L'espectrometria de masses en tàndem d'alta resolució identifica un patró de gangliòsids particular en pacients amb malaltia renal diabètica precoç de pacients amb diabetis mellitus tipus 2 Ⅱ

2.2. Anàlisi estructural detallada d'espècies polisialilades associades a macroalbuminúria per HCD MS/MS

El cribratge HR-MS va demostrar que el gangliòsid dels pacients macroalbuminúrics es caracteritza per un contingut global elevat d'àcid siàlic. Es van identificar no menys de quatre gangliotetraoses pentasialo de la classe GQ1 a la mostra A3 amb una gran precisió de massa. L'ió a m/z 812,7{{10}}68, detectat només a l'espectre de masses de cribratge d'A3, es va assignar, segons el càlcul de masses, al GQ1 triple desprotonat i sodiat (d18:1/18). :0). Per tal de caracteritzar estructuralment aquesta espècie associada a la macroalbuminúria en detall, vam aïllar l'ió a m/z 812,7068 i el vam enviar a HCD MS/MS a HR en mode d'ions negatius. Els objectius d'aquest experiment d'EM en tàndem van ser: (i) la investigació de l'estructura de la cadena d'oligosacàrids; (ii) la confirmació de la composició de la ceramida, que es va postular tenint en compte la massa de totes les molècules GQ1; (iii) recollir dades específiques sobre la localització dels monosacàrids Neu5Ac al llarg de la columna vertebral de l'oligosacàrid, donant lloc a la discriminació d'isòmers de les cinc estructures GQ1 (d18:1/18:0) més comunes (figura 3) que podrien estar presents a l'orina de pacients macroalbuminúrics.

Es representa l'espectre de fragmentació de l'ió precursor [M{-4H+Na]3− detectat a m/z 812.7068, generat combinant el TIC adquirit durant dos minuts amb energia de col·lisió variable dins d'un rang de 30-80 eV. a la figura 4.

Figura 3. Els cinc isòmers més comuns de GQ1(d18:1/18:0): (A) GQ1a(d18:1/18:{{10}}) isòmer; (B) GQ1b(d18:1/18:{{20}}) isòmer; (C) GQ1c(d18:1/18:0)isòmer; (D) isòmer GQ1d(d18:1/18:0); (E) isòmer GQ1e(d18:1/18:0).

Servei de suport de Wecistanche: el major exportador de cistanche a la Xina:

Correu electrònic:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Compreu per obtenir més detalls de les especificacions:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

FEU CLIC AQUÍ PER OBTENIR EXTRACTE DE CISTANX ORGÀNIC NATURAL AMB 25% ECHINACOSIDE I 9% ACTEOSIDE PER A LA INFECCIÓ RENOLÓS

Les dades MS/MS validen la composició (d18:1/18:0) de la ceramida per Y0 a m/z 564,8704 i Y1 a m/z 726,5845 corresponent a la seqüència Glc-Cer, així com a l'ió d'escissió interna, S, a m/z 325,1828 corresponent a l'àcid gras C18: 0 (figura 5). Així mateix, també es documenta l'estat global de sialilació de la molècula. Per tant, per l'ió B1 detectat a m/z 290,0868 i el seu homòleg sodiat a m/z 312,0686 corresponent al despreniment d'un residu Neu5Ac de l'ió progenitor, juntament amb l'element distal detectat a m/z 581,1807 i m/z 603,162 , confirmeu l'aparició de l'enllaç Neu5Ac-Neu5Ac.

Figura 5. Esquema de la fragmentació per HCD MS/MS experimentada pel precursor [M{-4H{++Na+ ] 3− a m/z 812.7068 i la seqüència d'ions diagnòstic per a l'isòmer estructural GQ1d.

Tenint en compte la posició d'enllaç més comuna dels residus de Neu5Ac a la gal interna o externa, hi ha cinc possibles candidats estructurals per a GQ1 (d18:1/18:0), tal com es mostra a la figura 3. Tanmateix, l'ió a m/z 1032,3662 format per un doble enllaç i clivages d'anells creuats interns i assignat a Z4 /Y{0/ 2,4A2 , juntament amb l'ió detectat a m/z 936,7894 com a Y2 / 3,5A1, admet la unió dels quatre residus de Neu5Ac al Gal interior. Tot i que la incidència d'altres isòmers estructurals no es pot excloure completament, aquests dos ions fragments demostren que el motiu estructural és coherent amb el candidat (D), que correspon a l'isòmer d de GQ1 (d18:1/18:0) , està definitivament present a la mostra A3. L'esquema de la figura 5 representa la via de fragmentació experimentada per l'ió precursor corresponent a GQ1d (d18:1/18:0).

El següent candidat polisiàlic associat a la macroalbuminúria per a una anàlisi estructural detallada és l'ió [M-3H+] 3− detectat únicament a l'espectre de masses de cribratge de la mostra A3 a m/z 708,3379 i assignat, sobre la base del càlcul de massa exacta, a GT1 (d18:1/18:0). Aquest ió es va aïllar i es va sotmetre a l'anàlisi de fragmentació mitjançant MS en tàndem mitjançant HCD. L'espectre d'ions de producte generat sumant exploracions adquirides durant 2 min a energies de col·lisió variables entre 30 i 80 eV es presenta a la figura 6, juntament amb l'estructura química d'aquesta espècie i l'assignació dels principals senyals. El mecanisme de fragmentació en les condicions MS/MS emprades, juntament amb els ions del fragment de diagnòstic, es mostra a la figura 7. Per millorar la visibilitat de tots els ions de producte assignats, la taula 3 complementa la llista de senyals identificats en l'espectre que es presenta a la figura 6.

Figura 6. Anàlisi estructural per (-) nanoESI HR HCD MS/MS de l'ió precursor [M-3H+ ] 3− detectat a la mostra A3 a m/z 708,3379, que, segons al càlcul de massa, correspon a GT1(d18:1/18:0). Temps d'adquisició: 2 min; energies de col·lisió variables entre 30 i 80 eV. Inserció: l'estructura de l'isòmer GT1b(d18:1/18:0) deduïda a partir de les dades MS/MS.

La fragmentació de l'HCD va donar lloc a diversos ions de seqüència, que es van produir com a resultat d'enllaços glicosídics i d'escissió d'anells creuats. Aquests ions són molt útils per a l'assignació de tota la seqüència d'hidrats de carboni, amb la identificació d'isòmers posicionals GT1 i per a la confirmació de la composició de la ceramida aglicona.

El tipus de ceramida d18:1/18:0 es revela per l'ió Y0 a m/z 564,5353 i recolzat per la seqüència Glc-Cer identificada a través de l'Y1 a m/z 726,5879. A més, l'assignació d'ions evidencia la presència d'una isoforma GT1. L'ió a m/z 493,1669, amb una composició NeuAc-GalNAc, pot ocórrer exclusivament a partir de GT1, que es caracteritza per la sialilació del residu GalNAc. La resta d'ions fragments suggereixen l'existència de l'isòmer estructural GT1b a la mostra A3. L'estructura del GT1b està suportada per tots els ions que sorgeixen de l'extrem no reductor de la molècula, documentats per la sèrie de tipus Y, acompanyats de dos ions Z, dels quals un apareix en menor abundància (figura 6). Tanmateix, el Y2 / B2 detectat com un ió d'abundància justa a m/z 888,6405 dóna evidència sobre la seqüència Gal–Glc–Cer, possiblement provinent de l'isòmer GT1a o GT1b després de la desialilació respectiva per part de Neu5Ac o Neu5Ac-Neu5Ac. el Gal interior o d'un isòmer que conté un Gal interior no substituït, com ara el GT1d.

D'altra banda, Y2 detectat a m/z 734,5701 corrobora la localització de l'element disialo Neu5AcNeu5Ac al Gal interior, una configuració coherent amb l'isòmer GT1b. La presència del grup distal també s'evidencia amb l'ió B2 a m/z 581,1828.

A l'HCD MS/MS, diversos senyals estan relacionats amb la desialilació parcial de la molècula, com els ions Y4 i/o Y3 corresponents a la seqüència desialilada Gg4Cer; tanmateix, aquests ions no poden indicar els llocs d'unió de Neu5Ac al nucli de glicà Gg4 neutre. A més, el senyal a m/z 364,1243 corresponent a la seqüència Gal-GalNAc assignada a l'ió B3 / B1 de clivage intern GT1b és atribuïble a l'isòmer GT1c perquè aquesta glicoforma conté un disacàrid Gal-GalNAc terminal no substituït. Per tant, excepte l'Y2, que està associat al GT1b, tots els ions podrien sorgir d'altres isòmers posicionals Neu5Ac, com ara GT1a, GT1, GT1c, o fins i tot el GT1d rarament informat. D'altra banda, el mateix Y2 podria ser el resultat d'un esdeveniment de baixa probabilitat, que també va eliminar el Neu5Ac de l'element de proves vinculat al Gal interior.

Atès que, llevat de revelar GT1, les dades de MS/MS relacionades amb les ruptures d'enllaç glicosídic no van poder assignar sense ambigüitats altres isòmers GT1 a la barreja A3, vam analitzar amb més atenció els ions d'escissió de l'anell per descobrir una possible fragmentació interna que suporta GT1b. Hem observat l'ió de càrrega triple de baixa intensitat a m/z 634,6067, que és coherent amb el tipus 0,2 de clivatge d'anells creuats en un dels residus terminals d'àcid siàlic, que, en el cas de l'espècie GT1b, pot ocórrer a partir de 0, 2X4 o 0,2X3 o ambdues. Com que l'isòmer GT1b és generalment més comú que GT1, les figures 6 i 7 presenten l'assignació d'ions i l'esquema de fragmentació específic de GT1b.

A causa de la simetria de la cadena Gal-GalNAc-Gal, no hi ha possibilitat de descartar completament altres isòmers estructurals. Tot i que les dades de l'HCD MS/MS demostren l'existència de GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18:0) i GT1b(d18:1/18: 0) a la mostra A3, no es pot excloure la possible aparició d'altres isòmers GQ1 i GT1. Tanmateix, els nostres resultats indiquen que tres isòmers-GQ1d (d18:1/18:0), GT1b (d18:1/18:{{30}}) i GT1 (d18:1 /18:0) estan definitivament presents a la mostra A3 i es poden estudiar més com a marcadors moleculars de macroalbuminúria.

3. Materials i Mètodes

3.1. Criteris de matrícula de l'assignatura

Per tal de desenvolupar i validar el mètode, es va avaluar una cohort de cribratge de pacients amb DM tipus 2 i subjectes de control sans en un estudi pilot transversal. Un total de 30 pacients amb DM tipus 2 que assistien al Servei Ambulatori de Nefrologia i al Servei Ambulatori de Diabetis i Malalties Metabòliques es van dividir en 3 grups segonsalbúmina d'orina/proporció de creatinina(UACR) de la següent manera: 10 pacients amb normoalbuminúria (A1, definida com UACR < 30 mg/g), 10 amb microalbuminúria (A2, UACR 30–300 mg/g) i 10 amb macroalbuminúria (A3, UACR > 300 mg/g) g). També es van inscriure en aquest estudi deu subjectes de control sans (C) coincidents per edat i sexe que assistien a un consultori de metge de capçalera per a revisions rutinàries sense antecedents coneguts de malalties renals i sense DM (exclosos per un valor d'HbA1c inferior o igual al 5,6%). estudiar

Tots els pacients inclosos a l'estudi tenien una durada mínima de 5-anys de DM, funció renal estable durant almenys 2 anys, bon control de la pressió arterial (<130/80 mmHg), negative urinary sediment, and a negative urine culture. The exclusion criteria were represented by other causes of proteinuria (other glomerular diseases, neoplasia, or autoimmune diseases), hematuria, poor control of DM (HbA1c > 10%), liver diseases, and pregnant or lactating women. The patients had no indication for biòpsia de ronyó(manca d'hematúria i d'altres causes de proteinúria, no hi ha una disminució ràpida de la GFR).

3.2. Declaració Ètica

L'estudi es va dur a terme d'acord amb la Declaració d'Hèlsinki, i el protocol va ser aprovat pel Comitè d'Ètica en Recerca de la Institució (Consell d'Estudis Humans-Universitat de Medicina i Farmàcia "Victor Babes" de Timisoara, Nr. 15/12.09.2016). Hospital d'Urgències del Comtat, núm. 100/23.11.2016). Tots els pacients i controls van acceptar participar en l'estudi signant un formulari de consentiment informat.

3.3. Avaluacions de laboratori

El gangliòsid d'orina de 30 pacients amb DM tipus 2 es va investigar en un estudi pilot transversal mitjançant un assaig comparatiu amb 10 controls sans. Paràmetres bioquímics referits a urea sèrica i creatinina, proteinúria de 24 h, UACR, sediment d'orina i cultiu d'orina. Tots els pacients van ser negatius per a infeccions urinàries. La composició de les barreges de gangliòsids nadius es va detectar a partir de mostres d'orina recollides durant 24 h. Les mostres d'orina dels pacients i controls es van emmagatzemar a curt termini a -20 ◦ C i es van descongelar abans de l'assaig.CKDes va definir segons la directriu KDIGO per a l'avaluació igestió de la malaltia renal crònica. L'eGFR es va calcular mitjançant elmalaltia renal crònicafórmula d'equació de col·laboració en epidemiologia (equació de creatinina CKD-EPI 2009) [16].

3.4. Extracció i purificació de gangliòsids

L'extracció de gangliòsids va seguir el mètode desenvolupat per Svennerholm i Fredman [17] i modificat per Vukeli´c et al. [18]. Prèviament vam adaptar aquest protocol per a l'extracció i purificació de gangliòsids dels fluids corporals i l'hem aplicat als gangliòsids del líquid cefaloraquidi (LCR). El mètode es descriu en detall en el nostre estudi anterior relacionat amb l'anàlisi de perfils i fragmentació dels gangliòsids de LCR mitjançant espectrometria de masses [19]. Breument, els lípids es van extreure dues vegades amb una barreja de cloroform (C)/metanol (M)/aigua (W) amb una relació de volum total d'1:2:0,75 C/M/W, amb "W" corresponent. a l'orina; per tant, la barreja contenia 4 ml de C, 8 ml de M i 3 ml de mostra d'orina. El cloroform i el metanol de grau analític es van comprar a Merck (Darmstadt, Alemanya) i es van utilitzar sense més purificació. Després de la separació completa de les fases, seguint els procediments descrits a [19], es va recollir la fase superior que contenia glicoesfingolípids polars.

La purificació dels gangliòsids bruts recollits es va aconseguir en diversos passos [19]: l'eliminació dels complexos de proteïna-sal precipitats, seguida de centrifugació, filtració en gel en una columna Sephadex G-25 (Sigma-Aldrich, Burlington, MA, EUA). ) per eliminar contaminants de baix pes molecular i, finalment, diàlisi durant la nit a 4 ◦C contra aigua. Els gangliòsids es van extreure en condicions idèntiques de totes les alíquotes d'orina, donant les mescles A1 (normoalbuminúria), A2 (microalbuminúria), A3 (macroalbuminúria) i C (control).

3.5. Preparació de mostres per a espectrometria de masses

Els extractes purificats de gangliòsids A1, A2, A3 i C es van evaporar fins a una sequedat completa en un sistema SpeedVac Concentrator SPD 111 V (Savant, Düsseldorf, Alemanya) acoblat a una bomba de buit. Per al cribratge de MS, cada extracte sec es va dissoldre en metanol pur per generar la solució de reserva i es va emmagatzemar a -20 ◦ C. Abans de l'anàlisi de MS, les solucions d'estoc es van centrifugar en una centrífuga model Sigma 2–16 (Sartorius AG, Göttingen, Alemanya). Per a la infusió d'Orbitrap MS, es van obtenir mostres de treball amb una concentració de 5 pmol·µL -1 en metanol pur diluint alíquotes de la solució madre. La concentració de gangliòsids a la solució infusió es va calcular per a un pes molecular mitjà de 2000 g mol-1.

3.6. Espectrometria de masses Orbitrap amb nanoESI

Els experiments de MS es van realitzar en un espectròmetre de masses LTQ Orbitrap Velos Pro™ (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemanya) equipat amb una font nanoES fora de línia ES 259 ​​(Thermo Fisher, Bremen, Alemanya).

L'instrument és un espectròmetre de masses híbrid que combina dos tipus diferents d'analitzadors de masses i que ofereix multitud d'avantatges: alta sensibilitat i precisió, bona qualitat de les dades i velocitat d'anàlisi, potencial per a la detecció de components menors en mescles complexes, baix consum de mostres, i evitar l'examen creuat i el traspàs de mostra a mostra.

El primer analitzador és una trampa d'ions quadripol lineal de doble pressió capaç d'aïllar un ió amb una relació massa-càrrega específica (m/z) i d'activar-lo posant energia cinètica a l'ió amb el m/z específic en ordre. per provocar una dissociació induïda per col·lisions. El segon analitzador és l'Orbitrap, que consta d'un elèctrode exterior cilíndric i un elèctrode interior de canó, atrapant els ions en òrbites circulars al voltant de l'elèctrode interior. Té un excel·lent poder de resolució i ofereix la possibilitat de seqüenciar espècies iòniques complexes en experiments de MS (MSn) en fases múltiples mitjançant tècniques de fragmentació eficients.

Els capil·lars de borosilicat (10 cm de llarg) es van estirar amb un extractor de micropipetes Sutter p{-97 per produir capil·lars d'electrospray amb mides de punta d'10 µm i longituds coniques de 4 mm. Es va introduir un volum de 10 µL de la solució a una concentració de 5 pmol·µL -1 en metanol a la part posterior de l'emissor i es va inserir un cable de platí de 0,25 mm a la solució. Els valors potencials aplicats al fil de platí i al con es van ajustar permanentment per aconseguir una ionització eficient dels components. El procés nanoESI es va iniciar establint els paràmetres instrumentals de la següent manera: tensió nanoESI, 0,80 kV; tensió del con, 40–60 V; temperatura de desolvació, 80 ◦C; Nivell de RF de lents S, 60%. Aquests valors dels paràmetres de MS van millorar la ionització i un ruixat constant i, al mateix temps, van minimitzar la fragmentació a la font del residu làbil de Neu5Ac unit al nucli d'oligosacàrids de la molècula de gangliòsids.

Tots els espectres de masses (MS i MS en tàndem) es van adquirir en mode HR, detecció en mode d'ions negatius i dins del rang 200-2000 m/z. Les exploracions MS es van adquirir amb la resolució establerta en 60.000. L'espectròmetre de masses va ser operat i controlat per LTQ Tune Plus v2.7 (Thermo Scientific, Bremen, Alemanya), i l'adquisició i processament de dades MS es va aconseguir mitjançant el programari Xcalibur 3.0.63 (Thermo Scientific, Bremen, Alemanya).

Els experiments de MS/MS es van realitzar al LTQ mitjançant CID a la cèl·lula de col·lisió utilitzant heli 5.0 puresa a una pressió de 50 psi com a gas de col·lisió. Les exploracions MS/MS es van adquirir amb una resolució establerta en 20,000. La selecció i fragmentació d'ions es va realitzar manualment. Els ions precursors es van seleccionar dins d'una amplada d'aïllament d'1 m/z unitat i es van fragmentar per HCD mitjançant energies de col·lisió variable dins del rang de 30-80 eV per millorar la cobertura dels ions fragmentats.

Les TIC i els espectres de masses derivats de la combinació de les exploracions acumulades es van processar mitjançant el programari Xcalibur 2.1 (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA), que permet l'extracció dels espectres, així com la seva suavització i resta.

Abans dels experiments, l'escala m/z es va calibrar externament mitjançant la referència dedicada comercialment coneguda com Pierce® ESI Negative Ion Solution de Thermo Scientific (Waltham, MA, EUA). En mode d'ions negatius, aquest estàndard va proporcionar un espectre amb una cobertura iònica justa del rang m/z escanejat tant en experiments amb MS com en tàndem.

Per a l'optimització de les condicions nanoESI MS i MS/MS en mode d'ions negatius, comparació i avaluació de dades, es van mesurar les següents fraccions de gangliòsids estàndard, que estan disponibles comercialment: GM1 (cervell boví); GD1a, GD1b, GT1b i GQ1b (cervell porcí); i GM3 i GD3 (llet bovina) d'Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL, EUA), així com tot l'extracte de gangliòsids del cervell boví, conegut comercialment com a mescla cronassial, d'Abano Terme (Pàdua, Itàlia).

3.7. Abreviatura de Gangliosides

Per a l'assignació de gangliòsids, el sistema d'abreviatura introduït el 1980 per Svenner-holm [20], juntament amb les recomanacions de 1998 de la Comissió de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB, [21] es va aplicar de la següent manera:

LacCer-Gal 4Glc 1Cer; GM3-II3 - -Neu5Ac-LacCer; GD3-II3 - -(Neu5Ac)2-LacCer; GT3-II3 - -(Neu5Ac)3-LacCer; GM2-II3 - -Neu5Ac-Gg3Cer; GD2-II3 - -(Neu5Ac)2-Gg3Cer; GM1a o GM1-II3 - -Neu5Ac-Gg4Cer; GM1b-IV3 - -Neu5Ac-Gg4Cer; GalNAc-GM1b-IV3 - -Neu5Ac-Gg5Cer; GD1a-IV3 - -Neu5Ac, II3 - -Neu5Ac-Gg4Cer; GD1b-II3 - -(Neu5Ac)2- Gg4Cer; GT1b-IV3 - -Neu5Ac, II{3 - -(Neu5Ac){2-Gg4Cer; GQ1b-IV3 - -(Neu5Ac)2, II3 - - (Neu5Ac)2-Gg4Cer; nLM1 o 30 -nLM1-IV3 - -Neu5Ac-nLc4Cer; LM1 o 30 -isoLM1-IV{3 - - Neu5Ac-Lc4Cer; nLD1-disialo-nLc4Cer.

3.8. MS Interpretació de dades

Com que fins ara no hi ha cap programari, bases de dades o altres serveis informàtics dedicats per ajudar a la interpretació del cribratge de gangliòsids i dels espectres de masses en tàndem, en aquest estudi, els ions moleculars detectats es van assignar a espècies de gangliòsids mitjançant un càlcul exacte de massa i sobre la base. de la informació que havíem adquirit anteriorment sobre aquest tipus de glicoesfingolípids i les vies de biosíntesi conegudes. En la interpretació de les dades de MS i MS/MS i els càlculs de massa, ens va ajudar el gran inventari d'ions moleculars i de fragments de gangliòsids que hem identificat i caracteritzat en diversos teixits i fluids humans fins ara mitjançant enfocaments avançats de MS. Aquestes estructures representen les nostres bases de dades originals, que es van incloure en els nostres estudis publicats anteriorment [12,19,22–31]. Les noves espècies descrites en aquest treball completen el nostre registre de gangliòsids existent.

L'assignació dels ions de la seqüència de la columna vertebral d'oligosacàrids generats dins de l'HCD MS/MS va seguir la nomenclatura generalment acceptada [24, 25].

4. Conclusions

En aquest estudi, hem desenvolupat un enfocament basat en HR MS i tàndem MS per a la determinació de gangliòsids en DKD mitjançant un assaig comparatiu d'extractes urinaris de pacients normo, micro i macroalbuminúrics, així com controls sans, realitzats sota idèntica solució. i condicions instrumentals. L'objectiu final del nostre estudi va ser determinar els canvis que es produeixen en la composició i l'estructura dels gangliòsids renals expressats en DKD versus controls i en diferents estadis de la malaltia.

L'alta sensibilitat, reproductibilitat, resolució i precisió massiva proporcionada per la plataforma MS optimitzada per a aquest propòsit ens va permetre establir que el grau de sialilació de les espècies expressades sembla tenir un paper important en la progressió de la malaltia, representant un marcador de DKD. , fins i tot en l'etapa de normoalbuminúria dels pacients amb DM tipus 2. A més, les modificacions observades en la composició de Cer mostren que, al costat de l'estructura del glicà, la part lipídica també es pot considerar una empremta digital molecular per a les etapes de DKD.

En la fase més avançada de la investigació, es va utilitzar MS/MS by HCD per a l'anàlisi estructural de l'espècie amb un possible paper de biomarcador. En el cas de la mostra A3, els ions moleculars, que, segons el càlcul de massa, es van trobar que corresponien a GQ1(d18:1/18:0) i GT1(d18:1/18:{{1 0}}), respectivament, es van aïllar i es van sotmetre a fragmentació a la cel·la de col·lisió de l'instrument. L'objectiu d'aquests experiments era recollir informació sobre la configuració estructural detallada de la molècula. Les condicions de seqüenciació optimitzades, en particular el rang d'energia de col·lisió i la pressió del gas de col·lisió, van induir clivages específics dels enllaços glicosídics, que van donar lloc a la formació d'ions de fragments detectats com a senyals rellevants en els espectres de masses en tàndem. Es van trobar diversos ions de diagnòstic per a certs isòmers relacionats amb la localització de les fraccions Neu5Ac a la cadena d'hidrats de carboni de la molècula de gangliòsids. A partir d'aquests ions de seqüència estructuralment informatius, vam descobrir que GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18:0) i GT1b(d18:1/18: 0) els isòmers estan presents a la mostra A3 i estan associats a la macroalbuminúria.

Els resultats obtinguts requereixen una validació addicional d'algunes hipòtesis en estudis longitudinals realitzats en cohorts més grans per tal de demostrar una relació de causalitat entre la complexitat dels gangliòsids detectats a l'orina dePacients DKDi l'afectació renal molt primerenca en el curs de la DM tipus 2, fins i tot en l'etapa de normoalbuminúria. Tanmateix, considerem que les presents troballes obren una direcció de recerca cap a la investigació del paper en la progressió de la malaltia que juga la sialilació, O-acetilació i O-fucosilació de gangliòsids, així com les seves modificacions per O-GalNAc i CH3COO−. Un altre aspecte beneficiós d'aquests resultats és el possible desenvolupament de procediments per al diagnòstic precoç de DKD basats en el perfil de gangliòsids mitjançant espectrometria de masses avançada.

Referències

1. Ghaderian, SB; Beladi-Mousavi, SS El paper de la diabetis mellitus i la hipertensió en la malaltia renal crònica.J. Ren. Inj. Anterior2014, 3, 109–110. [CrossRef] [PubMed] 

2. Johansen, KL; Chertow, GM; Foley, RN; Gilbertson, DT; Herzog, CA; Ishani, A.; Israni, Alaska; Ku, E.; Tamura, MK; Li, S. Informe anual de dades 2020 del Sistema de dades renals dels EUA: Epidemiologia de la malaltia renal als Estats Units.Am. J. Ronyó Dis.2021, 77, A7–A8. [CrossRef] [PubMed] 

3. Lin, YC; Chang, YH; Yang, SY; Wu, KD; Chu, TS Actualització de fisiopatologia i gestió de la malaltia renal diabètica.J. Med. Assoc.2018, 117, 662–675. [CrossRef] [PubMed] 

4. Vallon, V.; Thomson, SC Funció renal en models de malaltia diabètica: el sistema tubular en la fisiopatologia del ronyó diabètic.Ann. Reverent Physiol.2012, 74, 351–375. [CrossRef] 

5. Milas, O.; Gadalean, F.; Vlad, A.; Dumitrascu, V.; Velciov, S.; Gluhovschi, C.; Bob, F.; Popescu, R.; Ursoniu, S.; Jianu, DC; et al. Les citocines proinflamatòries s'associen amb danys podòcits i disfunció tubular proximal en l'etapa inicial de la malaltia renal diabètica en pacients amb diabetis mellitus tipus 2.J. Diab. Complicat.2020, 34, 107479. [CrossRef] 

6. Petrica, L.; Ursoniu, S.; Gadalean, F.; Vlad, A.; Gluhovschi, G.; Dumitrascu, V.; Vlad, D.; Gluhovschi, C.; Velciov, S.; Bob, F.; et al. Els nivells d'ARNm associats als podòcits urinaris es correlacionen amb la disfunció del túbul proximal en la nefropatia diabètica precoç de la diabetis mellitus tipus 2.Diabetol. Metab. Sindr.2017, 9, 31–43. [CrossRef] 

7. Kwak, DH; Rho, YI; Kwon, OD; Ahan, SH; Cançó, JH; Choo, YK; Kim, SJ; Choi, BK; Jung, KY Disminucions del gangliòsid GM3 en glomèruls diabètics induïts per estreptozocina de rates.Ciència de la vida.2003, 72, 1997–2006. [CrossRef] 

8. Masson, E.; Troncy, L.; Ruggiero, D.; Wiernsperger, N.; Lagarde, M.; El Bawab, S. Els gangliòsids de la sèrie a median els efectes dels productes finals de glicació avançada sobre la proliferació de pericits i cèl·lules mesangials: un mediador comú per a la microangiopatia renal i retiniana?Diabetis2005, 54, 220–227. [CrossRef] 

9. Zador, Z.; Deshmukh, GD; Kunkel, R.; Radin, NS; Shayman, JA Un paper per a l'acumulació de glicoesfingolípids en la hipertròfia renal de la diabetis mellitus induïda per estreptozocina.J. Clin. Investig.1993, 91, 797–803. [CrossRef]

10. Ene, CD; Penescu, M.; Anghel, A.; Neagu, M.; Budu, V.; Nicolae, I. Monitorització de la nefropatia diabètica per gangliòsids circulants.J. Immunoass. Immunoquímica.2016, 37, 68–79. [CrossRef]