Augment dels nivells de YKL-40 però no de proteïna C-reactiva en pacients amb malaltia d'AlzheimerⅡ
Apr 11, 2023
2. Material i Mètodes
2.1. Donants humans
En aquest estudi es van incloure un total de 123 subjectes: (1) subjectes grans sense demència sense cap evidència de cap malaltia neurodegenerativa (controls saludables) classificats com a controls (n=37); (2) MCI degut a pacients amb AD (MCI) (n=22); (3) probable pacients amb MA esporàdic lleu/moderat-sever (n=34); (4) Pacients amb EP (n=30). Els participants de l'estudi es van inscriure a la Clínica de Memòria (controls, subjectes MCI i AD) i a la Unitat de Trastorns del Moviment (participants en DP) de l'Hospital Universitari 12 d'octubre (Madrid, Espanya). Les característiques demogràfiques i clíniques dels subjectes es mostren a la taula 1.
Tots els participants es van classificar mitjançant criteris de diagnòstic establerts en aquells amb MCI o demència d'AD probable [43–45]. El diagnòstic es va basar en una avaluació clínica detallada, avaluació neuropsicològica i neuroimatge (MRI). El deteriorament funcional es va mesurar mitjançant la puntuació de la classificació clínica de demència (CDR) [46].
Feu clic a cistanche tcm per tractar la malaltia de Parkinson i la malaltia d'Alzheimer
Els pacients amb PD es van diagnosticar seguint els criteris de diagnòstic clínic de la Movement Disorder Society (MDS) [47] i tots els criteris complits per a la PD clínicament establerta. Els pacients amb PD no es referien a queixes cognitives i no presentaven símptomes de demència. El grup control estava format per individus cognitivament normals de 50 anys o més, sense signes clínics de deteriorament cognitiu i antecedents de malaltia neurològica o psiquiàtrica.
Els criteris d'exclusió per a cada participant van ser la malaltia cerebrovascular significativa concomitant i l'evidència de qualsevol comorbiditat neurològica, psiquiàtrica, medica o mèdica no neurològica que pogués afectar la cognició o la funció motora. L'aprovació de l'estudi es va obtenir del Comitè d'Ètica de la Recerca de l'Hospital Universitari 12 d'octubre i tots els participants van proporcionar el consentiment informat per escrit.
2.2. Mostra de fluids
Es van recollir mostres de LCR de tots els subjectes (inclosos pacients sans i subjectes MCI, AD i PD) i es van processar segons procediments estandarditzats mitjançant punció lumbar en tubs de polipropilè estèrils de 15 ml. A continuació, es van centrifugar les mostres a 3000 rpm a 4 ◦ C durant 10 min. Les alíquotes sobrenedants es van emmagatzemar a -80 ◦ C en tubs criogènics de polipropilè de 0,5 ml amb còctel inhibidor de proteasa (Roche, Basilea, Suïssa).
Es van obtenir mostres de sang mitjançant puncions de vena antecubital de pacients i subjectes sans. El plasma es va aïllar de sang sencera recollida en tubs de 7 ml d'EDTA-2Na. La sang sencera es va centrifugar a 2000 rpm durant 10 minuts a temperatura ambient. Els sobrenedants es van recollir i es van repartir en alíquotes en tubs criogènics de polipropilè amb un còctel d'inhibidor de proteases (Roche, Basilea, Suïssa) i es van emmagatzemar a -80 ◦C.
2.3. Mostres de teixits
El teixit de l'escorça orbitofrontal cerebral postmortem es va obtenir de donants cerebrals diagnosticats amb AD i individus control. Les mostres congelades van ser subministrades per l'Institut de Neuropatologia Banc de Cervells IDIBELL-Hospital Universitari de Bellvitge (Hospitalet de Llobregat, Espanya). El consentiment del subjecte es va obtenir d'acord amb la Declaració d'Hèlsinki i l'aprovació va venir del Comitè d'Ètica de la Recerca de la institució responsable.
Per a tots els casos, es disposava de consentiment informat per escrit. Els subjectes es van seleccionar en funció del diagnòstic postmortem d'AD segons la patologia de l'embolic neurofibril·lar i les plaques A [48]. Els casos d'AD van mostrar un alt canvi neuropatològic d'AD (estadi de Braak V/VI i puntuació de placa neurítica de moderada a freqüent). Els participants control es van considerar aquells amb/sense símptomes neurològics o un baix grau de canvi neuropatològic de l'AD. Es van classificar un total de 24 mostres en AD i controls, tal com es presenta a la taula 2.
2.4. Purificació d'ADN i genotipat de l'apolipoproteïna E (APOE).
L'ADN genòmic es va extreure de sang perifèrica mitjançant QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanya), segons les instruccions del fabricant. Es van detectar polimorfismes humans APOE C112R i R158C per identificar els al·lels APOE ε2, ε3 i ε4, mitjançant el LightCycler 480 II Instruments Kit (Roche Diagnostics, Basilea, Suïssa) seguint les instruccions del fabricant.
2.5. Anàlisi de proteïnes
Les concentracions plasmàtiques i de LCR dels biomarcadors neuroinflamatoris (YKL{0}} i CRP) es van analitzar mitjançant kits ELISA (Human Chitinase 3-com 1 Quantikine ELISA kit (DC3L10), R+D; Human CRP Quantikine ELISA kit (DCRP{) {5}}), R+D) segons les instruccions del fabricant. També es van examinar els nivells de proteïnes cerebrals YKL-40 i GFAP mitjançant Western blotting. El teixit de l'escorça orbitofrontal cerebral postmortem es va obtenir de donants cerebrals diagnosticats amb AD i individus control.
Breument, les mostres de còrtex orbitofrontal cerebral humà es van incubar i homogeneïtzar en tampó de lisi (tampó Tris/HCl 50 mM, pH 7,4 que conté EDTA 2 mM, 0,2 per cent de Nonidet P-40, PMSF 1 mM, proteasa, i còctels d'inhibidor de fosfatasa; Roche, Basilea, Suïssa) i es va centrifugar durant 10 min a 14,000 rpm a 4 ◦C. Els sobrenedants es van recuperar i emmagatzemar a -80 ◦ C. El contingut de proteïnes es va determinar mitjançant el mètode BCA (Thermo Fisher Scientific, MA, EUA). Es van barrejar quantitats iguals de proteïnes (20 µg per YKL-40 i 5 µg per a GFAP) amb tampó de mostra de Laemmli suplementat amb -mercaptoetanol, escalfat a 95 ◦ C durant 5 min, resolt amb un 10 per cent de NuPAGE Bis-Tris Gels ( Thermo Fisher Scientific, MA, EUA) i transferit a membranes de difluorur de polivinilidè (PVDF) (Millipore, MA, EUA).
Després, les membranes es van bloquejar i es van incubar durant la nit a 4 ◦ C amb anticossos primaris: un anticòs monoclonal de conill recombinant anti-YKL-40 (ab255297, 1:500, Abcam) i un anticòs monoclonal anti-GFAP de ratolí (G3893, 1). :0000, Sigma Aldrich). A continuació, es van incubar les membranes durant 1 h amb els anticossos secundaris conjugats a la peroxidasa de rave picant (HRP) adequats (G-21234, 1:5000, Thermo Fisher Scientific, MA, EUA; ab97023, 1:40000, Abcam).
La càrrega de proteïnes es va controlar mitjançant anticossos monoclonals conjugats amb HRP de ratolí contra -tubulina (ab40742, 1:5000, Abcam) per YKL{-40 o contra -actina (A1978, Sigma Aldrich) per a la detecció de GFAP. Els immunocomplexes es van revelar mitjançant un reactiu de quimioluminescència millorat (ECL Clarity; Bio-Rad, CA, EUA). La quantificació densitomètrica es va dur a terme amb el programari Image Studio Lite 5.0 (Li-COR Biosciences, NE, EUA). Les bandes de proteïnes es van normalitzar als controls de càrrega i es van expressar com a percentatge del grup control
2.6. Anàlisi estadística
Les anàlisis estadístiques i els gràfics es van realitzar mitjançant el programari Stata/IC (Stata 16.1, StataCorp LLC, College Station, TX, EUA) i Prism (GraphPad Software versió 8.00, La Jolla, CA, EUA). Després d'avaluar la normalitat de la distribució, es van analitzar les diferències en els nivells de CSF i plasma YKL-40 i CRP entre grups mitjançant la prova de rang Kruskal-Wallis no paramètrica. El valor p per a les comparacions per parelles es mostra amb la correcció de Bonferroni. Es va realitzar un model de regressió lineal múltiple descriptiu per tenir en compte les variables de confusió (edat, sexe i APOE ε4) en l'anàlisi d'associació CSF YKL-40.
Les interaccions de variables de confusió amb el diagnòstic clínic es van excloure del model (importància per a tot el conjunt d'interaccions: p > 0.10). El coeficient de regressió es mostra com a "b". Les diferències en la distribució del sexe, l'edat dels participants, l'edat d'inici i els anys des de l'inici de la malaltia entre grups es van avaluar amb les proves de chi quadrat de Pearson i ANOVA, si escau.
Les associacions entre biomarcadors i característiques demogràfiques es van examinar amb les proves de correlació de Pearson, les proves t de Student i les proves U de Mann-Whitney, si escau. Es va realitzar una prova de tendència no paramètrica (test de tendència Jonckheere) per avaluar l'existència d'una tendència quan l'exposició mostrava categories ordinals. Les corbes ROC es van construir després de modelar la presència o absència d'un diagnòstic clínic determinat amb una anàlisi logística de regressió.
Els nivells d'expressió de YKL{{0}} i GFAP Western blot es van normalitzar als seus respectius controls de càrrega (-tubulina i -actina) i es van comparar amb la mitjana de la relació de control amb la prova no paramètrica de Mann-Whitney U. Als gràfics, els nivells de LCR i plasma YKL-40 i CRP es mostren com a rang mitjà i interquartil. L'expressió cerebral de YKL-40 es mostra com la mitjana ± error estàndard de la mitjana (SEM). En tots els casos, la significació estadística es va establir en p <0,05.
El mecanisme de Cistanche tracta la malaltia d'Alzheimer i la malaltia de Parkinson
Cistanche és una herba que s'ha utilitzat tradicionalment a la medicina xinesa per tractar una varietat de condicions de salut, com ara trastorns neurològics com la malaltia d'Alzheimer (MA) i la malaltia de Parkinson (MP). Cistanche conté diversos compostos bioactius, inclosos glicòsids feniletanoides i glicòsids iridoides, que tenen efectes antioxidants, antiinflamatoris i neuroprotectors. Aquests compostos ajuden a protegir les cèl·lules neuronals del dany causat pels radicals lliures i els processos inflamatoris, que es creu que contribueixen al desenvolupament i progressió de l'AD i la PD.
A més, s'ha demostrat que Cistanche augmenta els nivells de certs neurotransmissors al cervell, incloses la dopamina i l'acetilcolina, que són importants per al funcionament normal del cervell. En augmentar aquests nivells de neurotransmissors, Cistanche pot ajudar a millorar la funció cognitiva i reduir els símptomes de la MA i la MP.
En general, els mecanismes de Cistanche en el tractament de l'AD i la PD impliquen els seus efectes antioxidants, antiinflamatoris i neuroprotectors, així com la seva capacitat per millorar els nivells de neurotransmissors al cervell.
continuarà...
Víctor Antonio Blanco-Palmero 1,2,3,† , Marcos Rubio-Fernández 1,2,†, Desireé Antequera 1,2 , Alberto Villarejo-Galende 1,2,3 , José Antonio Molina 1,2,3, Isidro Ferrer 1,4,5,6 , Fernando Bartolome 1,2,* i Eva Carro 1,2,*
1 Xarxa del Centre d'Investigació Biomèdica en Malalties Neurodegeneratives (CIBERNED), 28031 Madrid, Espanya; victorb1989@gmail.com (VAB-P.); marcosrubio.imas12@h12o.es (MR-F.); eeara@yahoo.es (DA); avgalende@yahoo.es (AV-G.); cvillaiza@telefonica.net (EMMALLADA); 8082ifa@gmail.com (SI)
2 Grup de Malalties Neurodegeneratives, Hospital 12 de Octubre Institut de Recerca (imas12), 28041 Madrid, Espanya
3 Servei de Neurologia Hospital Universitari 12 d'octubre, 28041 Madrid, Espanya
4 Institut de Recerca Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL), Hospitalet de Llobregat, E08907 Barcelona, Espanya
5 Departament de Patologia i Terapèutica Experimental, Universitat de Barcelona, E08900 Barcelona, Espanya 6 Institut de Neurociències, Universitat de Barcelona, E08000 Barcelona, Espanya * Correspondència: fbartolome.imas12@h12o.es (FB); carroeva@h12o.es (EC); Tel.: més 34-913908765 (FB & EC); Fax: més 34-913908544 (FB i EC)
