Cistanche Herba té una eficàcia antidepressiva en l'estrès crònic impredictible

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

Yang Li, et al

RESUM

Recentment es va confirmar que Cistanche tubulosa, una espècie de Cistanches Herba, té una eficàcia antidepressiva en rates d'estrès impredictible crònic (CUS) en restaurar l'homeòstasi de la microbiota intestinal. En aquest article, pretenem explorar el perfil metabòlic de C. tubulosa en rates model depressives normals i induïdes per CUS in vitro i in vivo. Mitjançant UPLC-Q-TOF-MS, el metabolisme gastrointestinal in vitro deExtracte de Cistanche tubulosa(CTE) es va avaluar tant en rates normals com en CUS. Al mateix temps, el metabolisme in vivo del CTE(extracte de Cistanche tubulosa)en rates normals i deprimides també es va investigar en orina i femta de rates. Es van caracteritzar un total de 20 i 26 metabòlits a partir del metabolisme in vitro i in vivo en rates normals i CUS, respectivament. CTE(extracte de Cistanche tubulosa)es va metabolitzar en aglicones i productes de degradació de glicòsids feniletanoides (PhG) i glicòsids iridoides ja sigui per microbiota intestinal de rata normal o deprimida in vitro. Els metabòlits de fase II d'aglicones i els productes de degradació de PhG i glicòsids iridoides van ser els principals metabòlits a l'orina i la femta de rata. A més, la capacitat metabòlica de generar glicòsids i aglicones secundaris en la microbiota intestinal depressiva de rata era molt més feble que la de la microbiota intestinal normal de rata, que es va atribuir a les hidrolases de glicòsids desordenades produïdes per la microbiota intestinal en rates deprimides CUS. Els resultats d'aquest estudi van establir les bases per entendre el procés metabòlic i el mecanisme terapèutic de la propietat antidepressiva del CTE.

Paraules clau: Cistanche tubulosa, DepressióMetabolisme, In vitro, In vivo, Microbiota intestinal

1. Introducció

Cistanches Herba es registra oficialment com les tiges suculentes seques de Cistanche deserticola (YC Ma) i C. tubulosa (Schrenk), que s'utilitzen per tractar la deficiència renal, la impotència, la infertilitat femenina, la morbilleucorrea, la metrorràgia profusa i el restrenyiment senil [1]. Els estudis farmacològics moderns han demostrat que Cistanches Herba posseeix diverses activitats biològiques com ara anti-neurodegeneració, immunoregulació i antiinflamació [2,3]. Les nostres investigacions anteriors ho han comprovatExtracte de Cistanche tubulosa(CTE), que consta d'un 48,6 per cent de glucòsids feniletanoides (PhG), un 6,9 per cent de glicòsids iridoides i un 20,0 per cent de sacàrids totals, podrien alleujar notablement els símptomes depressius de rates depressives induïdes per estrès crònic impredictible (CUS). restaurar l'homeòstasi de la microbiota intestinal [4]. Estudis recents indiquen que els canvis en la composició de la microbiota intestinal es van associar amb el desenvolupament i la progressió de la depressió [5,6]. Les abundàncies relatives dels gèneres microbians es van alterar notablement en rates model CUSdepressive en comparació amb controls normals [7]. En pacients deprimits, la diversitat i la riquesa de la microbiota intestinal també es van alterar significativament [8]. A més, es van considerar diversos compostos, inclosos els glicòsids feniletanoides (PhG) i els glicòsids iridoides, com els principals constituents de Cistanches Herba [2,3], que es van metabolitzar fàcilment en els seus glucòsids secundaris i aglicones, incloent hidroxitirosol (HT), 3,4-dihidroxifenetil. glucòsid, àcid geniposidic desglicosilat, etc. per la microbiota intestinal humana. Aquests metabòlits s'absorbeixen més fàcilment a través de l'intestí i exerceixen una activitat biològica coherent amb el component prototip[9–11]. Així, creiem que durant l'aparició i el desenvolupament de la depressió, la alteració de l'estructura de la microflora intestinal afectarà inevitablement el metabolisme de les medicines xineses tradicionals orals (TCM) al tracte gastrointestinal, a més d'afectar l'estat fisiològic de l'hoste. La majoria de les dades metabòliques existents de Cistanches Herba provenen d'estudis metabòlics en animals sans [12–15]. Per tant, seria de més importància clínica investigar el perfil metabòlic de la CTE(extracte de Cistanche tubulosa)en l'estat patològic per dilucidar els seus components bioactius i comprendre el mecanisme d'acció per a la seva eficàcia antidepressiva.

En l'estudi actual, pretenem caracteritzar els perfils metabòlics de CTE(extracte de Cistanche tubulosa)en rates model depressives tant sanes com induïdes per CUS mitjançant espectrometria de masses de temps de vol quadripol de cromatografia líquida d'ultra rendiment (UPLC-Q-TOF-MS). El suc gàstric, el líquid intestinal i la microbiota de rates patològiques normals i depressives s'han utilitzat per simular el procés metabòlic de la CTE.(extracte de Cistanche tubulosa)al tracte gastrointestinal in vitro, de manera independent i seqüencial. Els metabòlits in vivo també s'aclareixen després de l'administració oral de CTE(extracte de Cistanche tubulosa)en rates normals i CUS. Aquest estudi proporciona nous coneixements sobre el metabolisme i els metabòlits actius de CTE(extracte de Cistanche tubulosa)per la depressió.

2. Material i mètodes

2.1. Material

Les tiges seques de C. tubulosa es van recollir del comtat d'Hetian (Xinjiang, Xina). Les mostres d'exemplars del val van ser autenticades pel professor Xiaobo Li i dipositades a l'herbari de l'Escola de Farmàcia de la Universitat Jiao Tong de Xangai (Xangai, Xina). El mètode d'extracció es va utilitzar tal com s'especificava a la nostra publicació anterior [4]. ElExtracte de Cistanche tubulosaLes mostres (CTE) es van emmagatzemar a 4 graus i es van tornar a dissoldre amb aigua estèril abans d'utilitzar-les. Les solucions d'aigua estèril del CTE(extracte de Cistanche tubulosa)A continuació, es va filtrar la mostra a través d'una membrana de 0,22 μm i els filtrats es van recollir en tubs estèrils.

Echinacoside va ser proporcionat pel laboratori del Dr. Pengfei Tu, la Universitat de Pequín (Beijing, Xina). L'acteòsid, l'isoacteòsid, el 2'-acetilacteòsid i el cistàsid A es van comprar a Sichuan Weikeqi BiologicalTechnology Co., Ltd. (Chengdu, Xina). L'hidroxitirosol, l'àcid cafeic, l'àcid 3,4-dihidroxibenzèpropiònic, l'àcid 3-hidroxifenilpropiònic i l'àcid 3-fenilpropiònic es van comprar a Aladdin IndustrialInc. (Xangai, Xina). Es va determinar que la puresa de cada component era > 95 per cent per HPLC-UV. L'acetonitril de grau HPLC es va comprar a Merck (Darmstadt, Alemanya). L'aigua desionitzada es va preparar a partir d'aigua destil·lada mitjançant un sistema de purificació d'aigua Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, EUA). Tots els altres reactius i productes químics utilitzats eren de grau analític.

2.2. Experiments amb animals

Les rates masculines Sprague-Dawley (200 ± 20 g) es van adquirir de l'empresa de tecnologia animal del laboratori de Beijing Vital River (Beijing, Xina) i es van allotjar al Centre d'Animals de Laboratori de la Universitat JiaoTong de Xangai (Xangai, Xina). Els animals tenien una temperatura ambient controlada en grup (25 ± 2 graus, 55 ± 10 per cent d'humitat relativa) amb un cicle de llum-foscor de 12:12 h. A les rates se'ls va permetre l'accés gratuït a menjar i aigua de laboratori habituals durant 1 setmana. Les instal·lacions i els protocols dels animals van ser aprovats pel Comitè d'Ètica Animal de la Universitat Jiao Tong de Xangai (Xangai, Xina).

Després d'una setmana d'aclimatació, dotze rates ingènues es van dividir aleatòriament en dos grups (n=6), el grup control i el grup d'estrès crònic impredictible (CUS). Les rates CUS es van desenvolupar com en el nostre informe anterior [4], que van ser sotmeses a diversos factors estressants: soroll blanc (100 dB) durant 1 h, il·luminació estroboscòpica de baixa intensitat durant la nit (120 flaixos/min), privació d'aigua durant 24 h, buit. ampolles d'aigua durant 1 h (després de la privació d'aigua), privació d'aliments durant 24 h, contenció física (1-2 h), natació forçada (5 min), gàbia bruta durant 24 h (200 ml d'aigua en 100 g de serradures), pessic de cua ( 1 min), xoc durant 30 min, inclinació de la gàbia de 45 graus durant 24 h i il·luminació nocturna (12 h). Els estressants es van aplicar de manera contínua i aleatòria durant 4 setmanes, la disposició detallada es descriu a la taula S1. Després de 4 setmanes d'estrès, la prova de preferència de sacarosa, la prova de camp obert i la prova d'alimentació suprimida per novetats es van realitzar tal com es va descriure anteriorment [4]. L'esquema del CUS i la prova de comportament es mostra a la figura S1. Després de les proves de comportament, es van obtenir almenys 4 fecalpellets de cada rata i es van col·locar en tubs cònics estèrils per a l'anàlisi in vitro de CTE.(extracte de Cistanche tubulosa)metabolisme.

2.3. Metabolisme gastrointestinal del CTE(extracte de Cistanche tubulosa)per rata normal i CUS in vitro

2.3.1. Metabolisme del CTE(extracte de Cistanche tubulosa)en sucs gàstrics i intestinals simulats

Cinquanta mil·ligrams de CTE(extracte de Cistanche tubulosa)es van afegir a 10 ml de suc gàstric simulat i suc intestinal, respectivament. Després CTE(extracte de Cistanche tubulosa)es va incubar a 37 graus durant 4 h en suc gàstric i 6 h en suc intestinal. La mescla cultivada (1 mL) es va apagar amb 3 mL de n-butanol saturat d'aigua immediatament a 0 i 4 h en suc gàstric, i a 0 i 6 h en suc intestinal. El mètode de processament de la mostra utilitzada va ser el que s'ha descrit anteriorment [9].

2.3.2. Metabolisme del CTE(extracte de Cistanche tubulosa)per la microbiota intestinal de rata normal i CUS

En primer lloc, es van barrejar mostres fecals fresques de rata normal i CUS amb 25 vegades el volum de brou GAM. Els sediments es van eliminar per filtració a través de tres peces de gasa. A continuació, la suspensió es va incubar a 37 graus en una incubadora anaeròbica en la qual l'aire es va substituir per una barreja de gasos (H2 5 per cent, CO2 10 per cent, N{2 85 per cent). Es van afegir 50 mil·ligrams de CTE a 5 ml de suspensió fecal de rata normal i CUS per separat, i la suspensió es va incubar a 37 graus durant 48 h. La mescla cultivada es va retirar i es va extreure amb n butanol saturat d'aigua a 0, 12, 24 i 48 h. El mètode de processament de la mostra es va descriure anteriorment [9].

2.3.3. Metabolisme seqüencial de CTE(extracte de Cistanche tubulosa)pel suc gàstric, suc intestinal, microbiota intestinal de rata normal i CUS

En primer lloc, 100 mg de CTE(extracte de Cistanche tubulosa)es va afegir a 1{{10}} ml de suc gàstric simulat i es va incubar a 37 graus durant 4 h. Tota la reacció es va apagar 3 vegades el volum de n-butanol saturat d'aigua i es va centrifugar a 3000 rpm durant 15 min, seguit de l'evaporació del sobrenedant sota un corrent de nitrogen. gas a 37 graus. En segon lloc, el residu es va tornar a dissoldre en 0, 4 mL d'aigua estèril, es va afegir a 8 mL de suc intestinal simulat i es va incubar a 37 graus durant 6 h. La mostra amb suc gàstric es va preparar de la mateixa manera. Finalment, el residu es va tornar a dissoldre en 0, 3 mL d'aigua estèril, es va afegir a 6 mL de suspensions fecals de rata normal i CUS respectivament i es va incubar a 37 graus durant 48 h en una incubadora anaerobicina. Un mil·lilitre de la reacció es va apagar amb 3 ml de n-butanol saturat d'aigua immediatament a les 0 i 4 h en suc gàstric, a les 0 i 6 h en suc intestinal i a les 0, 12, 24 i 48 h en la microbiota intestinal de rata. . La mostra es va processar de manera idèntica CTE(extracte de Cistanche tubulosa)en suc gàstric simulat.

2.4. Metabolisme del CTE(extracte de Cistanche tubulosa)per rata normal i CUS in vivo

A continuació, cada rata dels dos grups es va allotjar en una gàbia metabòlica individual. Després d'un dejuni nocturn que només permetia l'accés lliure a l'aigua, totes les rates es van administrar per via oral amb 2 ml d'aigua mitjançant un tub agàstric. Es van recollir mostres d'orina i fecal en blanc de totes les rates des de les 0 h fins a les 12 h. A més, CTE(extracte de Cistanche tubulosa)(400 mg/kg) es va administrar per sonda. Es van recollir mostres d'orina i fecal de 0 a 24 h. Totes les mostres d'orina i femta es van emmagatzemar immediatament a -80 graus.

Les mostres d'orina i fecal de rata normal i CUS es van tractar prèviament tal com s'ha descrit anteriorment [12]. Totes les mostres resultants es van analitzar mitjançant UPLC-Q-TOF-MS.

2.5. Mètode analític

UPLC es va realitzar en un sistema Waters ACQUITY UPLC (WatersCorp., Milford, MA, EUA) amb una columna ACQUITY UPLC BEH C18 (100 mm × 2,1 mm id, 1,7 μm, Waters Corp. , EUA) mitjançant elució gradient utilitzant {{10}}, 1 per cent d'acetonitril d'àcid fòrmic (A) i 0, 1 per cent d'àcid fòrmic en aigua (B) a un cabal de 0,4 ml/min . El perfil de gradient va ser: 0–5 min (A: 5–20 per cent), 5–7,5 min (A: 20–30 per cent), 7,5–10 min (A: 30–70 per cent), 10–11 min (A: 30–70 per cent), : 70-100 per cent) i es va mantenir durant 1,5 min. El gradient es va reciclar al 5 per cent en 0,5 min i es va mantenir durant 2,5 min per a la següent carrera. El volum d'injecció era de 3 μL. La temperatura del forn de columna es va establir a 35 graus.

L'espectrometria de masses es va dur a terme mitjançant un espectròmetre de masses Waters Vion IMS (Waters Corp., Milford, MA, EUA). La ionització es va realitzar en el mode electrospray negatiu (ESI−). Els paràmetres MS eren els següents: tensió capil·lar, -2.0 kV; tensió del con, 20 V; temperatura font, 120 graus; temperatura de desolvació, 500 graus; cabals de gas de con i desolvació, 50 i 1000 L/h, respectivament. Per a una mesura precisa de la massa, es va utilitzar la leucina-encefalina com a massa de bloqueig per generar un ió [M–H]− (m/z 554,2615). Es va dur a terme un experiment MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) en dues funcions d'exploració de la següent manera: funció 1 (baixa energia): m/z 50–1000, 0,25 s de temps d'exploració, 0,02 s de retard entre exploració, 6 eV d'energia de col·lisió; funció 2 (alta energia): m/z50–1000, temps d'exploració de 0,25 s, retard entre exploració de 0,02 s, rampa d'energia de col·lisió de 20–45 eV.

2.6. Tractament de dades

Les dades es van processar mitjançant el programari UNIFI 1.8.1 (Waters Corp., Milford, MA, EUA) per a la identificació de metabòlits dins de les dades en brut d'escaneig complet de massa precisa recollides mitjançant MSE. Els compostos es van identificar en funció de la massa precisa, fragments en espectrometria de masses d'alta energia. El llindar d'intensitat es va establir en 100,0 recomptes. La identificació de l'objectiu, la tolerància de coincidència de fragments i altres paràmetres es van establir automàticament.

3. Resultats

3.1. Els canvis de comportament a la rata de depressió induïda per CUS

Les rates amb símptomes depressius induïts per CUS es van avaluar mitjançant proves de comportament, inclosa la prova de preferència de sacarosa, la prova de camp obert i la prova d'alimentació suprimida per novetats. La prova t de Student va revelar que la preferència de sacarosa en la prova de preferència de sacarosa (p < 0,001),="" la="" distància="" total="" recorreguda="" a="" la="" prova="" de="" camp="" obert="" (p="">< 0,001)="" i="" la="" latència="" per="" menjar="" en="" la="" prova="" d'alimentació="" suprimida="" per="" novetats="" (p="">< 0,01)="" eren="" significativament.="" diferent="" en="" comparació="" amb="" el="" grup="" control="" després="" de="" 4-setmanes="" de="" tractament="" amb="" cus="" (fig.="" 1).="" aquestes="" troballes="" van="" indicar="" que="" el="" model="" d'estrès="" crònic="" impredictible="" es="" va="" desenvolupar="" amb="">

3.2. Caracterització dels components químics del CTE(extracte de Cistanche tubulosa)

Una anàlisi exhaustiva dels components del prototip de CTE(extracte de Cistanche tubulosa)va ser realitzat per UPLC-Q-TOF-MS. En total, 27 electors del CTE(extracte de Cistanche tubulosa)es van detectar i caracteritzar provisionalment, incloent 20 PhG, 5 iridoides i glicòsids iridoides i 2 oligosacàrids. La informació detallada, inclòs el temps de retenció, la MS precisa i els ions de fragments MS/MS, s'enumeren a la informació de suport (taula S2) per proporcionar informació sobre l'estructura d'aquests components químics. UPLC-Q-TOF-MS ioncromatograma total (TIC) de CTE es va mostrar a la figura S2.

3.3. Metabolisme gastrointestinal del CTE(extracte de Cistanche tubulosa)per rata normal i CUS in vitro

En aquest estudi, els metabòlits potencials de CTE(extracte de Cistanche tubulosa)per normal i CUSrats in vitro es van detectar a partir de les TIC i es van identificar amb una combinació de composicions elementals i espectres de masses de fragments MS/MS després de comparar-los amb les mostres de control. Tots els metabòlits de CTE(extracte de Cistanche tubulosa)en sucs gàstrics i intestinals simulats, la microbiota intestinal de rata normal i CUS es mostra a la taula 1.

3.3.1. Metabolisme del CTE(extracte de Cistanche tubulosa)en sucs gàstrics i intestinals simulats

Set metabòlits de CTE(extracte de Cistanche tubulosa)en suc gàstric simulat es van identificar provisionalment mitjançant informació precisa sobre la massa i el fragment de MSE: M1 (m/z315.1074, C14H20O8, 1,66 min), M4 (m/z 459,1501, C20H28O12,2,36 min), M5 (m/z 45,1017, C130,2017, C130,2017). 2,60 min), M7 (m/z179,0338, C9H8O4, 2,85 min), M12 (m/z 785,2481, C35H46O20,4,77 min), M16 (m/z 827,2580, C37H48O23 min), i M51,723 min, i M56,23 .1968, C29H36O15, 5,81 min). La desglicosilació, la deshidroxilació, la deshidrogenació i la isomerització es van considerar com les principals vies metabòliques de CTE en el suc gàstric. Es va trobar que M4 i M5 tenien un pes molecular de 2 Da i 16 Da menor que el seu component prototip, el decafeoilacteòsid, i per tant identificats com els seus productes deshidrogenats i deshidroxilats, respectivament. M12 es va identificar com un isòmer de l'equinacòsid, produint els mateixos ions que l'echinacòsid a m/z 623.2178, 477.1601, 315.1055, 161.0237.

Es van detectar els mateixos metabòlits després de la CTE(extracte de Cistanche tubulosa)incubació en suc intestinal. Cal destacar que el grup cafeoil a la posició C-6' dels PhGs va ser metabolitzat fàcilment pels enzims digestius del suc intestinal per produir els seus metabòlits decafeílics i àcid cafeic.

3.3.2. Metabolisme del CTE(extracte de Cistanche tubulosa)per la microbiota intestinal de rata normal i CUS

Un total de 20 metabòlits biotransformats a partir de CTE(extracte de Cistanche tubulosa)en la microbiota intestinal normal es van detectar i identificar (Fig. 2). A partir dels resultats, es va observar que els PhG es van degradar a aglicona hidroxitirosol (HT) M2 (m/z 153,0550, C8H10O3, 1,78 min) i àcid cafeic (CA) M7 (m/z 179,0338, C9H8O4, 2,85 min), després ells es van metabolitzar més a M3 (m/z 163,0390, C9H8O3, 2,02 min), M6 (m/z181,0501, C9H10O4, 2,76 min), M10 (m/z 195,0655, C10H12O4, 4,11 (m/z) i 4,11 (m/z) , C9H10O3, 4,36 min) mitjançant deshidroxilació, reducció i metilació. A més, les vies metabòliques centrals que van produir metabòlits directes dels compostos prototipus de PhG a partir de CTE en la microbiota intestinal normal de rata són la reducció, la metoxilació, la desglicosilació, el decafeoil, la deshidrogenació i la isomerització.

Després de la incubació a la microbiota intestinal de rata depressió induïda per CUS, CTE(extracte de Cistanche tubulosa)es va convertir en 20 metabòlits a través de les mateixes vies metabòliques que les rates normals.

3.3.3. Metabolisme seqüencial de CTE pel suc gàstric, suc intestinal, microbiota intestinal de rata normal i CUS

Després de la incubació seqüencial en suc gàstric, suc intestinal, microbiota intestinal de rata normal i CUS, CTE(extracte de Cistanche tubulosa)es va metabolitzar a 14 metabòlits (inclosos 8 amb suc gàstric, 7 amb suc intestinal, 11 amb normal i 10 amb microbiota intestinal de rata CUS). Entre aquests, M2(HT) i M11 (3-àcid hidroxifenilpropiònic, 3-HPP) van ser els metabòlits finals dels PhG després de la incubació seqüencial de CTE(extracte de Cistanche tubulosa)en suc gàstric, suc intestinal i microbiota intestinal. No hi va haver cap diferència significativa en els metabòlits entre la rata normal i la CUS.

M8, M9, M14, M17, M19 i M20 només es van detectar en el metabolisme independent de CTE per la microbiota intestinal de rata normal i CUS. Aquests metabòlits eren principalment intermedis metabòlics que s'havien metabolitzat completament en metabòlits finals en l'estudi del metabolisme seqüencial de CTE i, per tant, són difícils de detectar.

3.3.4. Diferències entre la taxa metabòlica de CTE per microbiota intestinal normal i CUS

Per dilucidar les diferències entre la taxa metabòlica de CTE(extracte de Cistanche tubulosa)Per la microbiota intestinal de rata normal i CUS, el contingut relatiu de 27 compostos prototip i 20 metabòlits després de la incubació amb suc gàstric, suc intestinal, microbiota intestinal normal i CUS de rata es va determinar per separat i seqüencial (taules S3 i S4). Els resultats van indicar que encara que no hi havia diferències significatives entre CTE(extracte de Cistanche tubulosa)metabòlits de rates normals i depressives, es va observar una diferència significativa en les seves taxes metabòliques. Per exemple, C2 i C5 es van identificar com a 8-àcid epilogànic o el seu isòmer. Es van metabolitzar completament en mostres normals en 12 h d'incubació. Tanmateix, a la microbiota intestinal de rata patològicament deprimida, es van metabolitzar completament després de 48 h d'incubació. Era evident que la taxa metabòlica de la rata normal era més ràpida que la de la rata CUS. Es van descobrir resultats similars a partir de C18 (isoacteòsid). A més, cal destacar que l'àrea màxima de M12 (isomerització de l'equinacòsid) i M16 (isomerització del tubulòsid A) en mostres normals era molt més gran que la de les mostres de CUS, cosa que indica que la reacció d'isomerització de CTE(extracte de Cistanche tubulosa)era més freqüent en la microbiota intestinal normal de rata que en la microbiota intestinal de la rata depressió.

3.4. Metabolisme de CTE per rata normal i CUS in vivo

En comparar mostres biològiques del grup tractat amb CTE amb mostres biològiques en blanc, un total de 26 metabòlits (compost 1-26) de CTE(extracte de Cistanche tubulosa)es van detectar rates anormals i CUS (taula 2). A la figura 3 es presenten cromatogrames UPLC típics de mostres d'orina de rata normal i CUS.

3.4.1. Caracterització dels metabòlits de CTE en raturina normal i CUS

Un total de 18 metabòlits in vivo de CTE(extracte de Cistanche tubulosa)en mostres normals d'orina de rata es van identificar provisionalment. Els metabòlits de degradació de PhG, inclosos HT i CA, i els seus metabòlits addicionals de sulfatació (compost 1, 2, 3, 5, 8 i 16), metilació (6, 21, 22 i 24) i metoxilació (13 i 14) van ser els metabòlits principals a l'orina normal de rata. Els glicòsids iridoides es van metabolitzar fàcilment en aglicones (23, 25 i 26) mitjançant la desglicosilació. Cal destacar que no es va detectar cap component prototip a la mostra normal d'orina de rata.

A la mostra depressiva d'orina de rata, 22 metabòlits de CTE(extracte de Cistanche tubulosa)es van detectar i caracteritzar. S'ha detectat un compost prototip, 8-àcid epilogànic, a l'orina patològica de rata. Altres metabòlits estaven d'acord amb els trobats a l'orina normal de rata, inclosos els metabòlits sulfatats (1, 2, 3, 8, 10 i 16), els metabòlits metilats (6, 11, 19 i 22), els metabòlits metoxilats (13 i 14). de HT i CA, i teaglicones de glicòsids iridoides (25 i 26).

3.4.2. Caracterització dels metabòlits de CTE(extracte de Cistanche tubulosa)en femtes de rata normals i CUS

En aquest estudi, només un metabòlit (compost 20, 3-HPP) de CTE(extracte de Cistanche tubulosa)es va identificar en femtes normals de rata. La majoria dels PhG es van degradar per primera vegada a CA i, en conseqüència, es van sotmetre a un més metabolisme al seu principal metabolit microbià, 3-HPP. A la mostra fecal de la rata CUS, es van caracteritzar provisionalment 3 metabòlits, incloent 3-HPP sulfatat (compost 16) i HT sulfatat (compostos 2 i 3).

3.4.3. Diferències entre metabòlits in vivo de CTE en rats normals i CUSrats

Després de l'administració oral de CTE(extracte de Cistanche tubulosa), els metabòlits in vivo van mostrar diferències òbvies en rates models sanes i depressives. Es van detectar 21 metabòlits (compost 1–3, 5, 6, 8–14, 16, 17 i 19–26) tant en mostres de rates sanes com en CUS. El compost 23 (àcid genipòdic desglicosilat) només es va identificar en mostres de rates sanes, mentre que els compostos 4 (HT), 7 (8-àcid epilogànic), 15 (3, 4-àcid dihidroxibenzèpropiònic) i 18 ({{ 19}}Conjugació de glucurònits HPP) només es van detectar en mostres de rata model CUS. En resum, els components del prototip només es van detectar en rates CUS, mentre que es van descobrir més metabòlits de fase II en rates normals.

4. Discussió

En aquest estudi, tres models d'incubació in vitro que inclouen suc gàstric, suc intestinal, microbiota intestinal de rata normal i CUS es van utilitzar de manera independent i seqüencial per investigar el perfil metabòlic gastrointestinal de la CTE.(extracte de Cistanche tubulosa)in vitro. Es va trobar que PhGs i glicòsids iridoides en CTE(extracte de Cistanche tubulosa)van ser metabolitzats fàcilment als seus glucòsids secundaris i aglicones per la microbiota intestinal depressiva de rata induïda per CUS. Després d'això, el metabolisme in vivo del CTE(extracte de Cistanche tubulosa)també es va verificar en rates normals i CUS. Les vies metabòliques proposades per a CTE(extracte de Cistanche tubulosa)en rates depressives sanes i induïdes per CUS es mostren a la figura 4. Els PhG, com l'equinacòsid i l'acteòsid, es van metabolitzar en HT i CA, i el CA va patir un més metabolisme fins al seu metabòlit microbià principal, 3-HPP. Aleshores, HT, CA i 3-HPP es van metabolitzar als seus metabòlits sulfatats, metilats i metoxilats. Els glicòsids iridoides, inclosos l'àcid genipòdic, el kankanòsid A i el kankanòsid N, es van metabolitzar a les seves aglicones mitjançant desglicosilació. Aquests van demostrar encara més que els PhG i els glicòsids iridoides en CTE(extracte de Cistanche tubulosa)es van metabolitzar fàcilment a glicòsids i aglicons secundaris en rates CUS. Aquests metabòlits normalment presenten una millor absorció intestinal i biodisponibilitat per ser absorbits més a la sang per exercir activitat biològica [16–18]. Val la pena assenyalar que la isomerització era prevalent per als PhG al tracte gastrointestinal, es van identificar metabòlits rellevants després de ser comparats amb el temps de retenció UPLC dels seus compostos prototip basat en un perfil de gradient UPLC ideal optimitzat.

L'àcid cafeic va ser el principal producte de degradació del CTE(extracte de Cistanche tubulosa)per la microbiota intestinal de la rata patològica depressiva. Publicacions anteriors van informar que l'àcid cafeic produeix efectes semblants als antidepressius en la prova de natació forçada en ratolins. Tant el nivell d'ARNm del factor neurotròfic derivat del cervell (BDNF) a l'escorça frontal com el nivell d'ARNm de TrkB a l'amígdala es van reduir significativament després de la prova de natació forçada, i la reducció anterior es va inhibir significativament per l'àcid cafeic [19]. L'hidroxitirosol era l'aglicona dels PhG, que protegeix la neurogènesi i la funció cognitiva evitant la baixada de la proteïna neuronal BDNF induïda per l'estrès [20]. Per tant, cal prestar més atenció a alguns metabòlits bioactius (és a dir, HT i CA) transformats per la microbiota intestinal després de l'administració oral.

A més, els presents descobriments proporcionen evidència que en la microbiota intestinal depressiva, la capacitat metabòlica de generar glucòsids i aglicons secundaris era notablement més feble que la microbiota intestinal de rata anormal. És probable que el motiu s'atribueixi als canvis estructurals de la microbiota intestinal induïts per la depressió, que condueixen a una disminució de l'activitat dels enzims metabòlics produïts per la microbiota intestinal [21]. Curiosament, un estudi anterior va demostrar que el phylum Bacteroidetes codificava els gens de glucòsid hidrolasa i polisacàrid liasa més abundants per a la hidròlisi dels glucòsids i la divisió d'hidrats de carboni complexos amb un mecanisme d'eliminació [22]. Concretament, Bacteroides spp. incloent B. caccae, B. dorei, B. finegoldii,B. fragilis, B. intestinalis, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. uniformis i B. xylanisolvens va mostrar un nombre total dominant de gens que codifiquen GH i PL. Parabacteroides distasonis també té les mateixes característiques [22]. Els nostres estudis anteriors van confirmar que 28-l'estimulació crònica imprevisible de l'estrès del dia va disminuir l'abundància relativa dels gèneres Bacteroides, Parabacteroides, Butyricimonas i Weissella, mentre que va augmentar Ruminococcus i Deinococcus a les rates [4]. Cal destacar que Bacteroides i Parabacteroides eren els dos tàxons microbians més abundants que representaven aproximadament un 20 per cent d'abundància relativa en rates normals. Després del tractament amb CUS, les abundàncies relatives de Bacteroides i Parabacteroides es van reduir bruscament fins al 5% aproximadament en rates model depressives. Per tant, això conduirà inevitablement a una reducció del nombre total d'enzims GH i PL en rates CUS i pertorba encara més la reacció desglicosilada de la microbiota intestinal depressiva CUS després de l'administració oral de CTE.(extracte de Cistanche tubulosa)en rates model.

5. Conclusió

En el present estudi, es va establir i aplicar la tècnica UPLC-Q-TOF-MS per seleccionar i identificar metabòlits deExtracte de Cistanche tubulosaen rates depressives normals i CUS in vitro i in vivo. Els resultats van mostrar que CTE(extracte de Cistanche tubulosa)va ser metabolitzat en aglicones i productes de degradació de PhG i glicòsids iridoides tant per la microbiota intestinal sana com deprimida. Després de l'administració oral de CTE(extracte de Cistanche tubulosa), els metabòlits de fase II d'aglicones i productes de degradació de PhG i iridoidglicòsids es van trobar predominantment a l'orina de rata. La capacitat metabòlica de generar glucòsids i aglicones secundaris en la microbiota intestinal depressiva de rata era molt més feble que la de la microbiota intestinal normal de la rata, que es va atribuir a les glicosidehidrolases desordenades produïdes per la microbiota intestinal en rates deprimides amb CUS. Aquest estudi proporciona una nova perspectiva per a les posteriors. desenvolupament del CTE(extracte de Cistanche tubulosa)com a potencial antidepressiu.

Agraïments

Aquest treball va comptar amb el suport de subvencions del Programa Nacional de Recerca i Desenvolupament Clau de la Xina (2017YFC1702400).

Annex A. Dades complementàries

Es poden trobar dades addicionals d'aquest article en línia a HTTPS://doi.org/10.1016/j.jchromb.2019.121728

De: ' Metabolisme in vitro i in vivo deExtracte de Cistanche tubulosaen rates depressives normals i cròniques imprevisibles induïdes per l'estrèsYang Li, et al

---Journal of Chromatography B 1125 (2019) 121728

Referències

[1] Comissió de Farmacopea Xinesa, The Pharmacopeia of the People's Republic of China, 2015 ed., China Medical Science Press, Beijing, Xina, 2015, pàg. 135 Part I.
[2] Y. Jiang, P.-F. Tu, Anàlisi de constituents químics en espècies de Cistanche, J. Chromatogr. 1216 (2009) 1970–1979.
[3] Z. Fu, X. Fan, X. Wang, X. Gao, Cistanches Herba: una visió general de la seva propietat química, farmacològica i farmacocinètica, J. Ethnopharmacol. (2017), https://doi.org/10.1016/j.jep.2017.10.015.
[4] Y. Li, Y. Peng, P. Ma, H. Yang, H. Xiong, M. Wang, C. Peng, P. Tu, X. Li, Efectes semblants als antidepressius deExtracte de Cistanche tubulosasobre rates d'estrès crònic impredictible mitjançant la restauració de l'homeòstasi de la microbiota intestinal, Front. Pharmacol. (2018), https://doi.org/10.3389/fphar.2018.00967.
[5] JA Foster, MV Neufeld, Eix intestino-cervell: com influeix el microbioma l'ansietat i la depressió, Trends Neurosci. 36 (2013) 305–312.
[6] E. Sherwin, TG Dinan, JF Cryan, Desenvolupaments recents en la comprensió del paper de la microbiota intestinal en la salut i la malaltia del cervell, Ann. NY Acad. Ciència. 12 (2017) e0177977.
[7] Y. Meng, H. Jia, Z. Chao, Y. Yong, Z. Yang, M. Yang, Z. Zou, Variacions en la microbiota intestinal i el fenotip metabòlic fecal associat a la depressió per la seqüenciació del gen 16S rRNA i LC/ Metabolòmica basada en MS, J. Pharm. Biomed. Anal. 138 (2017) 231–239.

[8] JR Kelly, Y. Borre, BC O', E. Patterson, AS El, J. Deane, PJ Kennedy, S. Beers, K. Scott, G. Moloney, Transferring the blues: depression-associated gut microbiota induces canvis neuroconductuals a la rata, J. Psychiatr. Res.. 82 (2016) 109–118.
[9] L. Yang, P. Ying, M. Wang, P. Tu, X. Li, Metabolisme gastrointestinal humà de l'extracte d'aigua Cistanches Herba in vitro: dilucidació del perfil metabòlic basat en la identificació completa de metabòlits en suc gàstric, intestinal suc, bacteris intestinals humans i microsomes intestinals, J. Agric. Química dels Aliments. 65 (2017) 7447–7456.
[10] Y. Li, G. Zhou, S. Xing, P. Tu, X. Li, Identificació dels metabòlits d'equinacòsid produïts per bacteris intestinals humans mitjançant cromatografia líquida d'ultra-rendiment/espectrometria de masses en temps de vol quadrupol, J. Agrícola. Química dels Aliments. 63 (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, G. Zhou, Y. Peng, P. Tu, X. Li, Cribratge i identificació de tres metabòlits típics de glucòsids feniletanoides de Cistanches Herba per bacteris intestinals humans mitjançant UPLC/Q-TOF-MS, J. Farmàcia. Biomed. Anal. 118 (2016) 167–176.
[12] L. Yang, P. Ying, M. Wang, G. Zhou, Y. Zhang, X. Li, detecció ràpida i identificació de les diferències entre metabòlits de Cistanche deserticola i extracte d'aigua de C. tubulosa en rates per UPLC- Anàlisi combinada de reconeixement de patrons Q-TOF-MS, J. Pharm. Biomed. Anal. 131 (2016) 364–372.
[13] C. Q, P. Y, B. X, Z. W, C. L, L. X, caracteritzen sistemàticament els metabòlits de l'equinacòsid i l'acteòsid de Cistanche tubulosa en plasma de rata, bilis, orina i femta a partir de UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Cromatogr. 30 (2016) 1406–1415.
[14] Y. Wang, H. Hao, G. Wang, P. Tu, Y. Jiang, Y. Liang, L. Dai, H. Yang, L. Lai, C. Zheng, Un enfocament per identificar metabòlits seqüencials de un glucòsid feniletanoide típic, l'equinacòsid, basat en la cromatografia líquida-temps de trampa d'ions de
anàlisi d'espectrometria de masses de vol, Talanta 80 (2009) 572–580.
[15] C. Jia, H. Shi, W. Jin, K. Zhang, Y. Jiang, M. Zhao, P. Tu, Metabolisme de l'echinacòsid, un bon antioxidant, en rates: aïllament i identificació dels seus metabòlits biliars, Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 431–438.
[16] J. Xu, HB Chen, SL Li, Comprensió dels mecanismes moleculars de la interacció entre les herbes medicinals i la microbiota intestinal, Med. Res. Rev. 37 (2017) 1140–1185.
[17] H. Liu, J. Yang, F. Du, X. Gao, X. Ma, Y. Huang, F. Xu, W. Niu, F. Wang, Y. Mao, Absorció i disposició dels ginsenòsids després de l'administració oral administració d'extracte de Panax notoginseng a rates, Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 2290–2298.
[18] JM Laparra, Y. Sanz, S. Schaffer, F. Visioli, Interactions of gut microbiota with functional food components and nutraceuticals, Pharmacol. Res. 61 (2010) 219–225.
[19] H. Takeda, M. Tsuji, T. Yamada, J. Masuya, K. Matsushita, M. Tahara, M. Iimori, T. Matsumiya, L'àcid cafeic atenua la disminució de l'expressió d'ARNm de BDNF cortical induïda per l'exposició a força estrès de natació en ratolins, Eur. J. Pharmacol. 534 (2006) 115–121.
[20] A. Zheng, L. Hao, C. Ke, X. Jie, Z. Xuan, L. Yuan, C. Cong, J. Liu, Z. Feng, L'administració materna d'hidroxitirosol millora la neurogènesi i la funció cognitiva en l'estrès prenatal. descendència, J. Nutr. Bioquímica. 26 (2015) 190–199.
[21] H. Li, J. He, W. Jia, La influència de la microbiota intestinal sobre el metabolisme i la toxicitat dels fàrmacs, Opinió experta. Drug Metab. Toxicol. 12 (2016) 31.
[22] KA El, F. Armougom, JI Gordon, D. Raoult, B. Henrissat, L'abundància i varietat d'enzims actius en carbohidrats a la microbiota intestinal humana, Nat. Rev. Microbiol. 11 (2013) 497–504.