Com separar l'acteòsid de Cistanche Tubulosa

Helin Xu a, Xueqin Li a,⇑ , Yanyan Hao a, Xiaobin Zhao a, Yun Cheng a, Jinli Zhang a,b

Escola de Química i Enginyeria Química/Laboratori clau per al processament verd de l'enginyeria química de Xinjiang Bingtuan, Universitat de Shihezi, Shihezi 832003, Xina

b Laboratori clau de tecnologia química verda del Ministeri d'Educació, Escola d'Enginyeria i Tecnologia Química, Universitat de Tianjin, Tianjin 300072, Xina

Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Resum

Per aconseguir una separació senzilla i eficient deacteòsid(ACT), extracció d'ACT a partir d'extractes bruts deCistanchetubulosas'investiga mitjançant un líquid iònic (IL) basat en un sistema aquós de dues fases (ATPS). L'IL-ATPS que inclou [C4mim]BF4 i (NH4)2SO4 presenta un excel·lent rendiment d'extracció, extreu gairebé tot l'ACT(Acteòsid)a la fase rica en [C4mim]BF4-. L'alta polaritat de [C4mim]BF4 que té receptors d'enllaç multi-hidrogen és propici per extreure ACT(Acteòsid)en la fase rica en IL, i (NH4)2SO4 no només proporciona un microambient àcid feble per augmentar l'estabilitat d'ACT a la fase rica en IL, sinó que també redueix la solubilitat de l'ACT(Acteòsid)en la fase rica en sal mitjançant l'efecte de sal. A més, els resultats de la simulació molecular mostren que s'extreu en la fase rica en [C4mim]BF4- mitjançant interaccions múltiples, que inclouen enllaços d'hidrogen, forces de van der Waals i apilament p–p. S'espera que aquest estudi proporcioni una referència valuosa per a la separació dels components bioactius dels productes naturals.

Paraules clau:Líquids iònics, sal, sistema aquós bifàsic, extracció,Acteòsid

ActeòsidenCistanche tubulosa

Introducció

Cistanchetubulosa(Orobanchaceae) és una planta paràsita que creix a les arrels de Tamarix i Salvadora i es distribueix principalment a les terres àrides i deserts del nord-oest de la Xina [1–3]. Les tiges de Cistanche tubulosa, conegudes com "ginseng dels deserts", estan registrades oficialment a la Farmacopea Xinesa (edició 2015) [4,5], i s'ha informat que els seus components principals són glicòsids feniletanoides (PhG), polisacàrids i iridoides.

Els compostos PhG, un grup de constituents bioactius solubles en aiguaCistanchetubulosa, posseeixen una estructura comuna composta per àcid cinàmic i fragments hidroxifeniletil que s'uneixen a un grup b-glucopiranosa mitjançant enllaços èster i glicosídic, respectivament [6].Acteòsid(ACT) és el component principal dels compostos PhG i és el component d'índex per a la determinació del contingutCistanchetubulosa[7]. Els estudis químics i farmacològics moderns han demostrat que ACT(Acteòsid)presenta múltiples activitats farmacològiques, com ara antioxidació, antifatiga, neuroprotecció i hepatoprotecció [8-10]. Així, ACT té una àmplia perspectiva d'aplicació en els camps de la medicina, la sanitat, l'alimentació, etc. No obstant això, la separació i purificació d'ACT(Acteòsid)són difícils a causa de la complexa composició dels compostos PhG, que tenen una estructura, polaritat i solubilitat similars. Actualment, els principals mètodes per a la separació i purificació d'ACT inclouen la impressió molecular, la separació de resina d'adsorció macroporosa, la cromatografia a contracorrent d'alta velocitat i la separació de membrana. Per exemple, Liu et al van utilitzar resines macroporoses per separar PhG de Cistanche deserticola, i Xu et al. va utilitzar adsorbents de carboni mesoporós per adsorbir PhG i la capacitat d'adsorció va arribar als 358,09 mg/g. Tanmateix, aquests mètodes tenen nombrosos desavantatges, com ara consum de temps, procediment complex i baixa selectivitat. Per tant, és molt desitjable el desenvolupament d'un mètode senzill i eficaç per a la separació selectiva de components bioactius dels productes naturals.

fracció de flavonoides purificada micronitzada

En els darrers anys, el sistema aquós de dues fases (ATPS), que es pot realitzar en un entorn suau i és fàcilment escalable [11–15], ha sorgit com una nova tècnica d'extracció líquid-líquid per a la separació de constituents bioactius [16]. –19]. Segons la seva composició, l'ATPS es pot dividir en tres tipus, és a dir, dos o més polímers, un polímer i una sal, o dos tensioactius [20–23]. Tanmateix, gairebé tots els polímers de formació de fases tenen una alta viscositat i un rang de polaritat estret que no afavoreixen la transferència de massa i limiten la selectivitat. En aquest context, els líquids iònics (IL) es caracteritzen per una volatilitat insignificant, estabilitat química, solubilitat integral per als compostos orgànics i la majoria dels IL són respectuosos amb el medi ambient [24–28]. Aquestes característiques fan que els IL-APTS tinguin un millor rendiment que altres ATPS per a la separació de constituents bioactius. En comparació amb l'ATPS tradicional, l'IL-ATPS reuneix els avantatges tant d'IL com d'ATPS, com ara la separació de fases ràpida, un alt rendiment d'extracció i la biocompatibilitat ambiental [12,29,30]. Actualment, IL-ATPS no s'ha aplicat a la separació i purificació d'ACT(Acteòsid), però s'ha determinat que IL-ATPS es pot aplicar en l'extracció i separació de polisacàrids [31], vainillina [32], polisacàrids d'àloe [33], saponines de ginseng [11], etc. Per exemple, He et al. va extreure saponines bioactives de ginseng mitjançant IL-ATPS, que es va demostrar com un mètode senzill i eficaç per a l'extracció de ginsenòsids amb una alta eficiència d'extracció del 99,5 per cent i un coeficient de partició de 651. Gao et al. va extreure astaxantina en la fase rica en [P4448]Br mitjançant un ATPS IL que inclou [P4448]Br i K3PO4 amb una eficiència d'extracció de fins a un 93,08 per cent [34]. Aquests resultats mostren que IL-ATPS té perspectives d'aplicació potencials per separar els constituents bioactius dels productes naturals, i es pot esperar que aconsegueixi una separació altament selectiva de l'ACT deCistanchetubulosa.

En aquest estudi, una tècnica senzilla, eficient i verda basada en l'extracció d'ATPS per a la separació altament selectiva d'ACT(Acteòsid)a partir d'extractes bruts deCistanchetubulosas'explora. Diferents IL ([C4mim][CF3SO3], [C4mim]Cl, [C4mim]BF4, [C2mim]Br, [C4mim]Br, [C6mim]Br i [C8mim]Br) i tipus de sal (NaCl, Na2SO4, Na3C6H5O7 , (NH4)2SO4 i NaH2PO4) es van investigar per determinar la IL-ATPS òptima per extreure ACT(Acteòsid). A més, es van ajustar les condicions d'extracció per aconseguir una separació altament selectiva d'ACT en la fase rica en IL. Es discuteix amb detall l'efecte de diferents condicions d'extracció (per exemple, temperatura d'extracció, concentració d'IL, concentració de solució de mostra, concentració de sal, pH i temps d'equilibri d'extracció) sobre el rendiment d'extracció d'ACT. A més, es van realitzar simulacions moleculars a l'ACT, [C4mim] BF4 i H2O per revelar el mecanisme d'extracció.

cistanche tubulosa vs deserticola

2. Experimental

2.1. Materials

Les tiges deCistanchetubulosavan ser subministrats per Cong Rongtang Biological Technology Co., Ltd. (Xinjiang, Xina). Els estàndards de l'ACT(Acteòsid)(puresa - 98 per cent, figura 1a) i equinacòsid (puresa - 98 per cent, figura 1b) van ser subministrats per Sunny Biotech Co., Ltd. (Xangai, Xina). 1-Butil-3-trifluor metanosulfonat de {-3-metilimidazoli ([C4mim][CF3SO3]), 1-butil-3-clorur de metilimidazoli ([C4mim]Cl), 1-butil{ {13}}tetrafluoroborat de metilimidazoli ([C4mim]BF4), 1-bromur d'etil-3-metilimidazoli ([C2mim]Br), 1-butil-3-bromur de metilimidazoli ([C4mim] Br), 1-hexil-3-bromur de metilimidazoli ([C6mim]Br) i 1-octil-3-bromur de metilimidazoli ([C8mim]Br) van ser subministrats per Chengjie Chemical Co. , Ltd. (Xangai, Xina). Sulfat d'amoni de grau analític ((NH4)2SO4), fosfat dihidrogen sòdic (NaH2PO4), sulfat de sodi (Na2SO4), fosfat de sodi dibàsic (Na2HPO4), fosfat d'hidrogen dipotassi (K2HPO4), clorur de sodi (NaCl) i citrat de sodi anhidre (Na37C6H5) ) van ser subministrats per Shengao Chemical Reagent Co., Ltd. (Tianjin, Xina). Aladdin Chemical Co., Ltd. (Xangai, Xina) va subministrar metanol, àcid acètic i acetonitril de grau cromatogràfic. L'etanol de grau analític va ser subministrat per Fuyu Fine Chemical Co., Ltd. (Tianjin, Xina).

Fig. 1. Estructures químiques de (a)acteòsid(ACT) i (b) enchinacòsid.

2.2. Preparació d'extractes bruts de Cistanche tubulosa

Una mostra en pols deCistanchetubulosa(20 mg) es va remullar en 500 ml d'una solució d'etanol al 50 per cent amb ultrasons durant 2 h. El residu de la solució es va separar per centrifugació a una velocitat de 5000 rpm durant 10 min. El sobrenedant després de la centrifugació es va filtrar seqüencialment amb filtres de 0,45 i 0,22 lm. A continuació, el filtrat es va concentrar i es va assecar a 323 K en un forn al buit. Finalment, el producte sec es va dissoldre en aigua i un extracte de color marró vermellósCistanchetubulosaes va obtenir.

2.3. Extracció d'ACT(Acteòsid)per IL-ATPS

Un esquema per a l'extracció eficient d'ACT(Acteòsid)per IL-ATPS es mostra a la figura 2. En conseqüència, 3,75 mL [C4mim]BF4, 3,5 mL d'aigua destil·lada, 11,11 per cent en pes de sal i 1,0 mL de solució de mostra amb la mateixa concentració d'ACT i equinacòsid. afegir a un tub de centrífuga de 50 ml. Es va preparar un altre IL-ATPS amb els mateixos components excepte la solució de mostra com a sistema de contrast. La sal d'IL-ATPS es va dissoldre completament per ultrasons i es va accelerar la formació de dues fases clares mitjançant la centrifugació a 8000 rpm durant 8 min. La fase inferior de IL-ATPS era la fase rica en IL, i la fase superior era la fase rica en sal. Els components d'ambdues fases es van analitzar quantitativament mitjançant cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC).

La concentració d'ACT(Acteòsid)i l'echinacòsid en les dues fases es va determinar per HPLC i el rendiment d'extracció es va avaluar per l'eficiència d'extracció (E, percentatge), el coeficient de partició (K) i la selectivitat (S). La següent eq. (1) es va utilitzar l'equació per calcular K

K=Cb/Ct (1)

on Cb i Ct (mg/mL) és l'ACT(Acteòsid)concentració a les fases inferior i superior, respectivament. eq. (2) i (3) es van utilitzar per calcular E i S, respectivament.

E=Cb*Vb/Mv*100 per cent (2)

S=K/Kt=Cb*Cet / Ct*Ceb (3)

on mv (mg) és el pes de l'ACT(Acteòsid)a la solució de mostra, Vb (mL) és el volum a la fase inferior, i les concentracions d'equinacòsid de Cet i Ceb a les fases superior i inferior (mg/mL), respectivament.

Fig. 2. Esquema per a l'extracció eficient d'ACT per IL-ATPS

2.4. Experiments selectius

ACTUAR(Acteòsid)i l'echinacòsid es consideren competidors per avaluar la selectivitat de IL-ATPS a ACT(Acteòsid)a causa de l'estructura molecular i propietats químiques similars de l'ACT(Acteòsid)i equinacòsid. Es van afegir 3,75 ml [C4mim]BF4, 3,5 ml d'aigua destil·lada, 11,11% en pes de sal i 1,0 ml de solució de mostra amb la mateixa concentració d'ACT i equinacòsid a un tub de centrífuga de 50 ml. La sal d'IL-ATPS es va dissoldre completament per ultrasons i es va accelerar la formació de dues fases clares mitjançant la centrifugació a 8000 rpm durant 8 min. La fase inferior de IL-ATPS era la fase rica en IL, i la fase superior era la fase rica en sal. Els components d'ambdues fases es van analitzar quantitativament per HPLC.

2.5. Anàlisi HPLC

La concentració de la solució de mostra en les dues fases es va analitzar per HPLC (2695, Waters Co., EUA) amb una columna C18 a 330 nm mitjançant un detector d'ultraviolats. Es va adoptar el mètode d'elució en gradient per separar i detectar mostres a una temperatura de columna de 303 K. Les fases mòbils eren (a) acetonitril i (b) àcid acètic/aigua (1:44, v/v) i el cabal era ajustar a 1 ml/min. La fase mòbil i les mostres es van filtrar a través d'un filtre de 0,22 lm abans de la injecció. Tots els experiments es van realitzar tres vegades i la barra d'error es mostra a totes les figures.

2.6. Caracterització

ACT, [C4mim]BF4 i la fase rica en [C4mim]BF4-es van analitzar mitjançant espectroscòpia infraroja de transformada de Fourier (FTIR) mitjançant Bruker Vertex 70 (Bruker Optics, Ltd., Alemanya). Els espectres FTIR d'ACT, [C4mim]BF4 i la fase rica en [C4mim]BF4-es van obtenir de 4000 a 500 cm 1 amb una resolució de 2 cm 1 utilitzant bromur de potassi com a referència.

2.7. Simulació molecular

Per obtenir informació sobre el mecanisme d'extracció d'IL-ATPS, així com els modes d'interacció entre ACT i [C4mim]BF4 a IL ATPS, es van realitzar càlculs de primer principi basats en la teoria funcional de la densitat (DFT). Les optimitzacions i els càlculs d'energia d'un sol punt es van realitzar mitjançant la funcional M06–2X [35,36] i es va utilitzar el conjunt bàsic 6–31 més G (d) per descriure àtoms C, H, F, B, N i O. [37]. Per simular amb precisió les interaccions febles, es va utilitzar el mètode DFT-D3 per a la descripció adequada de les interaccions dispersives [38]. Segons informes anteriors [39], es van realitzar simulacions moleculars a l'ACT, [C4mim] BF4 i H2O. En primer lloc, es van optimitzar les conformacions individuals dels models ACT i [C4mim] BF4, i després es va optimitzar la conformació d'unió de [C4mim] BF4 i ACT en funció de la seva configuració individual òptima.

Les energies d'enllaç (DE) d'ACT(Acteòsid)i [C4mim]BF4 i les energies d'unió (DE) d'ACT i H2O es van avaluar mitjançant les eqs. (4) i (5), respectivament.

△E = Ecom- (EACTUARmés EIL)
△E = Ecom - (EH2O més EACTUAR)

on EH2O, EACT, EIL i Ecom són les energies potencials de ACT(Acteòsid), [C4mim]BF4, H2O i els seus complexos, respectivament. Tots els càlculs es van realitzar mitjançant el programa Gaussian16 [40], i totes les molècules es van dibuixar mitjançant el programari VMD v.1.9.3. Mentrestant, es va establir un model de gradient independent (IGM) per identificar i quantificar l'atenuació neta del gradient de densitat electrònica al programari Multiwfn v.3.5.

ActeòsidenCistanche tubulosa

3. Resultats i discussió

3.1. Optimització de IL-ATPS

3.1.1. Projecció d'ILs

Per avaluar l'efecte del tipus d'IL en el rendiment d'extracció en IL-ATPS, es van seleccionar set tipus d'IL amb cations i anions diferents com a components de formació de fases per extreure ACT.(Acteòsid). Com es mostra a la figura 3 (a), la interacció entre anions ACT i IL es va investigar examinant la combinació de [C4mim] més com a catió amb diferents anions inclosos Br-, Cl-, [CF3SO3] - i BF{{7 }}. Els resultats van mostrar que els anions IL milloraven l'ACT(Acteòsid)rendiment d'extracció en l'ordre BF4- > [CF3SO3] - > Br- > Cl- . L'anió IL òptim era BF4, que es pot atribuir al fet que la IL corresponent pot proporcionar més receptors d'enllaç d'hidrogen per als grups hidroxil de l'ACT.(Acteòsid)que altres anions IL [21]. Això suggereix que l'enllaç d'hidrogen és la principal interacció entre els anions IL i l'ACT.

A continuació, es va investigar la combinació de Br amb diferents cations que inclouen [C2mim] plus , [C4mim] plus , [C6mim] plus i [C8mim] plus per explorar la configuració estèrica òptima entre ACT(Acteòsid)i les ILscations. Els resultats van mostrar que l'ACT(Acteòsid)El rendiment d'extracció va augmentar amb la disminució de la longitud de la cadena alquil de [C8mim] més a [C2mim] més. Com que [C2mim] plus no va formar l'ATPS corresponent amb BF4, [C4mim] plus es va seleccionar com el catió IL òptim.

Això es pot atribuir a l'alta polaritat de la cadena alquil curta de [C4mim] plus, que va ser beneficiosa per dissoldre ACT.(Acteòsid)i extreure'l en la fase rica en IL. A més, el catió imidazol de [C4mim] plus té un sistema p aromàtic, que pot formar interaccions p–p amb l'anell de benzè d'ACT per aconseguir la configuració estèreo òptima. Per tant, [C4mim] BF4 es va escollir com a òptim per als experiments següents.

3.1.2. Cribratge de sals

Per avaluar l'efecte del tipus de sal sobre l'ACT(Acteòsid)rendiment d'extracció, es van seleccionar cinc tipus de sals (NaH2PO4, (NH4)2SO4, Na2SO4, NaCl i Na3C6H5O7) per formar un IL-ATPS amb [C4mim]BF4, i els resultats es mostren a la figura 3 (b). La sal es pot dividir en sals àcides (NaH2PO4 i (NH4)2SO4), neutres (Na2SO4 i NaCl) i bàsiques (Na3C6H5O7). Es pot veure a la figura 3 (b) que mostra que (NH4)2SO4 ofereix un IL-ATPS amb un excel·lent rendiment d'extracció d'ACT. El resultat indica que la diferència en l'eficiència d'extracció, el coeficient de partició i la selectivitat s'associa amb l'estabilitat de l'ACT(Acteòsid)en els diferents microambients d'extracció.

Fig. 3. Screening d'ATPS. (a) Tipus d'IL i (b) tipus de sals

Els glucòsids dels fenols àcids de l'ACT són estables en sistemes àcids febles. Com que (NH4)2SO4 és una sal àcida, pot proporcionar un microambient àcid feble per als IL-ATPS. Això és propici per augmentar l'eficiència d'extracció i mantenir l'estabilitat de l'ACT(Acteòsid)en la fase rica en IL. A més, la capacitat de sal dels diferents tipus de sal era diferent de la del (NH4)2SO4 era més forta que la del NaH2PO4 [24,41]. La sal (NH4)2SO4 competeix amb l'ACT(Acteòsid)per a molècules d'H2O en la fase rica en sal, reduint així la solubilitat de l'ACT a la fase rica en sal, i l'ACT es pot extreure eficaçment a la fase rica en IL. Així, es va escollir (NH4)2SO4 com la sal òptima en els experiments següents.

3.2. Optimització de les condicions d'extracció en IL–ATPS

3.2.1. Efecte de la temperatura d'extracció

Segons estudis anteriors [42], la temperatura d'extracció té un impacte significatiu en el rendiment d'extracció de components bioactius en IL-ATPS, la baixa temperatura és més beneficiosa per a la formació d'IL-ATPS. La figura 4 (a) presenta l'efecte de [C4mim] BF4-(NH4)2SO4 com a IL-ATPS amb una temperatura d'extracció en el rang de 278-318 K sobre el rendiment d'extracció d'ACT.(Acteòsid). La figura 4 (a) mostra que l'eficiència d'extracció, el coeficient de partició i la selectivitat van disminuir amb l'augment de la temperatura d'extracció, cosa que indica que una condició d'alta temperatura no era adequada per a l'extracció d'ACT a IL-ATPS.

La raó es va atribuir principalment al fet que l'efecte de sal es va afeblir i va resultar que l'aigua de la fase rica en IL es transferia a la fase rica en sal en IL-ATPS a altes temperatures d'extracció [42]. A més, l'estudi dels experiments va demostrar que l'alta temperatura d'extracció no era favorable a l'existència estable de l'ACT(Acteòsid). Així, es va establir que la temperatura òptima d'extracció era de 278 K

3.2.2. Efecte de la concentració de [C4mim]BF4

La figura 4 (b) mostra l'efecte de la concentració de [C4mim]BF4 del 20 al 60 per cent en pes sobre el rendiment d'extracció de l'ACT(Acteòsid)en IL-ATPS. Com es mostra a la figura 4 (b), el rendiment d'extracció d'ACT va augmentar òbviament quan la concentració de [C4mim]BF4 va augmentar del 20 al 50 per cent en pes. Tanmateix, el rendiment d'extracció va disminuir lleugerament quan la concentració de [C4mim]BF4 va augmentar del 50 al 60 per cent en pes. Així, una concentració elevada de [C4mim]BF4 va ser favorable per extreure ACT a la fase rica en [C4mim]BF4-, però una concentració excessiva de [C4mim]BF4 per sobre del 50% en pes va provocar una disminució del rendiment d'extracció d'ACT.

Això es deu molt probablement a l'augment de la solubilitat de l'ACT a la fase rica en [C4mim]BF4-a una concentració elevada de [C4mim]BF4 a causa de l'alta afinitat entre ACT i [C4mim]BF4. Així, l'ACT es va extreure fàcilment en la fase rica en [C4mim]BF4-augmentant la concentració de [C4mim]BF4. Tanmateix, per sobre d'una concentració de [C4mim]BF4 del 50% en pes, la viscositat de l'IL-ATPS va augmentar, donant lloc a una mala transferència de massa per a l'extracció. Així, la concentració òptima de [C4mim]BF4 per extreure ACT va ser del 50% en pes.

3.2.3. Efecte de la concentració de la solució mostra

La concentració de la solució de mostra va ser una condició important per a ACT(Acteòsid)extracció. La figura 4 (c) mostra l'efecte de la concentració de la solució de mostra sobre l'eficiència d'extracció, el coeficient de partició i la selectivitat, que pot reflectir la capacitat de migració de l'ACT entre les fases superior i inferior. La figura 4 (c) mostra que l'eficiència d'extracció, el coeficient de partició i la selectivitat de l'ACT(Acteòsid)augmentat amb l'augment de la concentració de la solució de mostra de {{0}},5 a 2,5 mg/mL. Tanmateix, el rendiment d'extracció d'ACT va disminuir lleugerament amb un augment addicional de la concentració de la solució de mostra de 2,5 a 3,0 mg/mL. Una concentració elevada de solució de mostra va promoure la solubilitat de l'ACT(Acteòsid)en la fase rica en [C4mim]BF4-a causa de la forta afinitat entre ACT i [C4mim]BF4.

La disminució del rendiment d'extracció es pot atribuir als motius següents: d'una banda, un augment excessiu de la concentració de la solució de mostra no va millorar el rendiment d'extracció d'IL-ATPS quan la fase rica en [C4mim]BF4-ja era. saturat a l'ACT. D'altra banda, un augment de la concentració de la solució de mostra va provocar una millora de l'enllaç d'hidrogen intramolecular i l'agregació d'ACT(Acteòsid)molècules, que no era propici per a la transferència de massa. Així, es va determinar que la concentració òptima de solució de mostra era de 2, 5 mg/mL.

3.2.4. Efecte de la concentració de (NH4)2SO4

L'efecte de diferents concentracions de (NH4)2SO4 sobre l'eficiència d'extracció, el coeficient de partició i la selectivitat es mostra a la figura 4 (d). El resultat experimental va mostrar que els tres paràmetres augmentaven amb l'augment de la concentració de (NH4)2SO4 del 2,22 al 11,11% en pes. Tanmateix, el rendiment d'extracció ACT va disminuir amb un augment addicional de la concentració de la solució de mostra de l'11,11 al 16,66 per cent en pes.

Això es pot atribuir a l'efecte de salting-out, que és una característica clau per extreure ACT(Acteòsid)in the [C4mim]BF4-rich phase. The increase in (NH4)2SO4 concentration can increase the salting-out effect, resulting in a decrease in the solubility of ACT in the(NH4)2SO4–rich phase, which favors ACT extraction in the [C4mim]BF4-rich phase. However, an excessive increase in the(NH4)2SO4 concentration (>11,11 per cent en pes) va donar lloc a una disminució del contingut d'aigua de la fase rica en [C4mim]BF4-, cosa que debilitaria la seva afinitat per l'ACT. Això va provocar una disminució de l'eficiència d'extracció, el coeficient de partició i la selectivitat. Per tant, la concentració òptima (NH4)2SO4 va ser de l'11,11 per cent en pes.

3.2.5. Efecte del pH

L'efecte del pH sobre l'ACT(Acteòsid)L'eficiència d'extracció, el coeficient de partició i la selectivitat en IL-ATPS es van investigar en el rang de pH 2.0-7.0. Tal com s'observa a la figura 4 (e), els tres paràmetres d'extracció van augmentar a mesura que el pH augmentava de 2.0 a 6.0. Tanmateix, el rendiment d'extracció va disminuir a un pH de 7.0.

D'una banda, els glucòsids dels fenols àcids de l'ACT(Acteòsid)seria estable en un ambient àcid, mentre que es dissociaria en solucions alcalines [6]. D'altra banda, l'ACT pot experimentar ionització segons l'equilibri HA $ H més A a diferents valors de pH [33], sent la forma no ionitzada que tendeix a entrar en la fase rica en IL afavorida en condicions àcides. Per tant, l'experiment d'extracció s'ha de realitzar en un ambient moderadament àcid al pH òptim de 6.

3.2.6. Efecte del temps d'extracció

L'efecte del temps d'extracció sobre l'ACT(Acteòsid) extraction efficiency, partition coefficient, and selectivity were explored in the range of 10–200 min. As can be seen from Fig. 4 (f), the ACT extraction performance increased with the extraction time, and the maximum extraction efficiency (>99%), partition coeffificient (>35), and selectivity (>225) es van obtenir als 130 min. A més, ACT(Acteòsid)es va trobar que era estable en un microambient àcid feble durant molt de temps. Per tant, es va seleccionar 130 min com a temps d'extracció òptim.

3.3. Mecanisme d'extracció d'ACT amb [C4mim]BF4–(NH4)2SO4 ATPS

3.3.1. Anàlisi FTIR

La figura 5 mostra els espectres FTIR d'ACT(Acteòsid), [C4mim]BF4 i la fase rica [C4mim]BF4-. Tal com es mostra a l'espectre FTIR de [C4mim] BF4, els pics a 3162 i 3122 cm 1 es poden atribuir a la vibració d'estirament simètrica de CAH i a la vibració d'estirament asimètrica de CAH de l'imidazol, respectivament. La banda de 1012 cm 1 es pot assignar a la vibració d'estirament de BF4-.

A l'espectre FTIR de la fase rica en [C4mim]BF4-, no van aparèixer nous pics en comparació amb l'espectre FTIR d'ACT(Acteòsid)i [C4mim]BF4. Tanmateix, el pic característic de BF4- a 1012 cm- 1 es va traslladar a una freqüència més alta a causa de l'enllaç d'hidrogen entre l'ACT i els àtoms F. A més, els pics característics de CAH a 3162 i 3122 cm 1 es van desplaçar a freqüències més baixes. Això es pot atribuir a dues raons: (1) la formació d'un enllaç d'hidrogen entre l'ACT i l'àtom de N a [C4mim] més, i (2) la formació d'apilament p–p entre l'anell de benzè de l'ACT i l'anell d'imidazol. de [C4mim] més. Aquest resultat era coherent amb els resultats de la simulació molecular.

Fig. 5. Espectres FTIR de l'ACT, [C4mim]BF4 i la fase rica en [C4mim]BF4-.

3.3.2. Simulació molecular

Per explorar el mecanisme d'extracció, possibles modes d'interacció entre ACT(Acteòsid)i [C4min] més, BF4- i H2O es van investigar mitjançant simulacions moleculars. La figura 6 mostra els modes d'interacció òptims i la conformació d'unió d'ACT–[C4min] plus, ACT–BF4 i ACT–H2O. Com es mostra a la figura 6a–h, ACT i [C4mim] plus havien mostrat dues conformacions d'unió òptimes, és a dir, ACT–[C4mim] més –1 i ACT–[C4mim] més –2, ACT i BF4 tenien una conformació d'unió òptima. , ACT–BF4- i ACT i H2O tenien les cinc conformacions d'unió òptimes ACT–H2O–1, ACT–H2O–2, ACT–H2O–3, ACT–H2O–4 i ACT–H2O–5.

A més, es pot invocar l'energia d'unió per explicar les interaccions entre dues molècules. Segons els resultats de la simulació molecular, les energies d'unió d'ACT–[C4mim] més –1, ACT–[C4mim] més –2, ACT–BF4, ACT–H2O–1, ACT–H2O–2, ACT–H2O–3 , ACT–H2O–4 i ACT–H2O–5 eren - 129,71, - 136,53,-130,82, - 60,78, - 53 .00, - 76,76, -66,55 i -53,49 kJ/mol, respectivament. Aquests valors suggereixen que l'energia d'unió de [C4mim]BF4 era més forta que la de les molècules d'H2O. Així, ACT tenia una alta afinitat per [C4mim] BF4 i va entrar fàcilment a la fase rica en [C4mim] BF4.

Per investigar més les interaccions entre les diferents molècules, es van il·lustrar els modes d'interacció d'ACT–[C4min] més, ACT–BF4- i ACT–H2O mitjançant l'anàlisi IGM. Com es mostra a la figura 6a i b, la interacció entre ACT(Acteòsid)i [C4mim] a més de composaven principalment enllaços d'hidrogen i forces de van der Waals. A més, ACT–[C4mim] més –1 i ACT–[C4mim] més –2 mostraven característiques conformacionals similars, amb l'anell de benzè de l'ACT i l'anell d'imidazol de [C4mim] més paral·lels entre si i situats a distància. d'uns 4 Å. Això indica l'existència d'una interacció d'apilament d'aplicacions entre ACT(Acteòsid)i [C4mim] més [43]. La figura 6c revela la presència de forts enllaços d'hidrogen i interaccions de van der Waals entre ACT i BF4-. A més, com es mostra a la figura 6d–h, quan l'ACT es va dissoldre en H2O, les molècules d'ACT i H2O es van unir principalment mitjançant enllaços d'hidrogen i van der Waals. Així, sobre la base de les característiques conformacionals i dels valors d'energia d'unió, es pot concloure que l'ACT es va extreure en la fase rica en [C4mim]BF4- mitjançant enllaços d'hidrogen, interaccions de van der Waals i apilament p - p.

Fig. 6. Anàlisi IGM de les interaccions ACT–[C4min] més, ACT–BF4- i ACT–H2O: (a) ACT–[C4mim] més –1, (b) ACT–[C4mim] més –2, (c) ACT–BF4, (d) ACT–H2O–1, (e) ACT–H2O–2, (f)ACT–H2O–3, (g) ACT–H2O–4 i (h) ) ACT–H2O–5.

3.4. Extracció d'extracte cru

En condicions òptimes d'extracció, es va utilitzar l'IL-ATPS per investigar l'extracció d'extracte cru. Com es mostra a la taula 1, IL-ATPS pot extreure eficaçment ACT(Acteòsid)d'extracte cru deCistanchetubulosaa la fase rica en IL, i IL-ATPS gairebé no té cap canvi en el rendiment d'extracció d'ACT(Acteòsid)de l'extracte brut en comparació amb el rendiment d'extracció de la solució estàndard. Per tant, aquest mètode pot extreure eficaçment ACT(Acteòsid)de l'extracte cru deCistanchetubulosa, que pot proporcionar una referència per a l'extracció de constituents bioactius en el futur.

3.5. Separació de l'ACT de la fase rica en IL

Mètodes d'extracció i adsorció de dissolvents per a la recuperació d'ACT(Acteòsid)i la reutilització de IL s'exploren en aquesta secció. En primer lloc, es van considerar dissolvents orgànics per a l'extracció posterior, com n-butanol (NBA), acetat d'etil (EA), isopentenil (IPA) i cloroform (CR). No obstant això, l'eficiència de recuperació dels extractants orgànics va ser baixa, tal com es mostra a la figura 7. A més, es va utilitzar un gran nombre d'extractants orgànics volàtils per a l'extracció posterior, cosa que afectarà la característica "verda" del procés de separació.

Es va seleccionar el mètode d'adsorció per a la separació de l'ACT(Acteòsid)de la fase rica en IL, com ara el carboni mesoporós ordenat (CMK-3), el grafè (GR) i els nanotubs de carboni de paret única (SWCNT). La fase rica en IL després de l'extracció de IL-ATPS es va diluir 10 vegades amb aigua desionitzada. Les eficiències de recuperació dels tres adsorbents anteriors es van comparar per a ACT en les mateixes condicions d'adsorció de la següent manera: relació sòlid-líquid d'1: 1 (mg/mL), 303 K i 12 h.

Com es mostra a la figura 7, la recuperació de SWCNT va ser millor que la de CMK-3 i GR. A més, l'eficiència de desorció de l'ACT(Acteòsid)pot arribar al 95,3 per cent utilitzant metanol, àcid acètic i aigua ultrapura amb una proporció de volum d'1:1:8 a 318 K. Per tant, SWCNT es pot utilitzar per a la recuperació de l'ACT de la fase rica en IL.

Fig. 7. Efecte de tipus amb diferents extractants i adsorbents per a la separació d'ACT(Acteòsid)de la fase rica en IL.

4. Conclusions

En aquest estudi, un mètode senzill i eficaç basat en IL-ATPS per a l'extracció d'ACT(Acteòsid)dels extractes bruts deCistanche tubulosaes va desenvolupar amb èxit. Es va determinar que la IL-ATPS òptima era [C4mim]BF4–(NH4)2SO4, i les condicions òptimes d'extracció eren una temperatura d'extracció de 278 K, una concentració d'IL del 50 per cent en pes, una concentració de solució de mostra de 2,5 mg/ml, una concentració de sal de l'11,11 per cent en pes, un pH de 6,0 i un temps d'equilibri d'extracció de 130 min. En les condicions òptimes d'extracció, l'eficiència d'extracció, el coeficient de partició i la selectivitat d'ACT(Acteòsid)es va trobar que era del 99,78 per cent ± 0,84 per cent, 33,82 ± 1,82 i 230,51 ± 8,26, respectivament. Per tant, en conclusió, el sistema [C4mim]BF4-(NH4)2SO4 ofereix un mètode senzill i eficaç per a la separació altament selectiva de l'ACT dels extractes bruts deCistanchetubulosa. La sal àcida (NH4)2SO4 proporciona un microambient àcid feble per garantir l'estabilitat de l'ACT(Acteòsid)a la fase rica en [C4mim]BF4-. A més, l'elevada polaritat de [C4mim]BF4 que té receptors d'enllaços d'hidrogen múltiples és propici per extreure ACT a la fase rica en [C4mim]BF4-. Finalment, es va demostrar que les interaccions ACT i [C4mim]BF4 comprenien enllaços d'hidrogen, forces de van der Waals i apilament p-p. Aquest estudi proporciona informació per a futures investigacions sobre la separació altament selectiva de compostos fenòlics de plantes naturals.

Declaració de contribució de l'autoria de CRedit

Helin Xu: Conceptualització, Metodologia, Investigació, Curació de dades, Redacció - esborrany original, Redacció - revisió i edició. Xue qin Li: Conceptualització, Administració de projectes, Redacció - revisió i edició, Supervisió. Yanyan Hao: curació de dades, redacció -revisió i edició. Xiaobin Zhao: Recursos, anàlisi formal. YunCheng: Recursos, anàlisi formal. Jinli Zhang: administració de projectes, redacció - revisió i edició.

Declaració d'interès competitiu

Els autors declaren que no tenen interessos financers o relacions personals que poguessin haver influït en el treball que es descriu en aquest article.

Agraïments

Aquest treball va comptar amb el suport del Regional Science Found de la National Natural Science Foundation de la Xina [grant number22068032]; Fundació Nacional de Ciències Naturals per a Joves Científics de la Xina [subvenció número 21706166]; Programa per a líders joves i de mitjana edat en innovació científica i tecnològica a Bingtuan [subvenció número 2019CB024]; el Programa per a Joves Talents Innovadors de la Universitat de Shihezi [número de subvenció CXRC201802] i el projecte principal de ciència i tecnologia de Xinjiang Bingtuan [número de subvenció 2017AA007/01]. Volem agrair al Centre d'anàlisi i proves de la Universitat de Shihezi la microscòpia i la microanàlisi dels nostres exemplars.

antocianina

Referències

[1] X. Wang, X. Wang, Y. Guo, Determinació ràpida simultània de sis components efectius enCistanchetubulosaper espectroscòpia d'infrarojos propers, Molecules 22 (2017) 843, https://doi.org/10.3390/molecules22050843.

[2] Y. Yan, Q. Song, X. Chen, J. Li, P. Li, Y. Wang, T. Liu, Y. Song, P. Tu, Determinació simultània de components amb àmplia polaritat i rangs de contingut enCistanchetubulosautilitzant cromatografia d'interacció hidrofílica de fase inversa acoblada en sèrie i espectrometria de masses en tàndem, J. Chromatogr. 1501 (2017) 39–50
[3] W. Zhang, J. Huang, W. Wang, Q. Li, Y. Chen, W. Feng, D. Zheng, T. Zhao, G. Mao, L. Yang, X. Wu, Extracció, purificació , caracterització i activitats antioxidants dels polisacàrids a partirCistanchetubulosa, Int. J. Biol. Macromol. 93 (2016) 448–458,
[4] Y. Song, Q. Song, J. Li, N. Zhang, Y. Zhao, X. Liu, Y. Jiang, P. Tu, Una estratègia integrada per diferenciar quantitativament el quimioma entre Cistanche deserticola i C. tubulosa utilitzant cromatografia líquida d'alt rendiment–espectrometria de masses híbrida triple quadrupol-trampa d'ions lineal, J. Chromatogr. 1429 (2016) 238–247
[5] W. Pei, R. Guo, J. Zhang, X. Li, Extraction of phenylethanoid glycosides fromCistanche tubulosaper extracció d'homogeneïtzació de cisalla a alta velocitat, J. AOAC Int. 102 (2019) 63–68
[6] H. Xu, W. Pei, X. Li, J. Zhang, Highly eficient adsorption of phenylethanoid glycosides on mesoporous carbon, Front. Chem. 7 (2019)
[7] PL Liao, CH Li, LS Tse, JJ Kang, YW Cheng, Avaluació de la seguretat delCistanchetubulosaMemòria de producte d'alimentació saludable: prova de genotoxicitat i 28-dia de toxicitat a dosis repetides, Food Chem. Toxicol. 118 (2018) 581–588
[8] YJ Shiao, MH Su, HC Lin, CR Wu, Echinacoside millora el deteriorament de la memòria i el dèficit colinèrgic induït pels pèptids beta-amiloide mitjançant la inhibició de la deposició d'amiloide i la toxicologia, Food Funct. 8 (2017) 2283–2294

[9] H. Shimada, Y. Urabe, Y. Okamoto, Z. Li, A. Kawase, T. Morikawa, P. Tu, O. Muraoka, M. Iwaki, Major constituents ofCistanchetubulosa, equinacòsid iacteòsid, inhibeixen la captació de glucosa mediada pel cotransportador de glucosa depenent del sodi 1- per les cèl·lules epitelials intestinals, J. Funct. Foods 39 (2017) 91–95

[10] W. Li, R. Deng, X. Jing, J. Chen, D. Yang, J. Shen,Acteòsidmillora l'encefalomielitis autoimmune experimental mitjançant la inhibició de l'activació de la mitofagia mediada per peroxinitrits, Free Radicals Biol. Med. 146 (2020) 79–91,

[11] A. He, B. Dong, X. Feng, S. Yao, Extracció de saponines bioactives de ginseng mitjançant sistemes aquosos de dues fases de líquids i sals iònics, setembre de Purif. Tecnol. 196 (2018) 270–280
[12] E. Suarez Garcia, CA Suarez Ruiz, T. Tilaye, MHM Eppink, RH Wijffels, C. van den Berg, Fractionation of proteins and carbohydrates from crude microalgae extracts using an iònic liquid based-aquous twophase system, setembre . Purif. Tecnol. 204 (2018) 56–65,
[13] L. Wang, W. Li, Y. Liu, W. Zhi, J. Han, Y. Wang, L. Ni, Separació verda de bromelina en mostra d'aliments amb una alta retenció de l'activitat enzimàtica utilitzant una solució aquosa reciclable de dos sistema de fases que conté un nou copolímer termosensible sintetitzat i sal, Food Chem. 282 (2019) 48–57
[14] A. Tighrine, Y. Amir, P. Alfaro, M. Mamou, C. Nerín, Extracció i anàlisi simultània de conservants i edulcorants artificials en sucs mitjançant el mètode d'extracció líquid-líquid abans de la cromatografia líquida d'ultra-alt rendiment. , Química dels Aliments. 277 (2019) 586–594

[15] H. Shaker Shiran, M. Baghbanbashi, F. Ghazizadeh Ahsaie, G. Pazuki, Study of curcumin partitioning in polymer-sal aquous twophase systems, J. Mol. Liq. 303 (2020) 112629

[16] X. Wu, R. Li, Y. Zhao, Y. Liu, Separació de polisacàrids de Spirulina platensis per HSCCC amb etanol-sulfat d'amoni ATPS i les seves activitats antioxidants, Carbohydr. Políma. 173 (2017) 465–472

[17] VP Priyanka, RL Gardas, Sistemes bifàsics aquosos basats en líquids iònics mono i dicationics per a l'extracció de diclofenac sòdic, Set. Purif. Tecnol. 234 (2020) 116048
[18] J. Flieger, A. Czajkowska-Zelazko, Sistema aquós de dues fases basat en líquid iònic per a l'aïllament de quinina de la mostra de plasma humà, Food Chem. 166 (2015) 150–157
[19] X. Zhang, G. Teng, J. Zhang, sistema bifàsic aquós d'etanol/sal basat en extracció assistida per ultrasons de polisacàrids de Lilium David Ivar. unicolor Salisb: caracterització fisicoquímica i propietats antiglicació, J. Mol. Liq. 256 (2018) 497–506,
[20] Q. Liu, X. Chen, Y. Guo, C. Han, J. Li, L. Jia, J. Liu, X. Wei, Estudi termodinàmic dels sistemes aquosos de dues fases de 1- tetrafluoroborat de butil-3-metilimidazoli i dodecilbenzè sulfonat de sodi, J. Mol. Liq. 279 (2019) 18–22,
[21] DCV Belchior, MV Quental, MM Pereira, CMN Mendonça, IF Duarte, MG Freire, Performance of tetraalkylammonium-based ionic liquids as constituents of aqueous biphasic systems in the extraction of ovoalbumin and lysozyme, Sep. Purif. Tecnol. 233 (2020)

[22] CA Suarez Ruiz, J. Kwaijtaal, OC Peinado, C. van den Berg, RH Wijffels, MHM Eppink, Multistep fractionation of microalgal biomolecules using selective aqueous two-phase systems, ACS Sustainable, Chem. Eng. 8 (2020) 2441–2452,

[23] AW Vieira, G. Molina, AB Mageste, GD Rodrigues, LR de Lemos, Partitioning of salicylic and acetylsalicylic acids by aqueous two-phase systems: mechanism aspects and optimization study, J. Mol. Liq. 296 (2019) 111775
[24] L. Ran, C. Yang, M. Xu, Z. Yi, D. Ren, L. Yi, Extracció aquosa millorada en dues fases de proantocianidines de llavors de raïm mitjançant l'ús de líquids iònics com a adjuvants, Set. Purif. Tecnol. 226 (2019) 154–161

[25] LA Mejía-Manzano, BA Barba-Dávila, P. Vázquez-Villegas, SO SernaSaldívar, J. González-Valdez, Improved extraction of the natural anticancerigen pristimerin from Mortonia greggii root bark using green solvents and aqueous twophase systems, Set. Purif. Tecnol. 211 (2019) 667–672