòsids urinaris particular en pacients amb DM tipus 2. La importància pràctica del nostre estudi està en la demostració d'una associació del grau de sialilació dels gangliòsids urinaris i l'estructura de les seves ceràmides amb DKD precoç, escenificada pel nivell d'albumínúria.

Servei de suport de Wecistanche: el major exportador de cistanche a la Xina:

Correu electrònic:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Compreu per obtenir més detalls de les especificacions:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

ACONSEGUIR EXTRACTE DE CISTANCHE ORGANIC NATURAL AMB 25% ECHINACOSIDE I 9% ACTEOSIDE PER A LA INFECCIÓ RENOLÓ