Com l'extracte de Cistanche redueix la hiperplàsia inflamatòria

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

Reducció de la hiperplàsia inflamatòria a l'intestí en ratolins propensos al càncer de còlon mitjançant extracte d'aigua de Cistanche deserticola

Yamin Jia,1,2 et al

Cistanchedeserticola s'ha utilitzat habitualment en la medicina tradicional xinesa per tractar molts problemes de salut, com ara la síndrome de l'intestí irritable o el restrenyiment. Aquest estudi va ser dissenyat per provar l'eficàcia d'un extracte d'aigua de C. deserticola en la prevenció del càncer colorectal en un model de ratolí. L'extracte d'aigua ric en polisacàrids de C. deserticola es va preparar bullint la seva pols de tija en aigua destil·lada. Es van utilitzar ratolins nuls Tgfb1Rag2 com a model experimental. Aquí vam demostrar que l'alimentació d'extracte d'aigua de C. deserticola va reduir significativament el nombre de mucoseshiperplàsiai infecció intestinal per Helicobacter en ratolins. Aquest efecte beneficiós es va correlacionar amb una estimulació significativa del sistema immunitari, evidenciada per l'engrandiment de la melsa amb un augment del nombre de macròfags esplènics i cèl·lules assassines naturals, i amb una citotoxicitat més potent dels esplenòcits. L'extracte d'aigua in vitro de C. deserticola va millorar la citotoxicitat dels esplenòcits naïfs contra una línia cel·lular de càncer de còlon humà i, en cultius de macròfags, va augmentar l'expressió d'òxid nítric sintasa II i va estimular la fagocitosi. En conclusió, les nostres dades indiquen que l'administració oral d'extracte de C. deserticola es redueixinflamatòriahiperplàsticpòlips i infecció per helicobacter en ratolins per la seva activitat immunoestimuladora, cosa que suggereix que l'extracte de C. deserticola pot tenir el potencial de prevenir els trastorns d'inflamació intestinal, inclòs el càncer colorectal. Copyright © 2011 John Wiley & Sons, Ltd.

Paraules clau: immunomodulació a base d'herbes;Cistancheextracte; polisacàrids; helicobacter;inflamatòriahiperplàsia; càncer de colon.

Cistancheextractepot reduirInflamatorihiperplàsia

INTRODUCCIÓ

El càncer colorectal és el tercer càncer més freqüent en homes i el segon en dones a tot el món i ocupa la quarta causa de mort per càncer (8 per cent de totes les morts per càncer; Ferlay et al., 2010). Els estudis epidemiològics suggereixen que molts factors de risc associats a aquesta malaltia, inclosos els factors genètics (p. ex. antecedents familiars de càncer de còlon) (Strate i Syngal, 2005) i dietètics (p. ex. carn vermella i baixa en fibra; Chao et al., 2005; Park et al., 2005). al., 2005), iinflamatòriamalalties intestinals (IBD; Eaden et al., 2001; von Roon et al., 2007; Lukas, 2010). Fins ara, malgrat els nombrosos fàrmacs citotòxics nous i les tècniques quirúrgiques i radioterapèutiques millorades que s'utilitzen per al tractament d'aquesta malaltia (Cunningham et al., 2010), una gran proporció de pacients amb càncer colorectal segueix sent incurable; S'estimen unes 608.000 morts per aquesta malaltia a tot el món el 2008 (Ferlay et al., 2010). Per tant, es necessiten noves teràpies i un candidat és la immunoteràpia. S'han avaluat diversos enfocaments immunoterapèutics per al tractament del càncer colorectal, i els resultats fins ara són encoratjadors (Burgdorf et al., 2009). S'ha demostrat que els polisacàrids d'herbes tenen activitats immunoreguladores específiques (Jiang et al., 2010), cosa que suggereix que aquests productes a base d'herbes es podrien utilitzar com a adjuvant immunoestimulador específic contra el càncer colorectal.

Cistanchedeserticola Ma, coneguda com Rou Cong Rong a la medicina herbal xinesa, s'ha inclòs en fórmules a base d'herbes per a molts problemes de salut, com ara la impotència, la leucorrea mòrbida i la síndrome de l'intestí irritable / restrenyiment (Jiang i Tu, 2009). Estudis experimentals han revelat diferents activitats biològiques per diferents extractes de C. deserticola; l'extracte de glicòsids feniletanoides d'aquesta herba té activitat antifatiga en ratolins (Cai et al., 2010), i analgèsic i anti-inflamatòriaefectes en rosegadors (Lin et al., 2002), mentre que els seus polisacàrids estimulen la proliferació de limfòcits T i B en cultius de limfòcits (Wu et al., 2005; Dong et al., 2007). Tanmateix, encara no s'ha examinat l'eficàcia de l'extracte de polisacàrids de C. deserticola en l'estimulació de la resposta immune in vivo.

Drap2^-/-Els ratolins no tenen limfòcits T i B madurs, i en el fons mixt (~ 97 per cent 129 S6 i ~ 3 per cent CF-1) desenvolupen espontàniament una inflamació associadahiperplàsiaa l'intestí (Engle et al., 1999). La introducció genètica de l'al·lel nul Tgfb1 (gen del factor de creixement transformador b1 (TGF-b1)) a aquesta soca de ratolins dóna lloc a una major progressió dehiperplàsiaa adenoma i carcinoma (Engle et al., 2002), i la colitis patògena dependent de la microflora és necessària per al desenvolupament del càncer de còlon (Engle et al., 2002), cosa que suggereix que aquesta soca de ratolins proporciona un model ideal per l'examen d'una teràpia potencial en el tractament del càncer colorectal induït per la inflamació/IBD. En aquest estudi, demostrem per primera vegada l'eficàcia de l'extracte d'aigua ric en polisacàrids de C. deserticola en la reducció deinflamatòriahiperplàsiaen aquest model.

MATERIALS I MÈTODES

Extracte d'aigua ric en polisacàrids de preparació de C. deserticola.

Herbal C. deserticola va ser collida pel Dr. Y. Guo (Universitat Agrícola de la Xina) a la regió autònoma de Mongòlia Interior, Xina. La pols de tiges seques senceres (300 g) es va bullir en aigua bidestil·lada dues vegades: primer durant 1 h en 500 ml d'aigua, seguida d'una recollida del sobrenedant, després durant 45 min en 400 ml d'aigua. Els sobrenedants es van filtrar a través d'un paper de filtre Whatman (mitjanament ràpid) després de cada temps d'ebullició i es van agrupar. La solució d'extracte es va assecar per liofilització i es va mantenir a 80 C. El producte final era d'uns 10 g (rendiment: ~ 3 per cent).

Ratolins i cultius cel·lulars. Ratolins amb deficiència de TGF-b1 (Tgfb1 plus /- Rag2^-/-) en un fons mixt (~ 97 per cent 129 S6 i ~ 3 per cent CF-1) es van rebre d'una colònia de cria mantinguda en condicions lliures de patògens a la instal·lació d'animals del Jack Bell Research Center (Vancouver, BC). Aquests ratolins es van originar a partir del dipòsit de Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) (National Cancer Institute de Frederick, MD, EUA). Els ratolins C57BL/6 J (B6) (mascle, de 8 a 10 setmanes) es van comprar al Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EUA). Tots els animals dels experiments es van mantenir sota allotjament i dieta convencionals (5001 Rodent Diet, LabDiet) després del deslletament a les 4 setmanes d'edat, i es van realitzar tractaments a base d'herbes i recollida de mostres d'acord amb les directrius del Canadian Council on Animal Care sota
protocols aprovats pel Subcomitè d'Ús Animal de la Universitat de Colúmbia Britànica.

Tant la línia cel·lular d'adenocarcinoma de còlon humà SW480 com la línia cel·lular de macròfags leucèmics de ratolí RAW 246.7 es van cultivar en el medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) que contenia un 10 per cent de boví fetal. sèrum (FBS) (medi DMEM complet) a 37-C en una incubadora d'aire humidificada al 5% de CO2/95% d'aire. Els esplenòcits es van aïllar trencant suaument fragments de melsa en solució salina tamponada amb fosfat (PBS), seguida de l'eliminació d'eritròcits mitjançant tampó de lisi (0,15 M NH4Cl, 1,0 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 6,8). Després de rentar-se de nou amb PBS, els esplenòcits es van suspendre en un medi RPMI 1640 complementat amb un 10 per cent de FBS (medi RPMI complet).

Cistancheextractepot reduirInflamatorihiperplàsia

Tractament d'extracte.

L'extracte d'herbes, anomenatCistancheextracteen aquest estudi, finalment es va preparar mitjançant la reconstitució de pols seca amb aigua doble destil·lada esterilitzada i contenia 2-3 per cent (p/p) de feniletanoides, 65-70 per cent (p/p) de polisacàrids i 0.6–1 per cent (p/p) de proteïnes basades en els assajos següents: el nombre de feniletanoides es va determinar per absorbància a 332 nm mitjançant una espectrofotometria descrita anteriorment (Ouyang et al., 2005); el contingut de polisacàrids es va mesurar mitjançant un mètode estàndard de fenol àcid sulfúric (Dubois et al., 1956) després de la precipitació amb etanol; i la proteïna es va determinar mitjançant un assaig de proteïnes Bio-Rad seguint el protocol del fabricant (Bio-Rad Lab, Hercules, CA, EUA). La dosi d'extracte de Cistanche va ser de 0,4 g/kg/dia segons el nostre estudi pilot. La ingesta mitjana d'aigua per ratolí adult al dia era d'aproximadament 4 ml, i si 1 ml d'aigua potable contenia 3 mg deCistancheextracte, cada ratolí va rebre administració oral de 12 mg d'extracte per dia. A partir del fet que el pes corporal mitjà d'un ratolí adult era de 30 g, l'aigua potable contenia 3 mg/mL deCistancheextracteva donar una dosi de 0,4 g/kg/dia als ratolins. Els ratolins es van tractar donant aigua potable ad labium que contenia 3 mg/ml deCistancheextracteque s'ha de reposar almenys un cop cada dos dies, a partir dels dos mesos durant tres mesos en una sala convencional del centre de cura d'animals.

Classificació histològica del càncer colorectal.

Al final del tractament de tres mesos, es van recollir els teixits intestinals petits i grossos i es van obrir longitudinalment, seguit de netejar suaument el contingut amb PBS. Es van recollir un total de sis peces (cadascun de 2 cm de llarg) de teixit intestinal de cada ratolí: tres de l'intestí prim a les ubicacions proximal, mitjana i distal; dos de l'intestí gros a les posicions proximal i distal, i un del cec. Tots els teixits es van fixar en formalina al 10% i es van incrustar en parafina. Cada secció es va tacar amb hematoxilina i eosina (HE) per a la classificació histològica del càncer colorectal. La classificació de la malaltia es va realitzar segons els caràcters patològics dehiperplàsia, adenoma o carcinoma dins de cada mostra, tal com es va descriure anteriorment (Engle et al., 1999) en una prova a cegues. El nombre total de cada canvi patològic (hiperplàsia, adenoma i carcinoma) es va comptar en dues seccions del teixit intestinal per a cada ratolí.

Cistancheextractepot reduirInflamatorihiperplàsia

Detecció d'Helicobacter hepaticus (H. hepaticus) en femtes de ratolí.

Per examinar l'efecte deCistancheextractesobre el creixement de la microflora patològica a l'intestí, H. hepaticus a les femtes es va determinar mitjançant la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) amb cebadors d'ADNr 16S específics de l'espècie, tal com es va descriure anteriorment (Shames et al., 1995). Es van dissoldre aproximadament 20{0 mg de femta fresca en 1 μL de PBS i es van incubar a 50 graus durant 30 min, seguit de centrifugació a 8000 rpm durant 10 min. El sobrenedant (200 ml) es va recollir i es va barrejar amb una quantitat igual de solució de proteinasa K que contenia un 5 per cent (v/v) de 18,7 mg/ml de solució de proteinasa K (Fermentas Canada, Burlington, ON, Canadà) en un tampó de digestió (50 μM Tris-HCl, pH 8, 0, 0, 1 M EDTA, 0, 5 per cent de dodecil sulfat de sodi) i es va incubar a 70 ºC durant 30 min. L'ADN de la solució resultant es va extreure mitjançant el kit QIAprep Miniprep seguint el protocol del fabricant (QIAGEN, Mississauga, ON, Canadà).
L'amplificació de la reacció en cadena de la polimerasa de l'ADN bacterià es va realitzar en una barreja que contenia {{0}},75 μL d'10 tampó PCR, 0,5μL de 50 mM MgCl2, 0,5 μL de cada cebador (sentit: 5'-GCA TTT GAA ACT GTT ACT CTG; antisentit: 5'-GGG GAGCUUGAAAACAG, 100 mM cadascun), 0,5 μL de Taq polimerasa, 18,75 μL de H2O lliure de nucleases i 1 μL de solució d'ADN de femta no quantificada. La barreja de PCR es va escalfar a 94 graus durant 5 min, seguit de 40 cicles de desnaturalització a 94 graus durant 1 min, recuit a 55 graus durant 1,25 min i extensió a 72 graus durant 1,5 min. La PCR es va acabar amb un pas d'allargament de 10 minuts a 72 graus. El producte de PCR resultant (25 μL) es va sotmetre a electroforesi en un gel d'agarosa a l'1 per cent en tampó Tris-acetat-EDTA (TAE) que contenia 0, 5 mg/mL de bromur d'etidi i es va visualitzar sota llum UV.

Determinació de macròfags i cèl·lules assassines naturals (NK).

Els percentatges de macròfags i cèl·lules NK en suspensió d'esplenòcits es van determinar mitjançant l'anàlisi de classificació de cèl·lules activades per fluorescència (FACS). Es van incubar un milió d'esplenòcits al tampó FACS amb una combinació d'anticossos adequada per a diferents fenotips de cèl·lules en gel: isotiocianat de fluoresceïna anti-CD3- (FITC) i anti-CD49b-ficoeritrina (PE) (BD Biosciences, Mississauga, ON, Canadà) per a cèl·lules CD3 CD49b més NK i anti-ratolí de rata F4/80 plus com a anticòs primari i IgG-FITC anti-rata com a anticòs secundari (eBioscience, San Diego, CA, EUA) per a macròfags F4/80 més. La intensitat de la fluorescència per a cada tipus de cèl·lula es va mesurar mitjançant citometria de flux i es va analitzar mitjançant la comparació amb els controls de fons mitjançant el programari CELLQUEST (BD Biosciences).

Assaig de citotoxicitat de la calceïna-acetoximetil (calceïna-AM).

L'activitat lítica dels esplenòcits efectors contra les cèl·lules SW480 objectiu es va avaluar mitjançant un assaig de citotoxicitat de calceïna-AM mitjançant un sistema de cocultiu tal com es va descriure anteriorment (Neri et al., 2001). En resum, les cèl·lules SW480 es van etiquetar amb un colorant fluorescent calceïna-AM de la següent manera: 1 x10⁶cèl·lules/ml de cèl·lules SW480 en un medi DMEM complet es van incubar amb 15 μM de calceïna-AM a 37 graus amb sacsejada ocasional. Després de 30 minuts d'incubació, les cèl·lules es van rentar àmpliament amb un medi DMEM complet per eliminar el colorant extracel·lular. Les cèl·lules SW480 marcades amb colorant fluorescent en un medi DMEM complet (0,2 x 10⁶cèl·lules/{{0}},25 ml/pou) es van sembrar en 24-plaques de pous. En funció de les diferents proporcions (12:1, 6:1, 3:1 i 1,5:1) d'E (efector): T (objectiu), esplenòcits en 0,25 mL de medi RPMI complet per pou es van afegir als pous amb cèl·lules diana per triplicat. Els co-cultius es van incubar a 37 graus en un 5% de CO2 durant 24 hores. Els sobrenedants es van recollir després de girar la placa a 2000 rpm durant 5 min. L'alliberament de calceïna-AM al sobrenedant es va determinar mitjançant un espectrofluorímetre de microplaques (Fluoroskan Ascent FL, Thermo Labsystems) a una emissió de 527 nm sota excitació a 485 nm. Les cèl·lules diana, incubades amb una barreja de 0,25 ml de medi DMEM complet i 0,25 ml de medi RPMI complet, es van utilitzar com a control de fons o d'alliberament espontani i, en presència d'un 2%, es va utilitzar Triton X{29}} controls d'alliberament màxim. La citotoxicitat dels esplenòcits es va calcular de la següent manera:

Mesura d'òxid nítric (NO). L'òxid nítric secretat per les cèl·lules es va oxidar ràpidament a nitrit en el medi de cultiu. Per tant, es van determinar les concentracions de nitrats en el medi mitjançant el mètode de Griess com a mesura de la producció de NO. Cel·les RAW264.7 (0,25 x 10⁶

cèl·lules/pou en 0,5 ml de medi DMEM complet) a 24-plaques de pou es van estimular ambCistancheextracte(50–200 mg/mL) i lipopolisacàrid (LPS) (10 ng/mL) com a control positiu. Després de 24 hores de tractament, es van barrejar primer 50 ml de sobrenedant de cultiu amb 50 ml d'1 per cent.
sulfanilamida en àcid fosfòric al 5 per cent en plaques de 96-pous per triplicat, i es van incubar durant 10 min, després es van afegir 50 ml de diclorhidrat de naftil etilendiamina al 0,1 per cent en aigua destil·lada per pou. L'absorbància es va llegir a 550 nm després de la incubació durant 10 min, i el nivell de NO/nitrit es va calcular mitjançant una corba estàndard amb concentracions de nitrit de sodi conegudes.

Cistancheextractepot reduirInflamatorihiperplàsia

Western blot.

Els nivells cel·lulars d'òxid nítric sintasa II (NOS 2 o iNOS) es van examinar mitjançant Western blot tal com es va descriure anteriorment (Du et al., 2006). Breument, les mostres de proteïnes (aproximadament 100 mg/mostra) es van fraccionar en un 7% de SDS-PAGE i es van transferir a la membrana de nitrocel·lulosa. Les bandes de proteïnes NOS II es van identificar amb anticòs policlonal anti-NOS II de conill primari (N-20) (dilució 1:500; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA, EUA) i anticòs secundari IgG anti-conill de cabra ( dilució 1:10000; Vector Laboratory, Burlingame, CA, EUA). El complex proteïna-anticossos NOS II es va visualitzar mitjançant un assaig de quimioluminescència millorat (ECL, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Anglaterra). Les taques es van repetir mitjançant IgG anti-b-actina (Sigma-Aldrich Canada, Oakville, ON, Canadà) per confirmar la proteïna carregada a cada mostra.

Assaig de fagocitosi. La fagocitosi es va mesurar per la quantitat de perles de làtex marcades amb fluorescència (SigmaAldrich Canada, L-3030, modificades amb carboxilat, mida mitjana de 2 mm) engolides per cèl·lules RAW264.7 tal com es va descriure anteriorment (Wu et al., 2{{{ 9}}07). En resum, es van sembrar cèl·lules RAW264.7 (0,1 106 cèl·lules/0,5 ml/pou) en un medi DMEM complet en plaques 24-pous i es van estimular amb 100 mg/mL deCistancheextracteo el mitjà DMEM complet només com a control. Després de l'estimulació durant la nit, es van afegir 2, 5 ml de perles de làtex fluorescents per pou als cultius de macròfags i es van incubar durant 2 hores. Per a l'anàlisi de citometria de flux, les cèl·lules es van separar pipetant després del rentat en PBS, i la intensitat de la fluorescència de les cèl·lules fagocítiques es va mesurar amb un citòmetre de flux i es va analitzar en comparació amb controls de fons (sense perles) mitjançant el programari CELLQUEST (BD Biosciences).

Anàlisi estadística.

Les dades es van presentar com a mitjana més desviació estàndard (DE). Es va realitzar l'anàlisi de variància (ANOVA) o la prova t de Student segons correspongui per comparar les dades entre grups. Un valor p de <0,05 es="" va="" considerar="">

RESULTATS

Tractament ambCistancheextracteredueix la freqüència dehiperplàsiai H. hepaticus infecció de l'intestí Durant el període de tractament (3 mesos), es va controlar el pes corporal i la ingesta d'aigua potable una vegada cada 2 dies en ratolins del grup tractat amb extracte versus el grup tractat amb vehicle, no hi va haver cap diferència significativa. assenyalat (dades no mostrades). L'anàlisi histològica, però, va demostrar que l'administració oral deCistancheextractesreduït significativament el nombre deinflamatòriahiperplàsiaa l'intestí (Fig. 1), demostrat pel fet que els ratolins que rebien aigua amb extracte tenien menyshiperplàsia(5.00 més -2,83/ratolí, n=15) que els que beuen aigua o vehicle (7,53 més -3,09/ratolí, n {{9) }}) (extracte vs. vehicle: p=0.0133, prova t). La diferència en el nombre d'adenoma i carcinoma entre els ratolins tractats amb extracte i vehicle no va ser estadísticament significativa perquè només uns pocs ratolins tenien aquestes etapes de canvis patològics (dades no mostrades).

Figura 1. Reducció de la incidència d'hiperplàsia pel tractament amb extracte aquàtic de C. deserticola (Cistancheextracte). Es van alimentar els ratolins Tgfb1 més /-Rag2-/-Cistancheextracteen aigua potable (grup d'extractes) en comparació amb els que només tenen aigua potable (grup de vehicles). Les lesions canceroses a l'intestí es van examinar per histologia amb una taca H&E. (A) Una imatge típica de la secció de teixit sa. (B) Una imatge típica d'hiperplàsia a la secció, indicada amb una fletxa. (C) El nombre d'hiperplàsia a l'intestí de cada animal es va comptar per histologia (p=0.0133, extracte versus vehicle, n=15). Aquesta figura està disponible en color en línia a wileyonlinelibrary.com/journal/ptr

S'ha demostrat que el contingut microbià intestinal, especialment la infecció per H. hepaticus, és necessari per al desenvolupament de totes les etapes del càncer de còlon, inclosa la hiperplàsia a Rag2.^-/- ratolins (Engle et al., 2002; Erdman et al., 2003). Per examinar si el tractament ambCistancheextractesreducció de la microflora patològica a l'intestí, la presència de H. hepaticus a les femtes dels ratolins tractats ambCistancheextractees va determinar per PCR en comparació amb els controls del vehicle. En cada experiment, es van tractar tres ratolins per gàbia amb extracte o vehicle de Cistanche. Les mostres de femta es van recollir al final d'un període de 14-h durant la nit després de netejar la gàbia. Com es mostra a la figura 2, l'ADNr de H. hepaticus 16S a les femtes es va detectar de manera eficient mitjançant la tècnica de PCR. En tres experiments separats (taula 1), només el 20-40 per cent de les mostresCistanche-extracteEls ratolins tractats amb -es van detectar com a positius per PCR, mentre que el 60-80% dels controls de vehicles van ser positius (extracte versus vehicle: p=0.0189, prova t, n=3), cosa que suggereix que el tractament amb L'extracte de Cistanche va reduir la infecció intestinal per H. hepaticus en ratolins.

El tractament amb extracte de Cistanche augmenta el nombre de macròfags esplènics i cèl·lules NK

La resposta immune té un paper clau en l'eliminació de la infecció per Helicobacter. Per examinar siCistanche extracteEl tractament va afectar el sistema immunitari en aquests ratolins propensos al càncer de còlon, es va determinar la mida de la melsa (12 ratolins a cada grup) i el nombre d'esplenòcits (sis ratolins seleccionats aleatòriament de cada grup) al final del tractament. Es van pesar la melsa de 12 ratolins de cada grup, els altres tres ratolins de l'experiment inicial no es van incloure. Com es mostra a la taula 2,Cistanche-extracteEls ratolins tractats amb -(0.055 més -0,022 g/melsa) eren més pesats que en el grup de vehicles (0,038 més -0,01 g/melsa; extracte vs. vehicle: p=0.04, prova t). Aquestes dades es van recolzar encara més amb un augment del nombre d'esplenòcits en ratolins tractatsCistancheextracte, indicat per 7,095 més -1,353 (x10⁶ cèl·lules/melsa) en comparació amb 2,941 més -1,492 (x10⁶cèl·lules/melsa) ratolins de control dins del vehicle (extracte vs. vehicle: p=0.002, prova t).

Per avaluar més siCistancheextracteel tractament va afectar un subtipus particular d'esplenòcits en ratolins, el nombre de cèl·lules NK esplèniques (CD3^-CD49b^méscèl·lules) i macròfags (FT/80^méscèl·lules) es va comptar mitjançant anàlisi FACS. El percentatge de CD3^-CD49b^méscèl·lules als esplenòcits deCistanche-extracteels ratolins tractats amb vehicles (32,06 més -2,13 per cent) no va ser significativament diferent dels ratolins tractats amb vehicles (28,47 més -2,74 per cent; extracte vs. vehicle: p=0). 3741, prova t, n=6), però el nombre total de cèl·lules NK a la melsa deCistanche-extracteratolins tractats (2,22 més - 0,44x10⁶/melsa) va ser superior al grup de control dins del vehicle (0,83 més -0,17x10⁶/melsa; extracte vs. vehicle: p=0.01, t-test, n=6; Fig. 3B). Es van observar resultats similars en l'examen de cèl·lules esplèniques FT/80 plus; igual que a la població de cèl·lules NK esplèniques, la diferència en el percentatge de cèl·lules esplèniques FT/80 més entre els ratolins tractats amb extracte (35,25 més -7,28 per cent) i els ratolins de control de vehicles (31,74 més -5). 07 per cent ) no va ser significatiu (extracte versus vehicle: p=0,407, n{=6), però el nombre total de macròfags esplènics del grup tractat amb extracte (2,439 més -0 .452x10⁶cèl·lules/melsa) va ser superior a la dels grups control (1,114 més -0,685x10⁶cèl·lules/melsa; extracte vs. vehicle: p=0.001, t-test, n=6; Fig. 3D). En conjunt, aquestes dades suggereixen que el tractament ambCistancheextractepot augmentar el nombre total, però no el percentatge o la proporció, de subtipus d'esplenòcits efectors, cèl·lules NK i macròfags a la melsa.

Figura 3. Augment del nombre de cèl·lules NK esplèniques i macròfags pel tractament ambCistancheextracte. Les cèl·lules NK o els macròfags en suspensió d'esplenòcits es van determinar mitjançant anàlisi FACS amb una taca combinada d'anticossos FITC-anti-CD3e i marcador de cèl·lules APC-anti-CD49b/Pan-NK (per a cèl·lules NK) o amb una sola taca de FITC-anti- FT/80 (per a macròfags). (A) Un gràfic representatiu del percentatge de cèl·lules NK esplèniques (CD3^-CD49b^més) als esplenòcits dels ratolins tractats ambCistancheextracteenfront del vehicle. (B) El nombre total de cèl·lules NK per melsa. Les dades es presenten com a mitjana més -SD a cada grup (p= 0,01, n= 6). (C) Un gràfic representatiu del percentatge de macròfag esplènic (FT/80 més) en els esplenòcits de ratolins tractats ambCistancheextracteenfront del vehicle. (D) El nombre total de macròfags per melsa. Les dades es presenten com a mitjana més -SD a cada grup (p= 0,001, n=6).

El tractament amb extracte de Cistanche estimula la citotoxicitat dels esplenòcits in vivo i in vitro

La resposta immune depenia no només del nombre d'esplenòcits sinó també de la seva funció, com ara la citotoxicitat. L'efecte deCistancheextractees va examinar el tractament de la funció dels esplenòcits (és a dir, la citotoxicitat) en cocultius amb cèl·lules SW480. Com es mostra a la figura 4A, la citotoxicitat dels esplenòcits dels ratolins tractats ambCistancheextracteera superior a la de les cèl·lules de ratolins tractats amb vehicles, indicada pel 39,38 més el -2,64% d'alliberament de calceïna-AM en els cocultius d'esplenòcits tractats amb extracte amb cèl·lules SW480 a 6. :1 proporció, 51,11 més -2,6 per cent en una proporció de 3:1 i 57,33 més -2,53 per cent amb una proporció d'1,5:1, en comparació amb 27.75- 0,18. per cent en cocultius d'esplenòcits tractats amb vehicles amb cèl·lules SW480 en una proporció de 6:1, 40,97 =-2,85 per cent en una proporció de 3:1 i 45,16 més -0,18 per cent a una proporció de 3:1. Relació 1,5:1 (extracte vs vehicle: p <0,0001, anova="" bidireccional).="" per="" confirmar="" encara="" més="" l'efecte="" estimulador="">Cistancheextractesobre la citotoxicitat dels esplenòcits, la citotoxicitat deCistanche-extracteEs van examinar esplenòcits naïfs tractats de ratolins B6, que contenien cèl·lules T i B funcionals, en els cocultius amb cèl·lules SW480. Com es mostra a la figura 4B, l'addició deCistancheextracte(100 mg/mL) va augmentar significativament l'alliberament de calceïna-AM en els cocultius de manera dependent dels esplenòcits: 57,64 més -3,41 per cent a una proporció de 12:1, 52,25 més { {11}},77 per cent amb una proporció de 6:1 i 45,72 més -2,43 per cent amb una proporció de 3:1, en comparació amb el 14,36 més -0,05 per cent amb una proporció de 12:1 , 20,67 més -2,03 per cent en una proporció de 6:1 i 23,1 més -3,73 per cent en una proporció de 3:1 en cocultius no estimulats (extracte vs. vehicle: p < 0,0001,="" dos="" -via="" anova).="" aquests="" resultats="" ho="">Cistancheextracteestimula l'activitat lítica dels esplenòcits. Es desconeix el motiu pel qual es va observar menys citotoxicitat quan es van afegir més esplenòcits efectors. Una possibilitat era que el nivell d'alliberament de calceïna-AM en aquest sistema de cocultiu podria no reflectir exactament la mort de la cèl·lula diana perquè la calceïna-AM podria ser reabsorbida pels esplenòcits efectors després d'un llarg període d'incubació.

L'extracte de Cistanche activa els macròfags

L'activació dels macròfags és una de les respostes immunitàries crítiques contra la infecció i el desenvolupament del tumor (Mantovani et al., 2002, 2008). Per revelar més informació sobre els mecanismes pels qualsCistancheextractetractament redueix la hiperplàsia intestinal i el contingut microbià, l'efecte deCistancheextractees va examinar la producció de NO i la fagocitosi dels macròfags, les cèl·lules RAW264.7. Com es mostra a la figura 5A, l'expressió de proteïnes de NOS II es va regular a l'alça en cultius després de la incubació ambCistancheextracte. Aquests resultats es van recolzar encara més per l'augment de la producció de NO aExtracte de Cistanche estimulatcultius (Fig. 5B), evidenciat per 3,88 més -0,13 mM de nitrit en 50 mg/mL deCistancheextractecultius de cèl·lules RAW264.7 estimulats en comparació amb 0.11 més -0.12 mM de nitrit en cultius de control no estimulats (ANOVA unidireccional, p<>

La fagocitosi és un procés cel·lular d'absorció de partícules sòlides, com els bacteris. Com es mostra a les figures 5C i D, l'addició deCistancheextractesva estimular la fagocitosi dels macròfags, tal com indica que es troben més cèl·lules fagocítiques (9,8 més -0,1 per cent) aCistanche-extracte-cultius de macròfags estimulats en comparació amb els (5,2 més -0,4%) en cultius estimulats amb vehicles (extracte vs. vehicle: p=0,0007, prova t, n=3) després d'una incubació de 2 h. Aquestes dades suggereixen queCistancheextractepot activar directament els macròfags mitjançant la regulació positiva de la producció local de NO i l'estimulació de la fagocitosi dels macròfags a l'intestí dels ratolins.

DISCUSSIÓ

El present estudi demostra per primera vegada que l'administració oral deCistancheextracteredueix significativament la freqüència de la hiperplàsia i la infecció per H. hepaticus a l'intestí de ratolins propensos al càncer de còlon. L'efecte beneficiós deCistancheextracteEl tractament s'associa amb un augment del nombre i la citotoxicitat de cèl·lules NK esplèniques i macròfags. Addició in vitro deCistancheextracteestimula la producció de NO i la fagocitosi en els macròfags. Rag2 deficient de TGF-b1^-/-S'ha demostrat que els ratolins desenvolupen càncer de còlon (hiperplàsia, adenoma o adenocarcinoma) entre els 3 i els 6 mesos d'edat, i s'ha demostrat queinflamatòriaEls focus sempre estan associats a aquestes lesions tumorigèniques (Engle et al., 1999). Estudis posteriors han demostrat que en aquests ratolins es requereix el desenvolupament del càncer de còlon per a la presència de la infecció de la flora microbiana patògena perquè el càncer de còlon s'elimina completament mitjançant l'allotjament de ratolins en condicions lliures de gèrmens (Engle et al., 2002) i H. hepaticus. la infecció també indueix colitis i carcinoma d'intestí gros a Rag2-/-ratolins (Erdman et al., 2003). De la mateixa manera, en humans, l'estat microbià i la immunitat de l'hoste són els factors clau per a la progressió de la MII (Fiocchi, 1998), i s'ha informat que el carcinoma gàstric s'associa amb la infecció o inflamació crònica induïda per H. pylori (Parsonnet et al., 1991; El-Omar i Malfertheiner, 2001). Els resultats d'aquests estudis suggereixen que la infecció gastrointestinal pot tenir un paper fonamental en el desenvolupament del càncer de còlon. Així, dirigir-se a la infecció gastrointestinal pot esdevenir una estratègia terapèutica per a la prevenció o el tractament del càncer de còlon, així com de la MII. El nostre estudi demostra per primera vegada que l'administració oral deCistancheextracteredueix la freqüència deinflamatòriahiperplàsiaa l'intestí, i el nombre d'H. hepaticus a les femtes en ratolins amb deficiència de TGF-b1. L'efecte beneficiós deCistanche extractepot ser degut a la seva activació dels macròfags, com es veu per un augment tant de la producció de NO com de la fagocitosi després del tractament ambCistancheextracte(Fig. 5), que pot limitar la microflora patògena intestinal inclòs Helicobacter (Mantovani et al., 2002, 2008). Com a conseqüència, la lesió deinflamatòriahiperplàsiaes va reduir.

S'han identificat una varietat de compostos bioactius en els extractes de C. deserticola, inclosos els glucòsids feniletanoides i els polisacàrids (Jiang i Tu, 2009). Els glucòsids feniletanoides són citoprotectors, indicat pel fet que aquests compostos eviten la mort cel·lular en hepatòcits cultivats i neurones granulars cerebel·loses (Xiong et al., 1998; Pu et al., 2003). Mentre que els polisacàrids estimulen la proliferació de limfòcits T i B induïda per mitògens (Wu i Tu, 2005; Wu et al., 2005; Dong et al., 2007). Està ben documentat que els polisacàrids d'herbes modulen la resposta immune (Jiang et al., 2010).Cistancheextracteconté un 2-3 per cent de feniletanoides i un 65-70 per cent de polisacàrids, cosa que suggereix que l'efecte d'immunomodulació deCistancheextracteEl tractament podria ser degut a l'activitat immunoreguladora dels polisacàrids, la majoria de substàncies bioactives de l'extracte de Cistanche. No obstant això, les seves cèl·lules immunitàries objectiu (per exemple, macròfags o cèl·lules NK, o ambdues) i les vies moleculars requereixen una investigació addicional. A més, un estudi recent demostra que l'administració d'acetònid de feniletanoide d'herbes, un dels feniletanoides bioactius de l'extracte de C. deserticola (Xiong et al., 1996; Jiang i Tu, 2009), té un efecte beneficiós en la reducció del dextran. colitis induïda per sulfat de sodi en ratolins (Hausmann et al., 2007), que demostra que els feniletanoides (2-3 per cent) en elCistancheextractepot contribuir almenys en part a la seva eficàcia en la disminució deinflamatòriahiperplàsia, que també requereix una avaluació en el futur.
En conclusió, el càncer colorectal és un dels càncers més prevalents a tot el món i es pot prevenir en la majoria dels casos. L'ús d'extractes d'herbes no tòxics pot oferir una estratègia eficaç per a la prevenció del desenvolupament del càncer colorectal, i també es pot aplicar com a quimio-adjuvant, que pot beneficiar la millora de l'eficàcia de la quimioterapèutica contra el càncer i/o la reducció de la quimioteràpia. efectes secundaris. Les dades presentades en aquest estudi demostren clarament que el tractament amb extracte d'aigua de C. deserticola redueix la hiperplàsia i la infecció per H. hepaticus a l'intestí de ratolins propensos al càncer de còlon. Infecció per Helicobacter o intestíinflamacióhiperplàsiaés un factor de risc per al desenvolupament del càncer colorectal. El nostre estudi actual indica que l'ús d'aquesta herba pot tenir el potencial per a la prevenció i el tractament del càncer colorectal, especialment per a aquells individus que tenen IBD.

Reconeixement

YM va comptar amb el suport d'una beca d'estudiants de postgrau del Consell de Beques de la Xina.

Conflicte d'interessos

Els autors no tenen cap conflicte d'interessos.

Cistancheextractepot reduirInflamatorihiperplàsia

De: 'Reducció deInflamatoriHiperplàsiaa l'intestí en ratolins propensos al càncer de còlon per extracte d'aigua deCistanchedeserticola' de Yamin Jia,1,2 et al

---Dret d'autor © 2011 John Wiley & Sons, Ltd. Phytother. Res. 26: 812–819 (2012) DOI: 10.1002/ptr.3637

REFERÈNCIES

Burgdorf SK, Nielsen HJ, Rosenberg J. 2009. Immunotherapy in colorectal cancer. Scand J Gastroenterol 44: 261–268.
Cai RL, Yang MH, Shi Y, Chen J, Li YC, Qi Y. 2010. L'activitat antifatiga de l'extracte ric en feniletanoides deCistanchedeserticola. Phytother Res 24: 313–315.
Chao A, Thun MJ, Connell CJ, et al. 2005. Consum de carn i risc de càncer colorectal. JAMA 293: 172–182.
Cunningham D, Atkin W, Lenz HJ, et al. 2010. Càncer colorrectal. Lancet 375: 1030–1047.
Dong Q, Yao J, Fang JN, Ding K. 2007. Caracterització estructural i activitat immunològica de dos polisacàrids extraïbles en aigua freda deCistanchedeserticola YC. Ma. Carbohydr Res 342: 1343–1349.
Du C, Guan Q, Diao H, Yin Z, Jevnikar AM. 2006. L'òxid nítric indueix l'apoptosi a les cèl·lules epitelials tubulars renals mitjançant l'activació de la caspasa-8. Am J Physiol Renal Physiol 290: F1044–1054.
Dubois M, Gilles KAJK, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. 1956. Mètodes colorimètrics per a la determinació de sucres de substàncies relacionades. Anal Chem 28: 350–356.

Eaden JA, Abrams KR, Mayberry JF. 2001. El risc de càncer colorectal en la colitis ulcerosa: una metaanàlisi. Gut 48: 526–535.
El-Omar EM, Malfertheiner P. 2001. Helicobacter pylori i càncer gàstric. Curr Opin Gastroenterol 17(Suppl 1): S24-S27.
Engle SJ, Hoying JB, Boivin GP, ​​Ormsby I, Gartside PS, Doetschman T. 1999. El factor de creixement transformador beta1 suprimeix el càncer de còlon no metastàtic en una fase inicial de la tumorigènesi. Càncer Res 59: 3379–3386.
Engle SJ, Ormsby I, Pawlowski S, et al. 2002. Eliminació del càncer de còlon en ratolins amb deficiència de factor de creixement transformant 1-sense gèrmens. Càncer Res 62: 6362–6366.
Erdman SE, Poutahidis T, Tomczak M, et al. 2003. Els limfòcits T reguladors CD4 més CD25 més inhibeixen el càncer de còlon induït per microbis en ratolins amb deficiència de Rag2-. Am J Pathol 162: 691–702.
Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C, Parkin DM. 2010. Estimacions de la càrrega mundial del càncer el 2008: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer 127: 2893–2917.
Fiocchi C. 1998.Inflamatorimalaltia intestinal: etiologia i patogènesi. Gastroenterologia 115: 182–205.
Hausmann M, Obermeier F, Paper DH, et al. 2007. El tractament in vivo amb l'acteòsid feniletanoide herbari millora la inflamació intestinal en la colitis induïda per sulfat de dextrano de sodi. Clin Exp Immunol 148: 373–381.
Jiang MH, Zhu L, Jiang JG. 2010. Accions immunoreguladores dels polisacàrids de la medicina herbal xinesa. Expert Opin Ther Targets 14: 1367–1402.
Jiang Y, Tu PF. 2009. Anàlisi de constituents químics enCistancheespècies. J Chromatogr A 1216: 1970–1979.
Lin LW, Hsieh MT, Tsai FH, Wang WH, Wu CR. 2002. Anti-nociceptiu i anti-inflamatòriaactivitat provocada perCistanchedeserticola en rosegadors. J Ethnopharmacol 83: 177–182.
Lukas M. 2010.Inflamatorimalaltia intestinal com a factor de risc de càncer colorectal. Dig Dis 28: 619–624.
Mantovani A, Allavena P, Sica A, Balkwill F. 2008. Inflamació relacionada amb el càncer. Natura 454: 436–444.
Mantovani A, Sozzani S, Locati M, Allavena P, Sica A. 2002. Polarització de macròfags: macròfags associats a tumors com a paradigma per als fagòcits mononuclears M2 polaritzats. Trends Immunol 23: 549–555.
Neri S, Mariani E, Meneghetti A, Cattini L, Facchini A. 2001. Assaig de citotoxicitat de calceïna-acetoximetil: estandardització d'un mètode que permet anàlisis addicionals sobre cèl·lules efectores i sobrenedants recuperats. Clin Diagn Lab Immunol 8: 1131–1135.
Ouyang J, Wang XD, Zhao B, Wang YC. 2005. Millora de la producció de glicòsids feniletanoides perCistancheCèl·lules deserticola cultivades en un bioreactor de transport aeri de bucle intern amb un tamís. Enzyme Microb Technol 36: 982–988.
Park Y, Hunter DJ, Spiegelman D, et al. 2005. Ingesta de fibra dietètica i risc de càncer colorectal: una anàlisi conjunta d'estudis de cohorts prospectius. JAMA 294: 2849–2857.
Parsonnet J, Friedman GD, Vandersteen DP, et al. 1991. Infecció per Helicobacter pylori i risc de carcinoma gàstric. N Engl J Med 325: 1127–1131.
Pu X, Song Z, Li Y, Tu P, Li H. 2003. Acteoside fromCistanchesalsa inhibeix l'apoptosi per l'ió 1-metil-4-fenilpiridini a les neurones granulars cerebel·loses. Planta Med 69: 65–66.
Shames B, Fox JG, Dewhirst F, Yan L, Shen Z, Taylor NS. 1995. Identificació de la infecció generalitzada per Helicobacter hepaticus en femtes en colònies comercials de ratolí mitjançant cultiu i assaig de PCR. J Clin Microbiol 33: 2968–2972.
Strate LL, Syngal S. 2005. Síndromes de càncer colorectal hereditaris. Control de les causes del càncer 16: 201–213.
Von Roon AC, Reese G, Teare J, Constantinides V, Darzi AW, Tekkis PP. 2007. El risc de càncer en pacients amb malaltia de Crohn. Dis Colon Rectum 50: 839–855.
Wu TF, Hsu CY, Huang HS, Chou SP, Wu H. 2007. L'anàlisi proteòmica dels efectes del picnogenol al macròfag RAW 264.7 revela la inducció de l'expressió de la catepsina D i la millora de la fagocitosi. J Agric Food Chem 55: 9784–9791.
Wu XM, Gao XM, Tsim KW, Tu PF. 2005. Un arabinogalactan aïllat de les tiges deCistanchedeserticola indueix la proliferació de limfòcits cultivats. Int J Biol Macromol 37: 278–282.
Wu XM, Tu PF. 2005. Isolation and characterization of alpha-(1-->6)-glucans deCistanchedeserticola. J Asian Nat Prod Res 7: 823–828.
Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. 1998. Hepatoprotective activity of phenylethanoids fromCistanchedeserticola. Planta Med 64: 120–125.
Xiong Q, Kadota S, Tani T, Namba T. 1996. Antioxidative effects of phenylethanoids fromCistanchedeserticola. Biol Pharm Bull 19: 1580–1585.