Efectes hipoglucèmics i hipopolidèmics de les antocianines de nabius per activació d'AMPK: estudis in vitro i in vivo part 1

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

Resum:Els nabius són rics en antocianines bioactives, amb un alt nivell de malvidina, que s'associa a beneficis antioxidants que contribueixen a reduir el risc de diabetis. L'objectiu d'aquest estudi va ser investigar els efectes hipoglucèmics i hipolipidèmics de l'extracte d'antocianina de nabiu (BAE),malvidina(Mv), la malvidina-3-glucòsid (Mv{-3-GLC) i la malvidina{-3-galactosid (Mv{-3-gal) tant a la línia cel·lular d'hepatocarcinoma humà HepG2 com a una dieta de greixos que combina ratolins diabètics induïts per estreptozotocina. El tractament amb glucosa alta va augmentar significativament l'estrès oxidatiu hepàtic fins a 6- vegades i va disminuir la viabilitat de les cèl·lules HepG2. El pretractament amb BAE, Mv, Mv-3-glc i Mlv-3-gal va mitigar significativament aquests danys en reduir les espècies reactives d'oxigen (ROS) en un 87, 80, 76 i 91 per cent i augmentant la viabilitat cel·lular en un 88, 79, 73 i 98 per cent, respectivament. Aquests pretractaments també van inhibir eficaçment la hiperglucèmia i la hiperlipèmia, respectivament, reduint els nivells d'expressió dels enzims que participen en la gluconeogènesi i la lipogènesi i millorant els implicats en la glicogenòlisi i la lipòlisi, mitjançant la via de senyalització de la proteïna cinasa activada amb monofosfat d'adenosina (AMPK) a les cèl·lules HepG2. Per determinar, el paper de l'AMPK en la reacció induïda per BAE del metabolisme de la glucosa i dels lípids in vivo, dosis de 100 mg/kg (extractes d'antocians de nabiu -concentració baixa, BAE-L) i 400 mg/kg (extractes d'antocians de nabiu -alta concentració). , BAE-H) es van administrar al dia a ratolins diabètics durant 5 setmanes. Els tractaments amb BAE van tenir un efecte significatiu (P<0.05) effect="" on="" body="" weight="" and="" increased="" the="" ampk="" activity,="" achieving="" the="" decrease="" of="" blood="" and="" urine-glucose,="" as="" well="" as="" triglyceride="" and="" total="" cholesterol.="" this="" research="" suggested="" that="">antociansva contribuir a l'extracte de nabius induïthipoglucèmiai els efectes hipolipidèmics en diabetis i BAE podrien ser un aliment funcional prometedor o un medicament per al tractament de la diabetis.

Feu clic aquí per saber-ne més

1. Introducció

La diabetis mellitus (DM) és una malaltia coneguda que normalment es caracteritza per la incapacitat per mantenir els nivells normals de glucosa en sang. Aquest trastorn metabòlic crònic causa greus danys a la salut humana i imposa una gran càrrega financera als sistemes sanitaris de tot el món [1]. Aquesta malaltia es classifica en dos tipus principals segons la causa de la desregulació de la glucosa en sang. La DM tipus 1 és causada per la destrucció autoimmune de les cèl·lules beta que condueix a una incapacitat per produir insulina, mentre que la diabetis tipus 2 es caracteritza per la resistència a la insulina que els receptors d'insulina, que tenen una funció reduïda, no permeten que les cèl·lules responguin adequadament a l'augment de la glucosa en sang.

Cistanche pot millorar la immunitat

A més de la hiperglucèmia, els diabètics solen tenirhiperlipidèmiaambdues condicions poden provocar danys a òrgans i teixits mitjançant un augment de l'estrès glioxidatiu [2]. La producció d'insulina i el dany del receptor d'insulina es troben entre els factors que causen hiperglucèmia en els diabètics. Al fetge, la sobreexpressió de la gluconeogènesi i la glicogenòlisi torna a alliberar la glucosa al torrent sanguini [3] mentre que, a l'intestí prim, la sobreexpressió del transportador de glucosa 2 (GLUT2) provoca un augment del transport de glucosa [4]. La hiperlipidèmia causada per la sobreexpressió de la lipogènesi en el teixit adipós [5] també pot provocar un deteriorament de la captació de glucosa estimulada per la insulina i la síntesi de glucogen que condueix a la resistència a la insulina i, per tant, contribueix a la progressió de la diabetis [6]. Les complicacions a llarg termini relacionades amb la diabetis afecten diversos òrgans i inclouen hipertensió, aterosclerosi, retinopatia, nefropatia, úlceres del peu i neuropatia perifèrica [7].

Actualment no hi ha cura per a la diabetis, però els seus efectes es poden alleujar [8]. Per a les persones diagnosticades de diabetis tipus 1, el tractament habitual és una combinació de regulació de la dieta i una ingesta adequada d'insulina segons els hidrats de carboni consumits. Els reptes actuals per als diabètics tipus 1 inclouen la incapacitat o dificultats per estimar els carbohidrats totals i la dosi adequada d'insulina; tanmateix, gairebé idealglucèmicEls nivells són possibles donat el progrés tecnològic, incloses les bombes d'insulina [9]. Per als pacients que pateixen diabetis tipus 2, el tractament pot ser més complex, incloent combinacions de regulació de la dieta, exercici, insulina i altres fàrmacs amb una varietat de mecanismes d'acció que funcionen per reduir la glucosa en sang[10]. La recomanació dietètica comuna és seguir una dieta baixa en carbohidrats [11,12].

El nabiu és una de les fruites que poden consumir els pacients diabètics i podria disminuir el risc de patir diabetis mellitus tipus 2 (DM2)[13,14]. Els nabius són rics en una gran varietat de compostos beneficiosos per a la salut humana, com ara minerals, àcids orgànics de fibra, àcids fenòlics i flavonoides, inclosos flavonols i antocians [15,16]. Tanmateix, els perfils típics d'antocians inclouen els galactòsids, glucòsids i arabinòsids de la delfinidina, la malvidina, la cianidina, la petunidina i la peonidina [17], amb la malvidina i les delfinidines que solen ser els principals contribuents al contingut total d'antocianes [18,19]. En el nostre estudi anterior [20], la malvidina va ser l'antocianidina més abundant que es trobava en l'extracte de fruites de nabiu d'ull de conill juntament amb la delfinidina, la cianidina, la petunidina i la peonidina, que està d'acord amb altres autors que també van trobar que la malvidina era un contribuent important al contingut total d'antocianes. en diferents tipus de nabius [17,21].

Les antocianines de nabiu poden millorar la sensibilitat a la insulina mitjançant la capacitat antioxidant i altres interaccions reguladores, ja que els seus efectes no es poden explicar completament per les primeres [13,22]. Els estudis també han trobat els beneficis de les antocianines de nabius per a altres problemes relacionats amb la diabetis. En un estudi in vitro, Huang et al. [23] va trobar que les antocianines de nabius tenien efectes antiinflamatoris i antioxidants sobre les cèl·lules de la retina humanes en condicions de glucosa alta. Les cèl·lules exposades a glucosa alta tenien una viabilitat del 64 per cent, mentre que quan s'exposaven a extracte d'antocianina de nabiu, malvidina, malvidina-glucòsid o malvidina-galactosid, la seva viabilitat era del 7-9 per cent, del 83 per cent, del 91- per cent o del 91- percentatge. {11}} per cent, respectivament. D'altra banda, Song et al. [24] va trobar que les antocianines de nabius reduïen l'estrès oxidatiu i la inflamació a la retina de rata diabètica. Les rates amb diabetis van rebre 20, 40 i 80 mg/kg d'antocianines de nabius per via oral durant 12 setmanes. Les rates amb dosis altes d'antocians de nabiu tenien una glucosa en sang més baixa, una capacitat antioxidant més alta i una menor inflamació a la retina i espècies reactives d'oxigen més baixes en comparació amb les que no tenien antocianines de nabiu.

Tot i que les antocianines de nabiu ofereixen beneficis per a la salut al fetge i altres òrgans per als diabètics, les accions hipoglucèmiques i hipolipidèmiques de l'extracte d'antocianina de nabiu (BAE) a les cèl·lules hepàtiques humanes no estan clares. En el present estudi, s'ha especulat que BAE, així com Mv, Mv-3-glc i Mv-3-gal, tenen activitats hipoglucèmiques i hipolipidèmiques en cèl·lules d'hepatocarcinoma humà (HepG2) i ratolins i que podria mantenir l'homeòstasi dels glucolípids alleujant així el desenvolupament de la diabetis.

2. Materials i mètodes

2.1. Química i reactius

Els nabius d'ull de conill de Brightwell (Vaccinium ashei es van collir de Fujiabian Orchard Picking (Nanjing, Xina) i els seus extractes d'antocians es van obtenir i emmagatzemar a la foscor a {{0}} grau. El reactiu 3- (4,5 dimetiltiazol-2-il){-2,5 difenil-2bromur de H-tetrazoli (MTT) i els estàndards malvidina (Mv), malvidina-3-glucosa (Mv{ {11}}glc) i malvidina-3-galactosa (Mv-3-gal) es van obtenir de Sigma Aldrich (Xangai, Xina). Cèl·lules primàries HepG2, kit d'assaig de proteïnes d'àcid bicinconínic (BCA) i millorat Els reactius de detecció de Western Blotting de quimioluminescència (ECL) es van adquirir de CW Biotechnology (Beijing, Xina). El sèrum fetal boví (FBS), el medi Eagle modificat de Dulbecco (DMEM) i la penicil·lina-estreptomicina es van adquirir a Gibco (Auckland, Nova Zelanda). BioFroxx L'estreptozotocina (STZ) es va comprar a Saiguo Biotech (Guangzhou, Xina) i el kit de detecció de diacetat de dicloro-dihidrofluoresceïna (DCFH-DA) es va comprar a l'Institut Tecnològic de Beyo-time (Shan). Ghai, Xina). L'albúmina sèrica bovina (BSA) es va adquirir a Shyuanye (Xangai, Xina). Els aliments rics en greixos i sucres (greixos 35,5 per cent, proteïnes 20 per cent, hidrats de carboni 36,4 per cent, 0,1 per cent de cel·lulosa) i els aliments normals (greixos 4,5 per cent, proteïnes 23 per cent, hidrats de carboni 31,9 per cent, 3,7 per cent de fructosa i 5,3 per cent). cel·lulosa) per a ratolins es van obtenir de Xietong Bioengineering Co., Ltd (Nanjing, Xina). Els kits d'assaig d'insulina, triglicèrids (TG), colesterol total (TCHD, glutatió peroxidasa (GSH-Px) i superòxid dismutasa (SOD) es van comprar a Jiancheng Bioengineering Research Institute (Nanjing, Xina). AndyGene human Forkhead Box O1 (FOXO1) , glucosa-6-fosfatasa (G6Pase), glicogen sintasa-fosforilació (p-GS), glicogen sintasa cinasa-3 beta-fosforilació (p-GSK3 ), transportador de glucosa 2 (GLUT2), acetil coenzim A carboxilasa (ACC), triglicèrid lipasa sensible a hormones (HSL), 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzim reductasa (HMGCR) i kits d'assaig immunoabsorbent lligat a enzims d'insulina en dejuni (ELISA) de ratolí es van comprar a Bluegene Biotech (Xangai, Xina) Els productes químics i reactius utilitzats en aquest estudi eren tots de graus analítics purs.

2.2. Anticossos

Els anticossos primaris contra GS, p-GS (Ser641), proteïna d'unió a elements reguladors d'esterols -1c (SREBP-1c) i fosfoenolpiruvat carboxicinasa (PEPCK) es van adquirir a Abcam (Cambridge, Regne Unit) . Anticossos primaris contra proteïna cinasa alfa activada per adenosina monofosfat (AMPKa), p-AMPK a (Thr172), receptor-y-coactivador activat per proliferador de peroxisomes-1 (PGC-1), ACC, p- ACC (Ser79) i anticossos secundaris conjugats amb peroxidasa de rave picant (HRP) es van comprar a Cell Signaling Technology (Beverly, MA, EUA). L'anticossos contra la gliceraldehid 3-fosfat deshidrogenasa (GAPDH) es va comprar a Nanjing Beidi Biomed Technology (Nanjing, Xina) mentre que l'anticossos contra l'actina es van comprar a Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Els anticossos primaris es van utilitzar a les dilucions 1:1000 mentre que les dilucions 1:4000 es van utilitzar per als anticossos secundaris.

2.3. Preparació d'extracte d'antocianina de nabiu (BAE)

L'extracció d'antocianines de nabiu es va realitzar mitjançant el nostre mètode anterior de Huang et al. [25]. Els nabius d'ull de conill congelats es van mantenir a temperatura ambient fins que es van descongelar. A continuació, es van batre a 10 000 rpm durant 30 s amb un homogeneïtzador bàsic ULTRA-TURRAX T18 (IKA Works Guangzhou, Xina). A continuació, es va remullar una quantitat de 250 g de nabius en una solució de 1000 ml de metanol que contenia 1 per cent de HCl durant 24 h. L'extracte es va recollir després de la centrifugació a 5000 × g durant 15 min. Després de l'evaporació del dissolvent a 40 graus al buit, el residu es va extreure amb acetat d'etil 1:1 (v/v) tres vegades. La fase aquosa que contenia antocians es va recollir i concentrar mitjançant evaporació al buit per obtenir l'extracte d'antocians brut. L'extracte es va purificar més amb resina macroporosa AB-8 (Sigma Aldrich, Xangai, Xina). Per eliminar la fructosa i les proteïnes, l'extracte es va sotmetre a cromatografia en columna sobre 1000 g de resina macroporosa AB-8 durant 24 hores d'absorció i després es va eluir amb aigua doble destil·lada. La fracció d'antocianina es va eluir amb etanol al 80 per cent que contenia una solució de HCl a l'1 per cent, es va concentrar al buit i després es va assecar amb un liofilitzador Eyela FDU-1200 (Tokyo Rikakikai, Japó) per obtenir un extracte d'antocianina de nabiu (BAE) pols.

2.4. Cultiu cel·lular i tractaments

Les línies cel·lulars HepG2, derivades d'un carcinoma hepatocel·lular humà específic, tenen una proporció elevada de proteïnes específiques del fetge. Per aquest motiu, s'utilitzen habitualment com a models de laboratori per a estudis de cèl·lules hepàtiques humanes [26]. Les cèl·lules HepG2 es van cultivar en DMEM que contenia D-glucosa normal (5, 5 mM) complementada amb un 10 per cent de FBS i un 1 per cent de penicil·lina-estreptomicina i es van mantenir a una incubadora d'atmosfera de 37 graus C i un 5 per cent de CO2 (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA). Després d'arribar al 70-80 per cent de confluència, les cèl·lules HepG2 es van subcultivar. Quatre hores abans de l'experiment, les cèl·lules HepG2 es van posar en calma en un medi sèric reduït. Després del pretractament amb 5 ug/mLof Mv, Mv-3-glc, Mv-3-gal o BAE durant 24 h, les cèl·lules es van exposar a concentracions de glucosa normals (5,5 mM) o altes (30 mM) a imiten condicions normals i diabètiques. Les cèl·lules es van preparar per a l'anàlisi Western Blot i els sobrenedants es van recollir per a l'anàlisi ELISA.

2.5. Animals i disseny experimental

Els ratolins mascles sans C57BL/6J (20 ± 2 g) de GemPharmatech (Nanjing, Jiangsu, Xina) es van mantenir en condicions estàndard de laboratori, incloent una temperatura constant de 25 graus i una alternança de 12- h i nit. El Subcomitè de l'Acadèmia de Ciències Agràries de Jiangsu sobre la cura i l'ús dels animals de recerca havia aprovat prèviament tots els procediments experimentals amb animals. Es va utilitzar una dieta alta en greixos i estreptozotocina (STZ) per induir T2DM en els models animals segons el mètode utilitzat per Islam i Loots [27]. Tots els ratolins van ser alimentats amb una dieta alta en greixos i sucre, excepte el grup control que va consumir una dieta normal. Després de 4 setmanes, els ratolins es van dejunar durant 12 hores i es van injectar per via intraperitoneal amb 100 mg/kg de STZ dissolts en solució tampó de citrat de sodi (pH 4.2-4.5). Una setmana després de la inducció STZ, es van prendre mostres de sang de la vena de la cua dels ratolins que havien dejunat durant la nit. Els ratolins que presentaven símptomes diabètics com poliúria, polidipsia i hiperglucèmia (nivell de glucosa en sang en dejú > 11,1 mmol/L) es van reconèixer com a T2DM i es van utilitzar per a estudis futurs. Per comprovar l'estabilitat del model T2DM, tots els ratolins van ser alimentats amb una dieta normal durant una setmana. Els ratolins normals es van utilitzar com a grup control. Els ratolins diabètics es van dividir aleatòriament en tres grups: model, BAE de dosis baixa (100 mg/kg) i BAE de dosi alta (400 mg/kg). Durant 6 dies consecutius, es va administrar l'administració intragàstrica del mateix volum de dissolvent (100 μL), 100 mg/kg o 400 mg/kg de BAE al grup control, al grup model, al BAE a dosis baixes i BAE a dosis altes. respectivament. El setè dia es va mesurar el pes corporal i la glucosa en sang en dejú. La mateixa administració intragàstrica va continuar durant 5 setmanes. Els ratolins es van dejunar durant la nit i es van recollir mostres de sang per a la preparació de sèrum de la vena cava inferior i es van emmagatzemar a -20 grau. Després de la presa de mostres de sang, tots els ratolins van ser anestesiats i sacrificats. Els teixits del fetge, la melsa, el ronyó i el tim dels ratolins es van extreure, es van pesar i es van emmagatzemar a -80 graus per a més experiments.

2.6. Detecció de la viabilitat cel·lular

La viabilitat cel·lular es va determinar mitjançant el mètode MTT. Es van utilitzar cinc ug/ml de Mv, Mv{0}}glc, Mv-3-gal o BAE per al pretractament de cèl·lules durant 24 h. A continuació, es van tractar les cèl·lules amb 5 mMor 30 mM de glucosa durant 24 hores i es van afegir 10 μL 0,5 per cent (5 mg/mL) de MTT a les cèl·lules que després es van tornar a cultivar. Després de 4 h, es va eliminar la solució MTT i es van afegir 100 μL de sulfòxid de dimetil (DMSO) abans que la mescla s'agités lentament durant 10 min per dissoldre el cristall cel·lular. L'absorbància a 490 nm es va mesurar en un lector de microplaques StatFax-2100 (Awareness Tech-nology Inc., Plam, FL, EUA) per obtenir els valors de densitat òptica (OD). Les cèl·lules cultivades amb nivells normals de glucosa (5, 5 mmol/L) es van utilitzar com a grup control, mentre que els pous sense cèl·lules es van utilitzar com a blanc. Es va utilitzar la fórmula següent per determinar la viabilitat cel·lular: viabilitat cel·lular (percentatge)=(valor de DO del grup de mostra - valor de DO del grup en blanc)/(valor de DO del grup de control - valor de DO del grup en blanc) x 100 per cent .

2.7. Visualització de fluorescència ROS

Les espècies reactives d'oxigen (ROS) a les cèl·lules HepG2 es van avaluar mitjançant el kit de detecció DCFH-DA. Després d'un tractament inicial amb 5 ug/mL de Mv, Mv-3-glc, Mv-3-gal o BAE durant 24 h, que després va ser seguit d'un tractament de 5 mM o 30 mM de glucosa durant 24 h, les cèl·lules es van rentar amb PBS, i després es van afegir 10 μM de DCFH-DA a cada pou i es van deixar reaccionar durant 20 min a 37 graus. Les cèl·lules es van tornar a rentar a fons amb PBS i després es va observar immediatament un grup d'aquestes cèl·lules sota un microscopi fluorescent invertit IX53 (Olympus, Tòquio, Japó) a 530 nm d'emissió i filtres d'excitació de 485 nm. Les imatges es presenten amb un augment de 200 ×. Després de la dissociació, es va recollir un altre grup de cèl·lules i es va registrar la seva fluorescència mitjançant un lector de microplaques multimode Synergy H4 (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, EUA). Es va observar la intensitat total de fluorescència de les cèl·lules de cada pou i es va mesurar la generació de ROS com a plec del control.

2.8. ELISA

Els kits ELISA es van utilitzar per quantificar proteïnes implicades en la gluconeogènesi (FOXO1, G6Pase, p-GS), la glicogenòlisi (p-GSK3), el transportador de glucosa (GLUT2), la lipogènesi (ACC i HMGCR) i la lipòlisi (HSL) en els sobrenedants d'HepG2. cèl · lules. També es va determinar la quantitat de GLUT2 en fetges de ratolins. El kit d'assaig de proteïnes BCA es va utilitzar per quantificar la proteïna cel·lular total del sobrenedant. L'absorbància a 450 nm es va mesurar a 37 graus en un lector de microplaques StatFax-2100 (Awareness Technology Inc., Plam, FL, EUA) per determinar els nivells de proteïnes.

2.9. Anàlisi de Western Blotting

Es va realitzar Western blotting en lisats d'HepG2 per mesurar el nivell de proteïnes d'AMPK, p-AMPK, gluconeogènesi (PGCl, PEPCK, glicogenòlisi (GS, p-GS) i lipòlisi (ACC, p-ACC, SREBP{{4}). }c) a les cèl·lules. També es va realitzar Western blotting per determinar les quantitats d'AMPK,p-AMPK en els fetges de ratolins induïts per diabetis. Es va utilitzar GAPDH o -Actina com a control de càrrega. Imatge LAS-3000 (Fuji, Tòquio, Japó) es va utilitzar per observar les bandes de proteïnes, i la seva densitat es va quantificar mitjançant el programari Bio Profile 1D plus plus (Vilbert Lour-mat, Marne La Vallee, França) Totes les dades es van expressar com un canvi de plec a el control.

2.10. Assaig de glucosa en sang en dejuni i de tolerància a la glucosa

La glucosa en sang en dejú es va mesurar un cop per setmana durant un període de 5 setmanes després d'un període de dejuni de 12-h. Per a l'assaig de tolerància a la glucosa, els ratolins es van dejunar durant 16 hores i es van alimentar amb 2 g/kg de glucosa al 20 per cent (200 μL) intragàstricament (ig) per determinar la glucosa en sang a 0. ,0,5,1,1,5 i 2h. La sang es va recollir de la vena de la cua i es van mesurar els nivells de glucosa amb un glucòmetre (Sinocare, Changsha, Xina). El nivell de glucosa a l'orina dels ratolins que van rebre ig també es va mesurar durant un període de cinc setmanes.

2.11. Estimació dels índexs bioquímics sèrics i de l'activitat enzimàtica en el fetge de ratolins

Es va mesurar la quantitat d'insulina, triglicèrids i colesterol total en el sèrum, mentre que l'activitat enzimàtica SOD i GSH-PX es va estimar mitjançant els kits comercials segons el protocol del fabricant. L'absorbància a 500 nm per als triglicèrids (TG) i el colesterol total (TCH) i 450 nm per als altres (insulina, SOD i GSH-PX) es va mesurar a 37 graus en un lector de microplaques StatFax-2100 (tecnologia de consciència). Inc., Plam, FL, EUA).

2.12. Anàlisi estadística

Totes les dades es presenten com a valor mitjà ± desviació estàndard (SD) d'almenys tres experiments independents. Les xifres es van obtenir mitjançant GraphPad Prism Versió 8 (GraphPad Software, Inc., CA, EUA). Es van realitzar anàlisis unidireccionals de la variància (ANOVA), proves t o la prova de comparacions múltiples de Sidak per determinar diferències estadístiques entre diferents grups. Les diferències es van considerar significatives a P<>

Aquest article està extret de https://doi.org/10.1016/j.redox.2021.102100 Rebut el 21 de juliol de 2021; Rebut en forma revisada el 9 d'agost de 2021; Acceptat l'11 d'agost de 2021