Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Millora de la producció de glicòsids feniletanoides mitjançant un elicitor de fongs en cultiu de suspensió cel·lular de Cistanche deserticola

Cui-tao Lu¹,∗ & Xing-guo Mei²

Paraules clau Cistanche deserticola, elicitador de fongs,glucòsid feniletanoide, cultiu de cèl·lules vegetals

Resum
Quan, al 15è dia de creixement, un elicitor deFusarium solanies va afegir a 40 mg l^-1 aCistanche deserticolacultius de suspensió cel·lular, el contingut d'echinacòsid, acteòsid i totalglicòsids feniletanoides(PeGs) a les cèl·lules cultivades van augmentar durant els propers 27 dies en més d'un 100 per cent fins a 15 mg g^-1pes sec, 9 mg g-1 pes sec i 57 mg g^-1 pes sec, respectivament. La biomassa final (1,3 mg de pes sec ml^-1) no es va veure afectat.

Cistanche deserticola

Introducció

Cistanche deserticolaMa. (Orobanchaceae), una herba autòctona de la Xina s'utilitza àmpliament en la medicina tradicional per a diversos tractaments, inclòs l'ús com a sedant o intensificador de la resposta immune (Hsu et al. 1995, Chang et al. 1995).Glicòsids feniletanoides(PeG) són els principals metabòlits bioactiusCistanche deserticola(Xiong et al. 2000) i es componen de molts components com ara equinacòsid, acteòsid, cisacteòside, isoacteòside, 2-acetilacteòsid, cistanòsid A i osmantuside B (Wang et al. 2000). Amb l'augment de la demanda d'aquests productes i el ràpid descensCistanche deserticolaplantes, el cultiu cel·lular seria un mitjà de producció alternatiu atractiu. Molts elicitors (especialment els elicitors de fongs) poden millorar la producció de metabòlits en el cultiu de cèl·lules vegetals (Wang et al. 2001). Li et al. (1998) van trobar que un elicitador de fongs de Fusarium solani va aïllar els sistemes radiculars de tots dosCistanche deserticolai el seu amfitrió, Halaxylon ammodendron, podria millorar el contingut d'aminoàcids en calli deCistanche deserticolaPerò els canvis del contingut de PeG en aquesta línia de callos no es van esmentar en el seu estudi. En aquest article, es van estudiar els efectes d'un elicitor de F. solani sobre la biosíntesi de PeG totals i dos PeG bioactius principals (echinacòsid i acteòsid), i sobre els canvis del creixement cel·lular en el cultiu en suspensió deCistanche deserticola.

Materials i mètodes

Cultius de cèl·lules vegetals
El call es va induir a partir d'escales deCistanche deserticolai es manté en el medi B5 de Gamborg (1968) complementat amb 0,5 mg d'àcid indol-3-acètic l^-1, 2 mg de kinetina l^-1,i 1 g d'hidrolitzat de caseïna l^-1. El pH es va ajustar a 6 abans de l'esterilització. Tots els experiments es van realitzar en matràs de batut de 250 ml, cadascun contenint 100 ml de medi en un agitador rotatiu (120 rpm i 25 graus) a la foscor. L'inòcul era d'uns 100 g de pes fresc l^-1.

contingut efectiu de cistanche deserticola--glucòsid feniletanoide

Preparació d'elicitors de fongs

La separació de la soca de fongs, Fusarium solani i la preparació de l'elicitador de fongs es van realitzar tal com es va descriure anteriorment (Li et al. 1998, Yu et al. 2001). Es van afegir diverses quantitats (equivalents d'hidrats de carboni) d'elicitador de fongs als cultius de matràs agitats el dia 15 (el període de cultiu total va ser de 42 d).

Assaig d'acumulació i viabilitat de biomassa
Les cèl·lules d'un matràs d'agitació es van rentar amb aigua destil·lada i es van liofilitzar fins a un pes constant. Així es va determinar el pes sec. La viabilitat cel·lular (percentatge de cèl·lules viables en una població cel·lular) es va determinar mitjançant la reducció del clorur de 2,3,5-trifenil tetrazoli (Towill i Mazur 1975).

glucòsid feniletanoidedecistanche deserticola

Determinació del contingut d'echinacòsid, acteòsid i totalglicòsids feniletanoides(PeGs)
L'extracció de PeG es va realitzar segons el mètode de Du & Liu (1993). LiofilitzatCistanche deserticolaLes cèl·lules es van extreure amb etanol al 70% (v/v). La fracció d'etanol es va concentrar, es va desgreixar amb acetat d'etil saturat d'aigua i després es va lixiviar amb n-butanol saturat d'aigua. La fracció n-butanol es va concentrar, es va dissoldre en aigua, es va carregar en una columna de resina macroporosa (AB-8, producte químic de la Universitat de Nankai, Tianjin, Xina) i es va eluir amb aigua i metanol, successivament. Es va recollir la fracció de metanol i es va determinar el contingut total de PeG utilitzant echinacòsid com a estàndard a 334 nm. L'echinacòsid i l'acteòsid es van determinar mitjançant la columna Nova Pak C18 (250 × 4, 6 mm) en un sistema HPLC (aigües) amb un detector d'UV (334 nm).

Resultats

Efecte de l'elicitador de fongs sobre l'acumulació de biomassa i la biosíntesi total de PeGs Els efectes de l'elicitador de fongs sobre la biomassa cel·lular i l'acumulació total de PeGs depenien de la dosi afegida (equivalents d'hidrats de carboni). Com es mostra a la figura 1, les dosis més baixes d'elicitor eren favorables al pes sec deCistanche deserticolacèl · lules. El pic va ser amb l'elicitor a 20 mg l^-1(donant 1,76 mg de pes sec ml^-1).
L'acumulació total de PeG es va millorar significativament per l'elicitador de fongs entre 20 mg l^-1i 80 mg l^-1. Elicitor a 40 mg l-1 va obtenir el rendiment més alt (57 mg g^-1), que va ser més del doble de l'obtingut en la cultura de control no elicitor. L'experiment posterior va utilitzar l'elicitador de fongs a 40 mg1^-1.

Fig. 1. Pes de cèl·lules seques i acumulació total de PeGs en cultiu de cèl·lules en suspensió deCistanche deserticolaen resposta a diverses dosis d'elicitador de fongs. El dia 15 es va afegir un elicitador de fongs al medi. Les mostres es van prendre després de 27 dies més. ▲, pes final de cèl·lules seques; ◆, el contingut total de PeG. Els valors són mitjans de resultats per triplicat i les barres d'error representen desviacions estàndard.

Curs temporal del creixement cel·lular i biosíntesi de PeGs
La figura 2 mostra el curs temporal de la viabilitat cel·lular i la biosíntesi de PeGs (echinacòsid i acteòsid) de cèl·lules en suspensió després que els cultius fossin sotmesos a un 40 mg l.^-1elicitor de fongs el 15 d. En els 27 d de cultiu posteriors, equinacòsid i acteòsid, els dos principals PeG bioactius enCistanche deserticola, tots dos van augmentar considerablement. El dia 39 es van aconseguir ambdues acumulacions màximes, arribant als 14,7 mg g^-1pes sec i 8,9 mg g^-1 pes sec, respectivament. No es va observar una diferència significativa en la viabilitat cel·lular entre els cultius tractats amb elicitor i el control.

Fig. 2. Viabilitat cel·lular i biosíntesi d'equinacòsid i acteòsid en cultiu de cèl·lules en suspensió deCistanche deserticoladesprés del tractament amb 40 mg l^-1elicitador de fongs. L'elicitor fúngic es va afegir al medi el 15 d.◆, tractat amb echinacòsid amb elicitor; ◇, control d'equinacòsid; ●, tractat amb acteòsids amb elicitor;○,

control d'acteòsids; ▲, viabilitat cel·lular tractada amb elicitor;△, control de viabilitat cel·lular. Els valors són mitjans de resultats per triplicat i les barres d'error representen desviacions estàndard.

Discussió

Molts components derivats dels fongs (fragments de paret cel·lular, polisacàrids, oligosacàrids, glicoproteïnes, etc.) s'han utilitzat com a diversos elicitadors de fongs en la producció de metabòlits secundaris amb moltes espècies de cèl·lules vegetals. En aquest article, l'homogeneïtat (composat principalment per polisacàrids) de la soca de fong Fusarium solani aïllat dels sistemes radiculars deCistanche deserticolai Halaxylon ammodendron es va demostrar que era un elicitador eficaç per a la biosíntesi de PeGs en el cultiu cel·lular deCistanche deserticola. L'ús d'aquest elicitador per estimular la síntesi de PeGs a les cèl·lules no només va ser important, sinó que es va mostrar poc després de l'elicitació. Aquesta conclusió coincideix amb alguns estudis anteriors sobre cultiu de cèl·lules vegetals (Wang et al. 2001).

En l'estudi anterior de Li et al. (1998), quan es va afegir un elicitor de fongs de F. solani al medi de cultiu, el call induït a partir de les llavors deCistanche deserticolapodria romandre viu en la subcultura posterior a llarg termini, i la producció d'iridoides es podria millorar. Va indicar que les cèl·lules cultivades podrien sintetitzar metabòlits secundaris de resistència a les malalties quan són atacades per microorganismes. Tot i que els iridoides no es van determinar en el nostre experiment, hem demostrat que els polisacàrids de F. solani es podrien utilitzar com a elicitadors de fongs efectius en la producció de PeG ambCistanche deserticolacèl · lules.

contingut efectiu de cistanche deserticola--glucòsid feniletanoide

De: ' Millora deglicòsids feniletanoidesproducció per un elicitor fúngic en cultiu de suspensió cel·lular deCistanche deserticola' de Cui-tao Lu¹,∗ & Xing-Guo Mei²

----Biotechnology Letters 25: 1437–1439, 2003. © 2003 Kluwer Academic Publishers. Imprès als Països Baixos.

Referències

Chang Y, Wu H, Wang SN, Cheng HC (1995) Estudi dels efectes forts deCistanche deserticolaMa., Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck. i Cistanche tubulosa (Schenk) R Wight. Xina J. Chin. Mater. Med. 26: 143–146.
Du NS, Liu JL (1993) Determinació deglicòsids feniletanoidesenCistanche deserticolamitjançant espectrofotometria de resina macrovesicular. Nat. Prod. Res. Desenvolupar. 5: 30–33.

Gamborg OL, Miller RA, Ojima K (1968) Requisits de nutrients dels cultius en suspensió de cèl·lules d'arrel de soja. Exp. Res cel·lular 50: 151–158.

Hsu WH, Chu SH, Sheng LC, Yuan KW, Mao CN (1995) Estudi dels components químics i els efectes farmacològics deCistanche deserticolaMa. i salsa Cistanche (CA Mey) G. Beck. Barbeta. Tradit. Herba. Drogues 26: 143–146.

Li S, Wu X, Dong XC, Zheng X, Zheng JH, Lou ZC (1998) Efecte de l'elicitador de Fusarium solani sobre el contingut d'aminoàcids deCistanche deserticolacallositat. Xina J. Northwest Pharm. 13: 247–248.
Towill LE, Mazur P (1975) Estudis de la reducció del clorur de 2,3,5-trifeniltrazoli com a assaig de viabilitat per a cultius de teixits vegetals. Llauna. J. Bot. 53: 1097–1102.
Wang CG, Wu JY, Mei XG (2001) Millora de la producció i l'excreció de Taxol en el cultiu de cèl·lules de Taxus Chinensis mitjançant l'obtenció de fongs i la renovació del medi. Appl. Microbiol. Biotecnologia. 55: 404–410.
Wang YM, Zhang SJ, Luo GA, Hu YN, Hu JP, Liu L, Zhu Y, Wang HJ (2000) Anàlisi deglucòsid feniletanoideen l'extracte d'herbes Cistanchis per LC/ESI-MS/MS. Acta Pharm. Sin. 35: 839–842.
Xiong QB, Yasuhiro Tezukay, Takuji Kaneko, Li HY, Le Quan Tran, Koji Hase, Tsuneo Namba, Shigetoshi Kadota (2000) Inhibició de l'òxid nítric per feniletanoides en macròfags activats. Eur. J. Pharm. 400: 137–144.
Yu LJ, Lan WZ, Qin WM, Xu HB (2001) Efectes de l'àcid salicílic sobre la peroxidació de lípids de membrana induïda per l'elicitador de fongs i la producció de Taxol en cultius de suspensió cel·lular de Taxus Chinensis. Proc. Bioquímica. 37: 477–482.