La hipotèrmia induïda per l'oxcarbazepina després d'una isquèmia transitòria del cervell anterior exerceix una neuroprotecció terapèutica a través del potencial de receptors transitoris tipus vanilloide tipus 1 i 4 en gerbils part 3

4. Materials i Mètodes

4.1. Animals d'experimentació

Els gerbills mascles (nombre total=252) es van utilitzar als 6 mesos (pes corporal, 63-78 g). Els gerbils es van criar al Centre d'Animals Experimentals de la Universitat Nacional de Kangwon (Chuncheon, Corea).

Els gerbils són uns animals molt macos. Viuen en zones desèrtiques, són bons per excavar coves i tenen un fort instint per emmagatzemar i localitzar aliments. Entre aquests nois, els gerbils mascles tenen una memòria especialment bona, cosa que fa que la gent vulgui conèixer els seus secrets.

En primer lloc, quan els gerbills mascles busquen menjar, utilitzen una sèrie de senyals com ara punts de referència i terreny per determinar la direcció. Mitjançant l'observació i la pràctica a llarg termini, han establert el seu propi "sistema d'informació geogràfica". En canvi, les femelles tenen una pitjor memòria per a aquests senyals, especialment en un entorn en constant canvi.

En segon lloc, els gerbils masculins també mostren una forta memòria quan lluiten contra enemics naturals. Segons els científics, quan els gerbils estan amenaçats, ràpidament entraran al cau i intentaran escapar. Però quan s'enfronten a la mateixa amenaça, els gerbils mascles recordaran el mode d'atac dels enemics naturals i els evitaran, augmentant les seves possibilitats de supervivència.

Finalment, el record dels gerbills mascles també rau en el seu comportament social entre ells. Cada gerbil té la seva olor única. Quan es trobin amb altres gerbils, utilitzaran el seu olfacte per identificar la identitat i l'estat dels altres. Aquesta capacitat de memòria no només permet als gerbils establir una connexió social relativament estable sinó que també és una garantia important per a la seva reproducció.

En resum, la relació entre els gerbils mascles i la memòria és inseparable. En el procés de recerca de supervivència i reproducció a la natura, confien en la seva forta memòria per adaptar-se constantment a l'entorn i millorar-se. Com a humans, hauríem d'aprendre d'aquests nois i perfeccionar constantment la nostra memòria per adaptar-nos millor a aquest món en constant canvi. Es pot veure que hem de millorar la nostra memòria, i Cistanche pot millorar significativament la memòria perquè també pot regular l'equilibri de neurotransmissors, com l'augment dels nivells d'acetilcolina i factors de creixement, que són molt importants per a la memòria i l'aprenentatge. A més, Cistanche també pot millorar el flux sanguini i promoure el lliurament d'oxigen, cosa que pot garantir que el cervell obtingui suficient nutrició i energia, millorant així la vitalitat i la resistència del cervell.

Feu clic a Saber per augmentar la potència de la memòria

Per a aquest estudi, el Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals va aprovar el protocol experimental (núm. d'aprovació KW-200113-1; data d'aprovació, 18 de febrer de 2020).

El protocol de recerca s'adhereix a les directrius suggerides a les "Lleis i polítiques internacionals actuals" de la Guia per a la cura i l'ús d'animals de laboratori publicada per The National Academies Press (8a ed., 2011).

4.2. Grups Experimentals, Inducció de tFI i Tractaments HyT i OXC

Per demostrar els efectes protectors de l'OXC contra la lesió isquèmica després de FI en gerbills, els gerbills es van dividir en sis grups: (1) grup simulat + vehicle (n=24); (2) grup tFI + vehicle (n {{5} }}); (3) grup sham+HyT (n=24); (4) grup tFI+HyT (n=60); (5) grup sham+OXC (200 mg/kg) (n=24); i (6) grup tFI+OXC (n=60).

Set i cinc gerbills dels tres grups tFI es van utilitzar per a l'anàlisi de Western blot i l'examen histològic, respectivament, als 30 min, 12 h, 1 dia, 2 dies i 4 dies després de l'operació tFI, i en els tres grups simulats, set i cinc. es van utilitzar gerbils als 30 min i 4 dies després de l'operació simulada per minimitzar els nombres. En aquest experiment, el tFI es va desenvolupar tal com es va descriure anteriorment [34].

En resum, els gerbills es van anestesiar amb un 2,5% d'isoflurà (en un 32% d'oxigen i un 68% d'òxid nitrós). Sota anestèsia, ambdues artèries caròtides comunes es van aïllar de la beina caròtida i ocluïdes amb clips d'aneurisma (Yasargil FE 723K) (Aesculap, Alemanya, ) durant cinc minuts.

L'aturada perfecta del subministrament de sang al cervell es va confirmar mitjançant l'observació del flux sanguini arterial a les dues artèries de la retina (branques de les carotidartèries internes) mitjançant un oftalmoscopi (HEINE K180®) de Heine Optotechnik (Herrsching, Alemanya).

La temperatura corporal abans i durant la cirurgia en tots els grups es va controlar a normotèrmia (37 ± 0.2 ◦C) mitjançant una manta termomètrica. Després de cinc minuts d'oclusió, es van retirar els clips.

En aquest estudi, es va fer una operació simulada sotmetent-los a la mateixa cirurgia tFI sense l'oclusió de les artèries caròtides comunes. Es va controlar l'HyT en els dos grups sham+HyT i tFI+HyT (similar al canvi de temperatura corporal en el tFI+). grup OXC) per refredament de tot el cos amb un paquet de gel durant sis hores.

La temperatura corporal dels dos grups sham + OXC i tFI + OXC es va registrar durant sis hores després de la injecció intraperitoneal immediata de 200 mg/kg OXC (Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, EUA) després de l'operació tFI.

La dosi d'OXC es va seleccionar a partir d'un estudi anterior que informava que 200 mg/kg d'OXC va protegir eficaçment contra la mort cel·lular al cervell després de [36]. Per registrar el canvi de temperatura corporal, es va mesurar la temperatura corporal al recte cada una hora després de tFI un període de 6 h, a temperatura ambient ambient (uns 22 ◦C).

Els gerbills van rebre un temps de recuperació de quatre dies després del tFI perquè les cèl·lules piramidals situades a la regió CA1 de l'hipocamp comencen a morir quatre dies després del tFI [30,34,62].

4.3. Prova SMA

La prova SMA es va realitzar per examinar els canvis en la hiperactivitat en tots els grups. En resum, tal com es va descriure anteriorment [63], la prova SMA es va fer el dia 1 després del tFI, ja que l'activitat locomotora arriba al punt més alt el dia 1 després de la lesió isquèmica després del tFI.

Els gerbills de tots els grups van rebre una adaptació ambiental durant dues hores, i es van col·locar en una gàbia de camp obert (amplada, 44 cm; llarg, 44 cm; alçada, 30) obtinguda d'Ugo Basile SRL (Gemonio, Itàlia), en la qual dos horitzontals paral·lels. Es van instal·lar raigs infrarojos 4 × 8 del terra durant una hora. SMA es va registrar mitjançant un Photobeam Activity System-Home Cage de San Diego Instruments (San Diego, CA, EUA).

El moviment (trajectòria i distància total recorreguda) es va detectar mitjançant la interrupció de la matriu de feixos infrarojos produïts per les fotocèl·lules.

SMA es va controlar contínuament durant una hora i les dades es van recollir mitjançant un analitzador AMB d'IPC Electronics (Cumbria, Regne Unit).

La recollida de dades es va iniciar 15 minuts després de l'habituació a la gàbia de camp obert. Finalment, els resultats obtinguts es van avaluar com la distància (metres) de moviment en el període de prova (una hora).

4.4. Proves de Funcions Cognitives

4.4.1. RAMT

Per comparar la memòria espacial entre tots els grups, el RAMT es va dur a terme segons estudis anteriors [38,44]. Per a aquesta prova es va utilitzar un laberint de braços 8-radials de Stoelting Co (Wood Dale, IL, EUA).

L'instrument del laberint constava d'una plataforma central i vuit braços (cada braç d'amplada, 5 cm; alçada, 9 cm; llarg, 35 cm). Els gerbils s'entrenaven un cop al dia durant tres dies abans del.

És a dir, l'alimentació de pellets obtinguda de DBL Co (Chungbuk, Corea) es va col·locar a l'extrem de cada braç i cada gerbil es va col·locar a la plataforma central. Després, el gerbil va buscar l'alimentació.

Després de l'operació simulada o tFI, la prova real es va realitzar un cop al dia durant quatre dies a partir d'un dia després de l'operació.

Per a l'anàlisi, es va avaluar el nombre d'errors, amb un error cada vegada que el gerbil entrava en un braç que ja s'havia visitat abans. La prova es va acabar quan el gerbil va consumir el pinso.

4.4.2. PAT

Per comparar la memòria a curt termini entre els grups, el PAT es va dur a terme segons els mètodes informats anteriorment [64, 65] amb algunes modificacions. En resum, els gerbils es van provar amb el Gemini Avoidance System (GEM 392) de San Diego Instruments (SanDiego, CA, EUA), que consta de dos compartiments (fosc i clar) que es comuniquen entre si mitjançant una porta lliscant verticalment.

Les sessions experimentals es van realitzar en dues fases: una sessió d'entrenament i una sessió de prova real realitzada un dia abans i quatre dies després de l'operació tFI o simulada.

La prova real es va realitzar 20 minuts després de la sessió d'entrenament mesurant el temps de latència (segons) durant l'estada a la cambra fosca. És a dir, a la sessió d'entrenament, el gerbil es va permetre explorar els dos compartiments lliurement durant un minut mentre s'obria la porta. .

Després, quan el gerbil va entrar al compartiment fosc, es va tancar la porta i el gerbí va rebre una descàrrega elèctrica al peu (0,5 mA) des d'una reixa d'acer a terra durant cinc segons.

A la sessió de prova real, el dia 4 després del tFI, el gerbil es va col·locar al compartiment de llum i es va registrar el temps de latència al compartiment de llum abans d'entrar al compartiment fosc.

4.5. Anàlisi Western Blot per a TRPV1 i TRPV4

Per examinar els nivells d'expressió de TRPV1 i TRPV4 a l'hipocamp de gerbil CA1, es va realitzar la tècnica de Western blot segons els mètodes descrits anteriorment [66, 67].

Breument, segons el calendari designat (30 min, 12 h, 1 dia, 2 dies i 4 dies després de l'operació simulada o tFI), els gerbils (n=5 per a cada grup) van rebre anestèsia per a l'eutanàsia mitjançant injecció intraperitoneal amb 200 mg/kg de pentobarbital sòdic (JW Pharm.Co., Ltd., Seül, Corea).

Després, els seus cervells es van recollir i homogeneïtzar amb solució salina tamponada amb fosfat de 5{0 mM (PBS, pH 7,4) que contenia 0,1 mM etilenglicol-bis (èter aminoetílic)-N, N, N{{ 11}}, àcid N0-tetraacètic (EGTA) (pH 8.0), àcid etilendiaminotetraacètic (EDTA) 1{0 mM (pH 8,0), 0,2% Nonidet P{{17 }}, 15 mM de pirofosfat de sodi, 100 mM de glicerofosfat, 2 mM d'ortovanadat de sodi, 50 mM de NaF, 150 mM de NaCl, 1 mM de fluorur de fenilmetilsulfonil (PMSF) i 1 mM de ditiotreitol (DTT).

A continuació, es van centrifugar les mostres i es van prendre els sobrenedants per determinar els nivells de proteïnes mitjançant un kit d'assaig Micro BCA de Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, EUA) amb albúmina sèrica bovina de Pierce Chemical Co (Rockford, IL, EUA).

Les alíquotes que incloïen 2 0 µg de proteïna total es van bullir en tampó de càrrega, 150 mM de Tris (pH 6,8) que contenia un 6% de sulfat de sodi dodecil (SDS), 3 mM de DTT, 0,3% de blau de bromofenol i 30% de glicerol.

Les mostres es van separar mitjançant electroforesi en gel de poliacrilamida SDS al 10% (PAGE). A continuació, es van transferir els gels a membranes de nitrocel·lulosa de Pall Co (East Hills, NY, EUA) a 350 mA i 4 ◦ C durant 90 min.

Per bloquejar la tinció inespecífica, les membranes es van incubar amb llet desgreixada al 5% durant 60 min a temperatura ambient. A continuació, es van immunoreaccionar amb cada anticòs primari: conill anti-TRPV1 (diluït 1:1000) (Abcam, Cambridge, Regne Unit), conill anti-TRPV4 (diluït 1:1000) (Abcam) i conill anti- - actina (diluïda 1:2000) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) a 4 ◦ C durant 7 h.

Posteriorment, es van fer reaccionar amb IgG anti-conill d'ase conjugada amb peroxidasa de rave picant (HRP) (diluït 1:4500) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) a temperatura ambient durant 1 h.

Finalment, es va utilitzar un kit de quimioluminescència basat en aluminol de Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, EUA) per millorar la visualització.

Tal com es va descriure anteriorment [68], les immunoblots de TRPV1 i TRPV4 es van analitzar mitjançant el programari Scion Image de Scion Crop (Frederick, MD, EUA). Es van escanejar les bandes i es va realitzar una anàlisi densitomètrica. Els nivells de proteïnes es van normalitzar en comparació amb el nivell corresponent d'actina.

4.6. Preparació de Seccions Histològiques

Per als exàmens immunohistoquímics i histopatològics, els gerbils (n=7 per a cada grup) es van sacrificar d'acord amb el calendari designat (30 min, 12 h, 1 dia, 2 dies i 4 dies després de l'operació tFI o simulada).

Tal com es va descriure anteriorment [34], els gerbils es van anestesiar profundament amb pentobarbital sòdic (200 mg/kg) (JW Pharmaceutical, Seül, Corea). Sota anestèsia, els gerbils es van esbandir transcardialment amb solució salina tampó fosfat 0, 1 M (pH 7, 4) i es van fixar amb paraformaldehid al 4% (en tampó fosfat 0, 1 M, pH 7, 4).

Posteriorment, es van obtenir els seus cervells i es van fixar posteriorment amb el mateix fixador durant sis hores. A continuació, es van tallar els teixits cerebrals (25 µm de gruix dels plans coronals) en acriòstat (Leica, Wetzlar, Alemanya).

4.7. Tinció histoquímica mitjançant CV

Per examinar el dany morfològic i neuronal a l'hipocamp de cada grup, es va realitzar una tinció de violeta de cresil (CV) tal com hem descrit anteriorment [69]. En resum, l'acetat de violeta de cresil (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) es va dissoldre a l'1,0% (p/v) en aigua destil·lada i àcid acètic glacial (0,28). %) es va afegir a aquesta solució. Les seccions van ser tenyides i muntades amb bàlsam canadenc (Kanto, Tòquio, Japó).

4.8. Tinció FJ B

Es va realitzar una tinció de FJ B per examinar la degeneració neuronal (mort o pèrdua). Segons el procediment publicat [34], les seccions cerebrals preparades es van remullar amb hidròxid de sodi a l'1%, es van transferir immediatament a 0.{0permanganat de potassi al 6% i es van reaccionar ràpidament amb un 0,0004% de fluoro-jade B (Histochem). , Jefferson, AR, EUA).

Les seccions es van rentar breument i es van posar en un escalfador de diapositives (uns 50 ◦ C) per a la reacció amb FJ B. Per avaluar l'efecte terapèutic de l'OXC contra el tFI, es va comptar el nombre de cèl·lules FJ B + a la regió CA1 segons un mètode publicat a [ 70].

Breument, es van capturar imatges digitals de cèl·lules FJ B + de cinc seccions per gerbil mitjançant un microscopi epifluorescent (Carl Zeiss) (Oberkochen, Alemanya) a una longitud d'ona de 450-490 nm. Les cèl·lules es van comptar en 250 µm2, que incloïa el SP, al centre de la regió CA1 mitjançant un sistema d'anàlisi d'imatges (Optimas 6.5) (CyberMetrics, Scottsdale, AZ, EUA).

4.9. Immunohistoquímica

Per investigar els canvis en la immunoreactivitat de NeuN, TRPV1 i TRPV4 a la regió CA1, es va realitzar una immunohistoquímica general. En resum, segons un mètode publicat [34], les seccions cerebrals preparades es van incubar amb anticossos primaris: ratolí anti-NeuN (diluït, 1:1100) (Chemicon, Temecula, CA, EUA), ratolí anti-TRPV1 (diluït, 1:500) (Abcam, Cambridge, Regne Unit) i conill anti-TRPV4 (diluït, 1:500) (Abcam, Cambridge, Regne Unit).

Posteriorment, aquestes seccions incubades es van incubar en els anticossos secundaris corresponents (diluïts, 1:250) (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, EUA) i es van desenvolupar amb Vectastain ABC (diluït, 1:250) (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, CA). , EUA). Finalment, aquestes seccions immunoreaccionades tenien color després de la visualització amb 3,3'-diaminobenzidina.

El nombre de cèl·lules NeuN + es va comptar de la següent manera. Les imatges digitals de cèl·lules NeuN + es van capturar de cinc seccions per gerbil mitjançant un microscopi de llum (AxioM1) (Carl Zeiss, Alemanya).

Les cèl·lules es van comptar de la mateixa manera que el recompte de cèl·lules FJ B +. Per avaluar la densitat de les estructures TRPV1+ i TRPV4+, les àrees corresponents a la regió CA1 es van utilitzar en cinc seccions per animal. Les imatges de les estructures TRPV1+ i TRPV4+es van capturar mitjançant un microscopi de llum AxioM1 (Carl Zeiss) (Alemanya).

Les densitats de les estructures TRPV{{0}} i TRPV{4+es van avaluar com a densitat òptica relativa (ROD). Amb aquesta finalitat, les imatges es van transformar al nivell de gris mitjà. El ROD es va presentar com a percentatge mitjançant Adobe Photoshop (versió 8.0) i el programari NIH Image J (NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD, EUA).

4.10. Anàlisi estadística

Vam presentar les dades com a mitjanes ± error estàndard de la mitjana (SEM). Totes les anàlisis estadístiques es van realitzar amb l'ajuda de GraphPad Prism (versió 5.0) (GraphPadSoftware, La Jolla, CA, EUA). Les diferències en les mitjanes entre els grups experimentals es van analitzar estadísticament mitjançant l'anàlisi bidireccional de la variància (ANOVA) amb una prova de comparació múltiple post hocBonferroni per dilucidar les diferències relacionades amb el tFI entre tots els grups. La significació estadística es va considerar a p < 0. 05.

Aportacions de l'autor: Conceptualització: M.-HW i T.-KL; Metodologia, J.-CL i DWK;Programari, H.-IK i MCS; Validació, JHA, IJK i JHP; Investigació, J.-CL, H.-IK i M.CS; Data Curation, JHC, IJK i JHP; Redacció-Preparació de l'esborrany original, H.-IK, i J.-CL; Redacció-Revisió i Edició, M.-HW; Supervisió, S.-SL; Administració de Projectes, M.-HW; Funding Acquisition, S.-SL i T.-KL Tots els autors han llegit i acceptat la versió publicada del manuscrit.

Finançament: aquest treball va comptar amb el suport de Brain Korea 21 (BK21) Fostering Outstanding Universities for Research (FOUR, 4220200913807) finançat per la National Research Foundation (NRF) de Corea i pel Programa de Recerca en Ciències Bàsiques a través de la National Research Foundation of Korea (NRF) finançat pel Ministeri d'Educació (NRF-2020R1I1A1A01070897).

Declaració de la Junta de Revisió Institucional: els gerbils es van criar al Centre d'Animals Experimentals de la Universitat Nacional de Kangwon (Chuncheon, Corea). Per a aquest estudi, el Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals va aprovar el protocol experimental (núm. d'aprovació, KW-200113-1; data d'aprovació, 18 de febrer de 2020).

El protocol d'investigació es va adherir a les directrius suggerides a les "Leis i polítiques internacionals actuals" de la Guia per a la cura i l'ús d'animals de laboratori publicada per The National Academies Press (8a ed., 2011).

Declaració de consentiment informat: no aplicable.

Declaració de disponibilitat de dades: les dades presentades en aquest estudi estan disponibles a petició de l'autor corresponent.

Agraïments: els autors agraeixen a Hyun Sook Kim i Seung Uk Lee per la seva ajuda tècnica en aquest estudi.

Conflictes d'interessos: els autors han declarat que no hi ha cap conflicte d'interessos financer.

Abreviatures

CA1: subcamp Cornu Ammonis 1; SNC, sistema nerviós central; CV, violeta de cresil; DG, circumvolució dentada;FJ B, Fluoro-Jade B; HyT, hipotèrmia; NeuN, nuclis neuronals; OXC, oxcarbazepina; PAT, prova d'evitació passiva; ROD, densitat òptica relativa; SMA, activitat motora espontània; SO, stratum oriens;SP, estrat piramidal; SR, estrat radiatum; tFI, isquèmia transitòria del cervell anterior; TRPV1, potencial transientreceptor vanilloide tipus 1.

Referències

1. Busto, R.; Dietrich, WD; Globus, MEU; Valdés, I.; Scheinberg, P.; Ginsberg, MD Les petites diferències en la temperatura cerebral intraisquèmica determinen de manera crítica l'abast de la lesió neuronal isquèmica. J. Cereb. Metab de flux sanguini. 1987, 7, 729–738. [CrossRef][PubMed]

2. Maher, J.; Hachinski, V. La hipotèrmia com a tractament potencial per a la isquèmia cerebral. Cerebrovasc. Metab del cervell. Rev. 1993, 5.277–300.

3. Infermera, S.; Corbett, D. Neuroprotecció després de diversos dies d'hipotèrmia lleu induïda per fàrmacs. J. Cereb. Metab de flux sanguini. 1996, 16.474–480. [Ref creuat]

4. Fisher, M.; Feuerstein, G.; Howells, DW; Hurn, PD; Kent, TA; Savitz, SI; Lo, EH; Group, S. Actualització de les recomanacions preclíniques de la taula rodona de la indústria acadèmica de la teràpia de l'ictus. Ictus 2009, 40, 2244–2250. [Ref creuat]

5. Liu, L.; Yenari, MA Hipotèrmia terapèutica: mecanismes neuroprotectors. Davant. Biosci. 2007, 12, 816–825. [Ref creuat]

6. Lyden, PD; Krieger, D.; Yenari, M.; Dietrich, WD Hipotèrmia terapèutica per a l'ictus agut. Int. J. Stroke 2006, 1, 9–19. [CrossRef][PubMed]

7. Klassman, L. Hipotèrmia terapèutica en ictus agut. J. Neurosci. Infermeres. 2011, 43, 94–103. [Ref creuat]

8. Groysman, LI; Emanuel, BA; Kim-Tenser, MA; Sung, GY; Mack, WJ Hipotèrmia terapèutica en ictus isquèmic agut. Neurocirurgia. Focus 2011, 30, E17. [CrossRef] [PubMed]

9. Schwab, S.; Georgiadis, D.; Berrouschot, J.; Schellinger, PD; Graffagnino, C.; Mayer, SA Viabilitat i seguretat de la hipotèrmia moderada després d'un infart hemisfèric massiu. Ictus 2001, 32, 2033–2035. [Ref creuat]

10. Katz, LM; Jove, AS; Frank, JE; Wang, Y.; Park, K. La hipotèrmia regulada redueix l'estrès oxidatiu cerebral després de la isquèmia hipòxica. Cervell Res. 2004, 1017, 85–91. [Ref creuat]

11. Liu, K.; Khan, H.; Geng, X.; Zhang, J.; Ding, Y. Hipotèrmia farmacològica: un potencial per a la futura teràpia de l'ictus? Neurol. Res.2016, 38, 478–490. [Ref creuat]

12. Ma, J.; Wang, Y.; Wang, Z.; Li, H.; Wang, Z.; Chen, G. Efectes neuroprotectors de la hipotèrmia terapèutica induïda per fàrmacs en malalties del sistema nerviós central. Curr. Objectius de drogues 2017, 18, 1392–1398. [Ref creuat]

13. Calabresi, P.; Cupini, LM; Centonze, D.; Pisani, F.; Bernardi, G. Els fàrmacs antiepilèptics com a possible estratègia neuroprotectora isquèmia cerebral. Ann. Neurol. 2003, 53, 693–702. [Ref creuat]

14. Tanaka, T.; Litofsky, NS Fàrmacs antiepilèptics en lesions cerebrals traumàtiques pediàtriques. Expert Rev. Neurother. 2016, 16, 1229–1234.[CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com