Mètode HPTLC de fase inversa altament sensible i ecològicament sostenible per a la determinació de la hidroquinona en cremes blanquejadores comercials

Contacte:ali.ma@wecistanche.com

Mohammed H. Alqarni 1, Prawez Alam 1, Faiyaz Shakeel 2, Ahmed I. Foudah 1 i Sultan Alshehri 2*

Resum: Hidroquinona(HDQ) és un agent despigmentant natural, que s'utilitza habitualment en preparacions per a tonificar la pell. La seguretat i la verdor dels mètodes analítics de quantificació HDQ no es van considerar a la literatura anterior. Per tant, es va establir un assaig basat en cromatografia de capa fina (RP-HPTLC) d'alt rendiment en fase inversa i molt més ecològic per a l'estimació d'HDQ en quatre comercials diferents.blanqueigcremes (CWC). La barreja binària etanol-aigua (60:4{0, v·v−1) es va utilitzar com a sistema de dissolvent verd. L'estimació de HDQ es va realitzar a 291 nm. L'assaig actual basat en RP-HPTLC era lineal a l'interval de 20–2400 ng de banda-1. El mètode analític actual era molt sensible basat en les dades de detecció i quantificació. Els altres paràmetres de validació, com ara la precisió, la precisió i la robustesa, també eren adequats per a la determinació de HDQ. Les quantitats màximes de HDQ es van obtenir en CWC A (1,23 per cent w·w−1) seguit de CWC C (0,81 per cent w·w−1), CWC D (0,43 per cent w·w−1) i CWC B (0,37 per cent w·w-1) w−1). La puntuació analyticalGREEnness (AGREE) per al mètode analític actual es va estimar en 0,91, cosa que indica les excel·lents característiques més ecològiques del present assaig RP-HPTLC. Aquests resultats suggereixen que el mètode analític actual és altament sensible i ecològicament sostenible per a la quantificació de HDQ en les seves formulacions comercials.

Paraules clau:acordar;hidroquinona; RP-HPTLC ecològicament sostenible; validació

Extracte de Cistanchepot eliminar els radicals lliures i prevenir l'acumulació de tirosinasa.

Feu clic aEfectes Cistanche per blanquejar

1. Introducció

Hidroquinona(HDQ) és un compost natural, que està present en diverses formulacions comercials de tonificació de la pell per al tractament del melasma (una malaltia causada per l'acumulació excessiva de melanina a la pell humana) [1,2]. És un potent agent despigmentant i s'utilitza com a alternativa a la tirosinasa [3]. És un dels agents més utilitzats en el tractament de la hiperpigmentació de la pell humana [4,5]. La concentració efectiva d'HDQ en les formulacions comercials de tonificació de la pell varia de l'1,5 al 2,0 per cent w·w−1[6]. L'alta concentració d'HDQ (per sobre del 5% w·w−1) causa irritació local i leucoderma a la pell humana [5,6]. A causa dels seus controvertits efectes secundaris, molts països han prohibit HDQ com ablanqueigagent en formulacions tòpics [7]. No obstant això, diverses investigacions clíniques han suggerit diversos efectes protectors deHDQen el maneig de diferents trastorns hiperpigmentaris de la pell com el melasma, les pigues, els lentigins, etc. [8,9]. Tenint en compte tant els beneficis com els riscos de HDQ, és necessària la seva anàlisi quantitativa en diferents formulacions comercials de tonificació de la pell.

S'utilitzen diferents assajos farmacèutics per a la quantificació de HDQ, ja sigui sol o en combinació amb altresblanqueigAgents en cremes blanquejadores comercialitzades (CWC). S'ha documentat una varietat d'assajos basats en espectrometria ultraviolada (UV) per a l'anàlisi quantitativa de HDQ en productes blanquejants comercials (CWP) i preparats farmacèutics [10–13]. S'ha documentat una àmplia gamma d'assaigs basats en cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC) per a la determinació de HDQ juntament amb els seus èters en una varietat de CWC i CWP [14–23]. També s'han establert diversos mètodes voltamètrics per a la determinació simultània d'HDQ i els seus derivats d'èter en CWP [24–29]. També s'han establert alguns altres assajos analítics com ara assajos electroquímics d'injecció de flux [30], cromatografia electrocinètica micel·lar [31], electrocromatografia capil·lar [32] i assajos basats en nanocomposites [33] per alHDQanàlisi juntament amb els seus derivats èter i altresblanqueigagents en CWP. També s'han informat alguns nanosensors basats en electroquímics per a l'anàlisi HDQ [34, 35]. El nostre grup de recerca també va aplicar un mètode únic basat en cromatografia de capa fina (HPTLC) d'alt rendiment en fase normal per a l'anàlisi qualitativa i quantitativa de HDQ en CWC [1].

Després d'una anàlisi exhaustiva dels assaigs reportats sobre l'anàlisi HDQ, es va observar que la seguretat i la sostenibilitat ecològica dels mètodes farmacèutics a la literatura no s'han avaluat ni considerat per a l'avaluació. A més, els assaigs basats en HPTLC en fase inversa (RP-HPTLC) verd/ecològicament sostenibles encara no s'han utilitzat per a l'estimació deHDQen els seus CWC. Els assajos ecològicament sostenibles/verds basats en HPTLC ofereixen molts avantatges com ara simplicitat, economia, baix cost d'operació, temps d'anàlisi curt, anàlisi paral·lel de mostres múltiples, claredat de detecció i reducció de la toxicitat ambiental respecte a HPLC i altres mètodes analítics [36–39]. En conseqüència, es va seleccionar un mètode RP-HPTLC per a la determinació de HDQ per a aquest estudi. S'utilitzen diferents enfocaments per a l'avaluació del perfil verd dels assajos farmacèutics [38-43]. No obstant això, només l'enfocament mètric GEEnness analític (AGREE) aplica els 12 principis de la química verda analítica (GAC) per a l'avaluació del verd [42].

L'enfocament mètric AGREE es va aplicar per a l'avaluació de la verdor del mètode presentRP-HPTLC [42]. Per tant, el present treball es va dur a terme per desenvolupar un mètode RP-HPTLC altament sensible i verd/ecològicament sostenible per a l'estimació deHDQen quatre CWC diferents. El perfil de verd del present mètode RP-HPTLC es va obtenir per AGREE: The Analytical Greenness Calculator. El present assaig analític per a l'anàlisi HDQ es va validar d'acord amb les directrius Q2 (R1) del Consell Internacional d'Harmonització (ICH) [44].

2. Materials i Mètodes

2.1. Materials

L'estàndard de referència d'HDQ (puresa: 99 per cent) es va adquirir a Fluka Chemica (Darmstadt, Alemanya). El metanol de grau HPLC (MeOH) i l'etanol (EtOH) es van obtenir d'Alfa Aesar (Tewksbury, MA, EUA). L'aigua de grau HPLC (H2O) es va recollir d'un sistema de purificació d'aigua Milli-Q (E-Merck, Darmstadt, Alemanya). Altres dissolvents i reactius utilitzats eren de grau analític. Es van obtenir quatre CWC d'HDQ diferents d'un mercat farmacèutic a Al-Kharj, Aràbia Saudita, el mes de juny de 2021. Els CWC deHDQes va emmagatzemar en un lloc fresc i fosc a 22 ◦C abans de l'inici dels experiments. Els CWC es van emmagatzemar durant aproximadament un mes abans de l'inici dels experiments.

2.2. Cromatografia

La quantificació de densitometria RP-HPTLC d'HDQ en el seu estàndard de referència i quatre CWC diferents es va realitzar mitjançant un instrument HPTLC (CAMAG, Muttenz, Suïssa). L'anàlisi quantitativa de HDQ es va dur a terme en plaques amb suport de vidre de 10 × 20 cm2 recobertes prèviament amb plaques de gel de sílice RP 60 F254S (E-Merck, Darmstadt, Alemanya). Les mostres de les plaques TLC es van detectar com a bandes de 6 mm. utilitzant un aplicador de mostreig automàtic 4 (ATS4) (CAMAG, Ginebra, Suïssa). L'aplicador de mostres estava equipat amb una xeringa de microlitres CAMAG (Hamilton, Bonaduz, Suïssa). La taxa d'aplicació per a l'anàlisi quantitativa deHDQes va mantenir constant a 150 nL s−1. Les plaques es van desenvolupar en una cambra de desenvolupament automàtic 2 (CAMAG, Muttenz, Suïssa) a una distància de 80 mm. El sistema de dissolvent verd per a l'anàlisi HDQ va ser EtOHH2O (60:40, v·v−1). La cambra de desenvolupament es va saturar prèviament amb els vapors de la fase mòbil durant 30 min a 22 ◦C. L'HDQ es va detectar a 291 nm. Les dimensions de l'escletxa eren de 4 × 0,45 mm2 i la velocitat d'escaneig era de 20 mm s-1. Cada experiment es va dur a terme per triplicat. El programari utilitzat per al tractament de dades va ser WinCATs (v. 1.4.3.6336,CAMAG, Muttenz, Suïssa).

2.3. Corba de calibratge HDQ i preparació de mostres de control de qualitat

La quantitat especificada d'HDQ (10 mg) es va dispensar en 100 ml de sistemes de dissolvents verds EtOH-H2O (60:40, v·v-1) per aconseguir la solució de reserva amb la concentració de 100 µg mL-1. Els diferents volums de solucions d'estoc es van diluir encara més utilitzant sistemes EtOH-H2O (60:40, v·v-1) per aconseguir concentracions HDQ en el rang de banda 20-2400 ng-1. Les solucions obtingudes deHDQque contenien diferents concentracions es van localitzar en plaques HPTLC. L'àrea màxima d'HPTLC per a HDQ es va obtenir per a cada solució HDQ utilitzant el present assaig farmacèutic. La corba de calibratge d'HDQ es va generar traçant les concentracions d'HDQ contra la seva àrea HPTLC. A més, tres mostres de control de qualitat (QC) diferents, com ara mostres de QC baix (LQC; 20 ng banda-1), QC mitjà (MQC; 600 ng de banda-1) i mostres de QC alt (HQC; 2400 ng banda-1) , es van obtenir per separat per tal de determinar diferents paràmetres de validació per al present assaig farmacèutic.

2.4. Processament de mostres per a la determinació de HDQ en CWC

L'HDQ es va extreure de quatre CWC diferents adoptant el procediment informat a la literatura [1]. Les quantitats pesades amb precisió (5,0 g) de quatre CWC diferents, inclosos A, B, C i D, es van transferir a l'embut de separació per separat. Cada CWC es va agitar a l'embut de separació amb MeOH (3 × 70 ml) durant un període de 30 min a 22 ◦ C. Els extractes de MeOH de cada CWC es van combinar i es van evaporar per separat fins a sequedat a pressió reduïda mitjançant un evaporador rotatiu al buit. Els residus obtinguts es van reconstituir amb 10 ml de MeOH i es van emmagatzemar a la nevera fins a una avaluació posterior. Les mostres obtingudes es van sotmetre a anàlisi HDQ utilitzant el mètode analític actual a 291 nm.

2.5. Paràmetres de validació

El present assaig RP-HPTLC per a l'anàlisi HDQ es va validar per a diferents paràmetres de validació seguint les directrius ICH-Q2 (R1) [44]. ElHDQLa linealitat es va avaluar representant les concentracions d'HDQ contra la seva àrea màxima mesurada. La linealitat HDQ es va avaluar en 11 mostres de control de qualitat diferents de 20, 40, 60, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 1200 i 2400 ng de la banda-1 per al present assaig farmacèutic. Els paràmetres d'eficiència del sistema per al present mètode analític es van avaluar en termes del factor de retard (Rf), el factor d'asimetria (As) i el nombre de plaques teòriques per metre (N m−1). El Rf, As i N m−1 es van obtenir a MCQ (banda de 600 ng-1), tal com es va informar anteriorment a la literatura [45].

La precisió del mètode RP-HPTLC actual es va determinar com el percentatge de recuperació. El percentatge de recuperació es va obtenir a LQC (banda de 20 ng-1), MQC (banda de 600 ng-1) i HQC (banda de 2400 ng-1) per el mètode analític actual.

La precisió del mètode analític actual es va avaluar com a precisió intra/interday. La precisió intradia es va determinar mitjançant l'anàlisi de HDQ a LQC, MQC i HQC el mateix dia per al present assaig analític. La precisió entre dies es va determinar mitjançant l'anàlisi de HDQ a LQC, MQC i HQC en tres dies diferents per a l'assaig de presentació analític [44]. Cada precisió es va mesurar sis vegades (n=6).

La robustesa es va avaluar introduint alguns petits canvis en els sistemes de dissolvents verds per al mètode RP-HPTLC actual. Per a l'avaluació de la robustesa, el sistema de dissolvents EtOH H2O (60:40, v·v−1) original es va canviar a EtOH-H2O (62:38, v·v−1) i EtOHH2O (58:42, v·v−1). ) sistemes de dissolvents, i la resposta HPTLC específica i els valors de Rf es van registrar i interpretar [44].

La sensibilitat del mètode analític actual es va avaluar com a límits de detecció (LOD) i quantificació (LOQ) mitjançant un mètode de desviació estàndard. Es van calcular el LOD i el LOQ de HDQ per al mètode analític actual, tal com s'informa a la literatura [44,45].

La puresa/especificitat màxima es va avaluar comparant els valors Rf i els espectres UV de HDQ en CWCs A, B, C i D amb el de HDQ estàndard per a l'assaig farmacèutic actual.

2.6. Anàlisi quantitativa de HDQ en CWC

Les mostres obtingudes de CWC A, B, C i D es van observar a les plaques HPTLC i es van anotar les seves respostes TLC. La zona cim perHDQen CWC es va registrar. Els continguts HDQ en CWC es van calcular utilitzant la corba de calibratge de HDQ per al mètode presentanalitic.

2.7. Avaluació del verd

Les característiques de verdor del present mètode analític es van obtenir mitjançant l'enfocament mètric AGREE [42]. Les puntuacions AGREE (0.0–1.0) del mètode analític actual es van registrar mitjançant AGREE: The Analytical Greenness Calculator (versió0.5, Universitat de Gdansk of Technology, Gdansk, Polònia, 2020).

3. Resultats i discussió

3.1. Desenvolupament del mètode

Basant-se en mètodes analítics de la literatura, s'ha descobert que manca el mètode RP-HPTLC ecològic/verd sostenible per a l'anàlisi de HDQ en cosmètics comercials. Per tant, el present estudi es va dur a terme per desenvolupar el mètode ràpid, altament sensible i ecològicament sostenible. Mètode RP-HPTLC per a l'anàlisi HDQ en CWC.

Per a l'anàlisi RP-HPTLC d'HDQ, diferents proporcions d'EtOH i H2O, incloent EtOH-H2O (50:50, v·v−1), EtOH-H2O (60:40, v·v−1), EtOH-H2O (70:30, v·v−1), EtOH H2O (80:20, v·v−1) i EtOH-H2O (90:10, v·v−1), es van avaluar com a combinacions de dissolvents verds per al desenvolupament d'una banda fiable per a l'anàlisi HDQ. Les mescles de dissolvents es van desenvolupar en condicions de saturació de la cambra. A partir de les dades registrades, es va observar que EtOH-H2O (50:50, v·v−1), EtOH-H2O (70:30, v·v−1), EtOH-H2O (80:20, v·v−). 1), i les mescles de dissolvents verds EtOH-H2O (90:10, v·v−1) van oferir un cromatograma pobre deHDQamb un valor As inacceptable (Com {{0}},29). Tanmateix, la combinació de dissolvents verds EtOH-H2O (60:40, v·v−1) havia demostrat oferir un cromatograma ben resolt de HDQ atRf=0,83 ± 0,02 amb un valor As acceptable (As {{{ 12}}.03) (Figura 1). Per tant, l'EtOH H2O (60:40, v·v−1) es va optimitzar com a mescles de dissolvents verds per a l'anàlisi HDQ als CWC. Les bandes espectrals UV per al mètode RP-HPTLC actual es van registrar densitomètricament i es va trobar la resposta HPTLC màxima a 291 nm per al mètode RP-HPTLC actual. Per tant, tota l'anàlisi de HDQ es va realitzar a 291 nm.

3.2. Paràmetres de validació

El present assaig farmacèutic per a la quantificació HDQ es va validar pel rang de linealitat, els paràmetres d'eficiència del sistema, la precisió, la precisió, la robustesa, la sensibilitat i la puresa/especificitat màxima seguint les recomanacions de l'ICH [44]. Els resultats de l'anàlisi de regressió de mínims quadrats de la corba de calibratge d'HDQ per al mètode actual RP-HPTLC es presenten a la taula 1.HDQLa corba de calibratge era lineal en l'interval de la banda 20–2400 ng amb un coeficient de determinació de 0, 9997 per al mètode analític actual. aquestes dades van suggerir una bona linealitat entre la concentració de HDQ i la seva resposta.

Els paràmetres d'eficiència del sistema del mètode farmacèutic actual es van estudiar a MQC (banda de 600 ng-1), i els resultats s'inclouen a la taula 2. Els valors Rf, As i N m−1 per a el mètode analític actual es va predir com a 0,83 ± 0,02, 1,03 ± 0,03 i 4987 ± 2,87, respectivament. Aquests resultats van indicar que el mètode analític actual era fiable per a l'anàlisi HDQ als CWC.

Els resultats de l'anàlisi de precisió per al mètode analític actual es mostren a la taula 3. El percentatge de recuperació de HDQ per al mètode RP-HPTLC actual es va determinar com a 101,80 per cent, 98,16 per cent i 99,38 per cent a LQC, MQC i HQC, respectivament . Els alts valors de percentatges de recuperació van indicar la precisió del mètode RP-HPTLC actual per a l'anàlisi HDQ als CWC.

La precisió es va determinar com el percentatge del coeficient de variació (percentatge de CV), i els resultats es mostren a la taula 4. Els percentatges de CV de HDQ per al mètode analític actual es van predir com a 0,91, 0. 59 i 0,26 per cent a LQC, MQC i HQC, respectivament, per a la precisió intraday. El percentatge de CV d'HDQ per al mètode RP-HPTLC actual es va predir com a 0,98,{{10}},69 i 0,32 per cent a LQC, MQC i HQC, respectivament, per al precisió interday. Els valors baixos del percentatge de CV van indicar la precisió del mètode RP-HPTLC actual per a l'anàlisi HDQ en CWC.

Els resultats de l'anàlisi de robustesa per al mètode analític actual es mostren a la taula 5. Els percentatges de CV per a l'anàlisi de robustesa es van predir com a 0,59–0,66 per cent per al mètode presentanalitic. Els valors de Rf d'HDQ es van trobar en l'interval 0.82–0.84 per al mètode presentanalitic. Els canvis estrets en els valors de Rf de HDQ i de percentatges més baixos de CV van mostrar la robustesa del mètode analític actual per a la quantificació de HDQ en CWC.

La sensibilitat del mètode analític actual es va registrar com a "LOD i LOQ", i els seus valors físics es mostren a la taula 1. El "LOD i LOQ" per al mètode presentanal es va predir com a 6,91 ± 0,23 i 2. 0,73 ± 0,68 ng banda−1, respectivament, perHDQquantificació. Aquests valors físics de "LOD i LOQ" per al mètode analític actual van indicar la sensibilitat per a l'anàlisi HDQ en CWC.

La puresa/especificitat màxima del present mètode analític es va avaluar comparant els espectres UV superposats de HDQ en quatre CWC diferents amb els de HDQ estàndard. Els espectres UV superposats de HDQ estàndard i HDQ en quatre CWC diferents es mostren a la figura 2. La resposta cromatogràfica més alta per HDQ en HDQ estàndard i CWC estudiats es va observar a 291 nm per al mètode analític actual. Els idèntics espectres UV, valors Rf i longitud d'ona de HDQ en HDQ estàndard i CWC van indicar la puresa/especificitat màxima per al mètode analític actual.

3.3. Anàlisi de continguts HDQ en CWC

L'aplicabilitat del present assaig analític es va verificar en l'estimació quantitativa de HDQ en CWC. El cromatograma deHDQde CWC es va identificar comparant el seu punt TLC a Rf {{0}},83 ± 0.02 amb els de HDQ estàndard per al mètode analític actual. Els cromatogrames d'HDQ en CWC A i B per al present assaig analític es resumeixen a la figura 3. Els cromatogrames HPTLC d'HDQ en CWC eren idèntics als de HDQ pur. També van aparèixer alguns pics addicionals en els cromatogrames dels CWC, que podrien estar associats amb diferents excipients presents als CWC. El mètode HPTLC ecològicament sostenible va ser selectiu per a l'anàlisi HDQ a Rf=0,83 sense interferències dels altres ingredients dels CWC. Es va trobar que el valor Rf (0,83) de HDQ en CWC era idèntic al de HDQ estàndard ({{2{0}},83), cosa que indica que no hi havia interacció entre HDQ i Ingredients CWC. Per tant, no hi va haver cap influència dels ingredients de la formulació en la qualitat del cromatograma HDQ, el LOD i l'eficiència del mètode HPTLC actual d'anàlisi HDQ. La presència de pics addicionals als cromatogrames de CWC va indicar que el mètode RP-HPTLC actual era fiable per a l'estimació de l'HDQ en presència d'ingredients de formulació. El contingut d'HDQ de CWCs es va determinar a partir de la corba de calibratge d'HDQ i els resultats s'inclouen a la taula 6. La taula 6 també resumeix la quantitat etiquetada d'HDQ i els seus ingredients de formulació. Els continguts d'HDQ van ser més alts a CWC A (1,23% w·w−1) seguit de CWC C (0,81% w·w−1), CWC D (0,43% w·w −1) i CWC B (0,37 per cent w·w−1). El contingut enregistrat d'HDQ era molt inferior a la quantitat etiquetada (2,00 per cent w·w−1) d'HDQ als CWC estudiats. Els continguts HDQ en dos CWC diferents (A i B) es van registrar com a 0,69 per cent w·w-1 i 0,34 per cent w·w-1, respectivament, utilitzant el mètode HPTLC de fase normal a la literatura [1]. Els continguts reportats d'HDQ també eren molt inferiors a la quantitat etiquetada (2, 00 per cent w·w−1) d'HDQ a la literatura [1]. Diversos CWC o CWP es comercialitzen sota l'afirmació de ser totalment naturals. No obstant això, és comú trobar alguns productes químics sintètics com a adulterants amb els mateixos efectes que es troben en aquests CWC o CWP com el frau. La quantitat de HDQ registrada en aquest treball i les registrades a la literatura van indicar que els CWC estudiats tenen una quantitat baixa de HDQ i no coincideixen amb les afirmacions de l'etiqueta [1]. Per tant, s'espera que els CWC estudiats continguin alguns productes químics sintètics com a adulterants. En general, el present assaig analític es pot utilitzar per a l'anàlisi HDQ en preparats cosmètics i farmacèutics.

3.4. Avaluació del verd

S'utilitzen diferents mètodes per a l'avaluació de la verdor dels assaigs farmacèutics [38–43]. Tanmateix, només l'enfocament AGREE utilitza els 12 principis de GAC per a l'avaluació de la verdor [42]. Per tant, el perfil de verdor del present mètode analític es va obtenir mitjançant la calculadora AGREE. La puntuació AGREE prevista que utilitza 12 principis diferents de GAC per al present assaig analític es presenta a la figura 4. La puntuació AGREE per a diferents principis de GAC es va registrar de la següent manera: Tractament de la mostra: 0.61 Col·locació del dispositiu analític: 1.{{ 9}}Pasos per a la preparació de la mostra: 1.00Grau d'automatització: 0,8{0Derivatització: 1.00Quantitat de residus: 1.{{17} }Rendiment de l'anàlisi: 1.00Consum d'energia: 1.00Tratament de la mostra: 0,51Font del reactiu: 1.00Toxicitat dels dissolvents: 1.00 Seguretat de l'operador: 1.00

La puntuació global d'ACORD per al mètode analític actual es va registrar com a 0,91, cosa que indica l'excel·lent mètode analític verd per aHDQquantificació.

4. Conclusió

El mètode de densitometria RP-HPTLC es va desenvolupar per a l'anàlisi HDQ en quatre CWC diferents de HDQ. El present assaig RP-HPTLC es va validar per a diferents paràmetres de validació. El mètode analític actual era altament sensible, ràpid i ecològicament sostenibleHDQanàlisi. La puntuació AGREE per al mètode analític actual va suggerir un assaig analític excel·lent per a la quantificació de HDQ. El present REl mètode P-HPTLC era adequat per a l'anàlisi HDQ en quatre CWC diferents. Aquests resultats van indicar que el present assaig analític es pot aplicar per a l'anàlisi HDQ en diferents preparats cosmètics i farmacèutics.