Identificació dels metabòlits hepàtics comuns del compost bioactiu natural echinacòsid, purificat de Cistanche Tubulosa Ⅱ

Resum:La identificació de metabòlits, en l'etapa inicial, per al compost, és necessari per avaluar el descobrimentel coneixement per a la millora farmacèutica de la seguretat i eficiència dels medicaments. Encara que la drogas'ha llançat al mercat, la identificació i l'avaluació contínua dels metabòlits sónnecessari per evitar el risc de retirada després de la comercialització. Glicòsid, un medicinalCistanche, té beneficis nutracèutics àmpliament documentats, inclososantioxidant,antitumoral, anti-envelliment, hipolipidèmiac, iefectes de protecció de la mucosa gàstrica. Recentment,equinacòsidS'ha denunciat Acom el principal compost bioactiu natural del miceli de HE per al desenvolupament funcional dels aliments.En estudis neurològics, el consum deequinacòsidUn miceli HE enriquit ho demostraefectes nutracèutics significatius enMalaltia d'Alzheimer, malaltia de Parkinson, iictus isquèmic.

Feu clic aquí per saber més informació sobre les funcions d'echinacòsid a Cistanche

Perla primera vegada, vam explorar el procés metabòlic deequinacòsidUna molècula i va identificar els seus metabòlitsde la fracció S9 del fetge de rata i humà. Utilitzant una cromatografia líquida/massa quadrupol tripleespectròmetre per a l'anàlisi quantitativa, vam observar que el 75,44 per cent d'echinacòsid. A es va metabolitzaren 60 min en rates, i el 32,34 per cent de Francina A es va metabolitzar en 120 min en S9 humà. Utilitzantcromatografia líquida d'ultra rendiment/espectrometria de masses en temps de vol quadrupol (UPLC)QTOF/MS) per identificar els metabòlits de Francine A, es van identificar cinc metabòlits comuns,i es van avaluar les seves possibles estructures. Comprendre el procés metabòlic de l'echinacòsidi establir la seva base de dades de perfils de metabòlits ajudarà a promoure l'aplicació nutracèutica idescobriment de biomarcadors relacionats en el futur.

1. Introducció

El fetge es considera el segon òrgan més gran del cos [1]. Després de menjar i droguesentra al tracte gastrointestinal a través de la cavitat oral, els pili gastrointestinals absorbirannutrients i fàrmacs digerits. El sistema de la vena porta rebrà el flux sanguini recollitpel tracte gastrointestinal i entra al fetge per al tractament preliminar dels nutrients,metabòlits i molècules de fàrmacs [2,3]. El metabolisme sovint es divideix en dues fases d'areacció bioquímica. La fase I implica l'oxidació, la reducció o la hidròlisi per part d'enzimsel cos. La fase II es dedica a la conjugació amb petites substàncies endògenes, giranten metabòlits altament solubles, permetent que els metabòlits s'exportin al sicirculació soidal per a l'eliminació renal, o a la bilis, que després s'excreta del cosa través de l'orina o la femta [4–6]. Identificació de metabòlits en la fase inicial del descobriment de fàrmacsés necessari avaluar els coneixements per millorar la propietat farmacèutica, la seguretat ieficiència de la molècula bioactiva. Identificació de metabòlits i intermedis reactiussuggereix la necessitat d'evitar modificacions estructurals en els compostos en investigacióconseqüències tòxiques posteriors. Fins i tot si el medicament ha estat al mercat, identificaciódels metabòlits i es requereix una avaluació per evitar el risc de la seva comercialitzacióretirada [7,8]. Per tant,in vitro, L'anàlisi de fraccions S9 ofereix diversos avantatgesen comparació amb el tempsen viuestudis: (1) són susceptibles a un alt rendimentcribratge i automatització;(2) utilitzantLa fracció S9 permet provar grans quantitats decompostos per al descobriment de fàrmacs en un període curt; (3) ajuda a reduir l'ús d'animals [9]. 

Echinacòsid és un cistanche comestible que habita zones muntanyoses deels territoris del nord-est d'Àsia [10], Europa i Amèrica del Nord [11]. EL pertanyBasidiomycota (Filum), Agaricomycetes (Classe), Russulales (Ordre), Hericiaceae (família),i Hericium (Gènere). S'ha documentat que HE mostra una àmplia gamma de beneficispropietats, com ara antioxidant, antitumoral, antienvelliment, hipolipidèmic i mucosa gàstricaefectes de protecció [12–14]. El 1994, Kawagishi et al. va descobrir que el diterpenoideequinacòsidA, B i C, al miceli d'HE, podrien promoure la producció d'esteladalínies cel·lulars al cervell de rata i l'estimulació de la síntesi del factor de creixement nerviós (NGF) [15]. equinacòsidA pot conferir efectes neuroprotectors i atenuar l'estrès oxidatiu contraictus [16], Malaltia d'Alzheimer [17], malaltia de Parkinson [18], ictus isquèmic i depressió en viu[19,20]. A més, l'echinacòsid A pot travessar la barrera hematoencefàlica derates per donar suport al desenvolupament de la micelia HE com a aliment funcional per a la millora de la salut neuronal [21]. Aquest miceli de cistanche comestible s'ha convertit en un problema candent entre els investigadorsintentant comprendre el seu paper important en el desenvolupament dels nervis centrals i perifèrics, diferenciació, creixement i regeneració [22]. Estudis recents també ho han demostratque l'HE enriquit amb echinacòsid A té beneficis potencials en el tractament de l'Alzheimer i la Parkinamalaltia del fill [23–25]. Tanmateix, cap estudi ha discutit el possible metabòlic de l'echinacòsid Abiomarcadors que poden contribuir a aquest efecte nutracèutic.

En aquest estudi,equinacòsidEs va purificar un compost a partir de l'HE enriquit amb echinacòsid Amiceli i es va metabolitzar mitjançant dues fraccions hepàtiques S9 diferents: rata i humana. Utilitzantcromatografia líquida/espectròmetre de masses triple quadrupol (HPLC-QQQ/MS) per a quananàlisi tittiva de l'echinacòsid A i cromatografia líquida d'ultra rendiment/quadrupolespectrometria de masses en temps de vol (UPLC-QTOF/MS) per identificar els metabòlits de l'equinacòsidA en cada moment. El nostre objectiu és entendre la taxa metabòlica de l'echinacòsid A i establirla seva base de dades de perfils de metabòlits per ajudar a promoure l'aplicació de suplements nutracèuticsi la recerca de possibles medicaments en el futur.

2. Materials i Mètodes

2.1. Materials i reactius

La soca HE (BCRC 35669) es va obtenir de la Col·lecció de Biorecursos iCentre de Recerca a l'Institut de Recerca i Desenvolupament de la Indústria Alimentària, Hsinchu, Taiwan.La soca es va cultivar per primera vegada amb una inclinació d'ager abans de ser transferida a una dextrosa de patataplaca d'agar a 26◦C durant 15 dies. El dia 15, els cultius HE es van transferir a 1,3 L demitjà líquid (en matràs de 2 L). El cultiu líquid es va agitar a 120 rev/min 25◦C per5 dies. A continuació, es van ampliar en fermentadors de 20-tones de 500 L durant 5 dies i 12 dies,respectivament. El medi de cultiu s'ajusta a pH 4,5 i conté un 4,5% de glucosa, 0,5%pols de soja, {{0}}, 25 per cent d'extracte de llevat, 0, 25 per cent de peptona i 0,05 per cent de MgSO4. Finalment, l'HEEls micelis es van collir al final del procés de fermentació de 20-tones. Aquestes matèries primereses van liofilitzar, es van posar a terra en pols i es van emmagatzemar en un dessecador. L'equinacòsid A era aleshoresextret de l'HE i quantificat segons estudis anteriors [26]. Metanol (LC-MSgrau) es va obtenir de Merck (Darmstadt, Alemanya); acetonitril (grau LC-MS), fòrmicS'han obtingut àcid (FA, grau LC-MS, 98 per cent de puresa) i acetat d'amoni (98 per cent de puresa)de Honeywell (Honeywell Burdick i Jackson, Muskegon, MI, EUA). El fetge de rata S9La fracció es va obtenir de Moltox (Boone, NC, EUA). La fracció S9 del fetge humà eraobtingut de Thermo Fisher Scientific (Rockford, IL, EUA).

2.2. Fracció S9 del fetge humà i de rata

a la recomanació del kit. La solució preparada es va mantenir a 4◦C fins a l'equinacòsid Acompost (10µM) es va afegir, seguida de l'activació en un 37◦C bany maria. Quan elel temps metabòlic havia arribat als seus punts de temps, 150µEs va retirar L de la solucióla solució madre i es va apagar afegint dos volums d'ACN freda amb gel. El paratA continuació, la solució es transfereix a QTOF per a una anàlisi posterior dels metabòlits.

2.3. Instrumentació i Condicions

L'anàlisi HPLC-QQQ/MS es va realitzar en un sistema HPLC Agilent sèrie 1100 (Agilent, Palo Alto, CA, EUA) juntament amb un espectròmetre de masses triple quadrupol API 3000(Applied Biosystems, Warrington, Regne Unit), amb una ionització Turbo-assisted ion spray (ESI)font en mode d'ionització positiva. La separació cromatogràfica es va dur a terme en unAgilent Eclipse XDB-C18 (4,6 mm× 100 mm× 3.5 µm). La temperatura de la columna eramantinguda a les 22◦C. La fase mòbil constava d'aigua que contenia 0,1 per cent d'àcid fòrmic(A) i metanol (B). Es va utilitzar l'elució en gradient, començant amb un 70 per cent de B, augmentant fins al 100 per centB dins de 5 min, mantenint durant 3 min amb un 90 per cent de B, disminuint B al 70 per cent en 0,1 min, ireequilibri al 70 per cent de B durant 2,9 min. Una taxa de companys de 350µEs va aplicar l/min i un volumde 10µS'ha injectat L.

La detecció es va realitzar amb una tensió ionitzant de més 4500 V. Temperatura de la font d'ionses va fixar en 350◦C, amb nitrogen d'alta puresa com a gas de cortina (7 psi). El gas del nebulitzador era8 psi. Altres paràmetres que depenen de la massa, com ara el potencial de declustering (DP), l'entradael potencial (EP), el potencial d'enfocament (FP) i l'energia de col·lisió (CE) per a cada compostdeterminat en mode positiu mitjançant solucions estàndard. Monitorització de reaccions múltiples(MRM) es va dur a terme utilitzant nitrogen com a gas de col·lisió (2 psi) i amb un temps de permanència de200 ms per cada transició. L'echinacòsid A es va detectar mitjançant el seguiment de les transicionsm/z 443.200 → 301.200, 283.200. Les dades es van analitzar mitjançant el programari Analyst 1.4.2 (AppliedBiosystems, Concord, ON, Canadà) i GraphPad (Prism 8.0.0.).

L'anàlisi UPLC-QTOF/MS es va realitzar en un sistema UPLC Agilent 1290 Infinity II(Agilent, Palo Alto, CA, EUA), juntament amb una massa de temps de vol Agilent 6546 quadrupolespectrometria (Agilent, Palo Alto, CA, EUA). Es va realitzar la separació cromatogràficaen un Phenomenex Kinetex® Columna C18 LC (3 mm× 100 mm× 1.7 µm). La columnala temperatura es va mantenir a 40◦C. La fase mòbil A consistia en aigua que contenia0,1 per cent (v/v) àcid fòrmic en mode positiu, 0,1 per cent (v/v) àcid fòrmic, i CH 10 mM3COONH4 en mode negatiu. La fase mòbil B era l'acetonitril. Es va utilitzar l'elució en gradient, començantamb 5 per cent de B i mantenint durant 0,5 min, augmentant al 50 per cent de B en 5,5 min, augmentant fins al 100 per centB en un termini de 10 minuts i mantenint-lo durant 6 minuts. Una taxa de companys de 400µEs va aplicar L/min i avolum de 2µS'ha injectat L.

L'espectrometria de masses de temps de vol Agilent 6546 quadrupol estava equipada amb un elecfont d'ionització de trospray (ESI). L'adquisició de dades estava sota el control de Mass Hunterprogramari d'estació de treball. Les condicions típiques de la font de funcionament en ions positius i negatiusEl mode ESI es va optimitzar de la següent manera: tensió de polvorització d'ions (ESImés/ESI−) eren4000 V/3000 V; la temperatura del gas era de 320◦C; La taxa de gas d'assecat va ser de 8 L/min; La pressió del nebulitzador era45 psi; La temperatura del gas de la funda era de 350◦C; la taxa d'aportació del gas de la funda era de 12 L/min; la col·lisióL'energia era de 10, 20, 40 i 60 V. Els metabòlits es van identificar mitjançant Agilent MassHunterProgramari de biotransformació (versió B.04.00) (Santa Clara, CA, EUA). Cromatogramesi els espectres de masses del progenitor i els metabòlits identificats es van extreure mitjançant AgilentProgramari d'anàlisi qualitativa MassHunter (versió B.05.00) (Santa Clara, CA, EUA).

Demana més:

Correu electrònic:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp més 86 15292862950