Els nanozims que imiten la catalasa sensibles a la infamació alleugen la lesió renal aguda mitjançant la reversión de l'estrès oxidatiu local Ⅳ
Jun 19, 2024
Conclusió
Herbes orgàniques per a la malaltia renal
Materials i mètodes
Materials
Síntesi i caracterització de nanopartícules dMn3O4
La síntesi de TK linker, TK linker conjugat polietilè glicol (PEG-TK) i conjugat (PEG)-estearina (C18) (PTC) es va realitzar segons la nostra publicació anterior [15]. Com a control, també vam preparar polímers no sensibles a ROS (PC) conjugant l'àcid esteàric a PEG-AM. Breument, es van fer reaccionar 200 mg d'amina m-PEG amb 160 mg d'àcid esteàric amb 160 µl de TEA, 480 mg d'EDC i 290 mg de NHS en 20 ml de DMF a 37 graus durant la nit amb agitació sota purga de N2. A continuació, la mostra es va purificar per diàlisi (MWCO=12-14 KDa) contra DW durant un dia, seguit d'assecat per congelació. Les estructures químiques del PTC i del PC sintetitzats es van confirmar mitjançant espectroscòpia de ressonància magnètica nuclear de protons (1 H RMN) (400 Hz, Bruker: Billerica, MA, EUA) en cloroform (CHCl3). Es van preparar micel·les buides PTC sensibles a ROS i PC no sensibles a ROS mitjançant l'autoassemblatge de PTC i PC sota sonicació i diàlisi.
Preparació i caracterització de l'enzim sensible a ROS (PTC-M)
PTC-M es va preparar pel mètode de diàlisi. Breument, es van dissoldre 2 mg de dMn3O4 i 10 mg de PTC en 1 ml de sulfòxid de dimetil anhidre (DMSO). A continuació, la barreja es va afegir gota a gota a 20 ml de DW sota sonicació de la sonda (30% d'amplitud, 5 s ON/OFF, 5 min). A continuació, es va dialitzar la solució (MWCO=12–14 KDa) contra DW durant un dia, seguit d'una liofilització. De la mateixa manera, també es van preparar nanomicel·les no sensibles a ROS carregades amb dMn3O4 (PC-M) com a grup de control. Els diàmetres hidrodinàmics i el potencial zeta de les nanomicel·les buides preparades (PTC i PC) i nanomicel·les carregades amb dMn3O4 NP (PTC-M i PC-M) es van avaluar mitjançant la dispersió de la llum dinàmica (instrument Zetasizer Nano Z, Malvern, Regne Unit). La morfologia del PTC i PTC-M preparats es va visualitzar mitjançant FE-TEM. La desestabilització sensible a ROS mitjançant la degradació de l'enllaç TK de PTC-M es va observar mitjançant l'anàlisi DLS i FE-TEM després de tractar les mostres amb H2O2 1 mM. El contingut de càrrega de dMn3O4 al PTC-M final es va analitzar mitjançant un analitzador termogravimètric (TGA N-1000, Scinco, Seül, Corea) i una anàlisi ICP-MS (820 ICPMS Varian Bruker, Billerica, MA, EUA) .
La descomposició de H2O2 en aigua i oxigen també es va confirmar utilitzant Ru (DDP) com a sonda per a la generació d'oxigen. Breument, es va afegir 1 mM H2O2 a les mostres i desprésmitjançant l'addició d'1 µM Ru (dDDP(DMF). Les mostreses van barrejar a fons i la intensitat de la fluorescènciaa l'excitació 440 nm i l'emissió 530 – 730 nm eragravat. Més tard, també es va confirmar la producció d'oxigendeterminant la concentració d'oxigen dissolt utilitzantun sensor d'oxigen dissolt (RDO Optical Dissolved Sensor, Thermo Scientific).
Cultiu cel·lular i reactius
Els estudis in vitro es van realitzar tal com es va descriure anteriorment [37]. En resum, es van utilitzar cèl·lules epitelials tubulars proximals renals humanes (cèl·lules HK-2, American Type Culture Collection, Manassas, VA, EUA) per als estudis i vitro. Les cèl·lules HK-2 es van cultivar i es van passar cada 3-4 dies en plats de 100-mm que contenien una combinació de medi Eagle's modificat de Dulbecco (DMEM) i Hams F-12 (Welgene, Daegu, Corea) complementat amb sèrum boví fetal al 10% (FBS; Welgene), 100 U/ml de penicil·lina, i 100 mg/ml d'estreptomicina (Sigma-Aldrich). TeLes cèl·lules HK-2 es van incubar després en una atmosfera humidificadaesfera del 5% de CO2i 95% d'aire a 37 graus durant 24 h, i subcultiu fins al 70-80% de confluència. Les cèl·lules HK-2 erenen plats de 60-mm en un medi que conté un 10%FBS i incubat durant 24 h. Aleshores es van incórrer en les cèl·lules
Viabilitat cel·lular
Absorció cel·lular
Citometria de flux
L'anàlisi de citometria de flux es va realitzar tal com es va descriure anteriorment [38]. Es va utilitzar un kit de tinció d'annexina V FLUOS (SigmaAldrich) per mesurar el nivell d'unió de l'annexina V segons les instruccions del fabricant. Breument, després del tractament amb 0 o 1 mM H2O2 durant 24 h amb o sense 2 ug de pretractament PTC-M, les cèl·lules HK-2 es van collir i es van rentar dues vegades amb solució salina tamponada amb fosfat prèviament refredada i es van tornar a suspendre. en un tampó d'unió que conté annexina V. Després d'incubar a les fosques durant 15 min, les cèl·lules es van analitzar mitjançant citometria de flux (Becton–Dickinson, San Jose, CA, EUA). Es van utilitzar diversos controls per optimitzar la configuració de l'instrument i determinar la porta per a la plataforma basada en Windows. Les cèl·lules apoptòtiques es van definir com a PI negatives i Annexina V-FITC positives.
Determinació de la generació intracel·lular de ROS
Per determinar la generació de ROS, hem utilitzat el fluoròfor DCF-DA (Molecular Probes, Eugene, OR, EUA) tal com es va descriure anteriorment [38]. Les cèl·lules HK-2 es van incubar amb 0 o 1 mM H2O2 durant 24 h amb o sense 2 ug de pretractament PTC-M, i es van rentar dues vegades amb la solució de sal equilibrada de Hank, després es van incubar amb la sal equilibrada de Hank. solució (sense vermell de fenol) que conté DCF-DA durant 30 min a 37 graus a la foscor. Les imatges es van obtenir amb un microscopi de fluorescència (Nikon, Tòquio, Japó).
Animals experimentals i protocols
Biodistribució in vivo
Per comprovar l'efecte terapèutic de PTC-M in vivo, el grup de tractament va rebre una dosi única de 0,5 mg/kg de PTC-M mitjançant injecció en la vena de la cua després de la cirurgia. Els ratolinsvan ser sacrificats després de 48 hores de reperfusió. Mostres de sangvan ser recollits del cor, i elronyó esquerreeras'eliminen i es processen ràpidament per a Western blotting ofixat en una solució de paraformaldehid al 4% per a immunohistoquímica (IHC). Elronyó dretestava congelat a−80 grausper a l'anàlisi en temps real de la reacció en cadena de la polimerasa (PCR).
Mesura de NGAL en plasma
Immunoblotting semicuantitatiu
L'anàlisi de Western blot es va realitzar tal com es va descriure anteriorment [37]. Els teixits renals es van homogeneïtzar en una solució d'aïllament gelada que contenia 0, 3 M de sacarosa, 25 mM d'imidazol, 1 mM d'àcid etilendiaminotetraacètic (EDTA), 8,5 mM de leupeptina i 1 mM de fluorur de fenilmetilsulfonil (pH 7,2). Els homogeneïts es van centrifugar a 4000 × g durant 15 min a 4 graus per eliminar cèl·lules senceres, nuclis i mitocondris. La concentració total de proteïnes es va mesurar mitjançant un kit d'assaig d'àcid bicinconínic (BCA) (Pierce; Rockford, IL, EUA). Totes les mostres es van ajustar per assolir les mateixes concentracions finals de proteïnes. A continuació, es van dissoldre a 65 graus durant 15 min en un tampó de mostra que contenia dodecil sulfat de sodi (SDS) i es van emmagatzemar a -20 graus. Per confirmar la càrrega igual de les proteïnes, es va tenyir un gel inicial amb blau Coomassie. L'electroforesi en gel de SDS-poliacrilamida (PAGE) es va realitzar en gels de poliacrilamida al 9 o al 12%. Les proteïnes es van transferir electroforèticament a membranes de nitrocel·lulosa (Hybond ECL RPN3032D; Amersham Pharmacia Biotech; Little Chalfont, Regne Unit) mitjançant un aparell Bio-Rad Mini Protean II (Bio-Rad; Hercules, CA, EUA). Les taques es van bloquejar amb llet al 5% en PBS-T (80 mM Na2HPO4, 20 mM NaH2PO4, 100 mM NaCl i 0,1% Tween-20 a pH 7,5) durant 1 h; incubat durant la nit a 4 graus amb anticossos primaris; i s'incuba després amb anticossos secundaris anti-conill, anti-ratolí o anti-cabra conjugats amb peroxidasa de rave picant. A continuació, es van visualitzar les immunoblots mitjançant un sistema de quimioluminescència millorat. Els nivells de proteïnes es van quantificar mitjançant densitometria. Les intensitats relatives dels senyals d'immunoblot es van mesurar mitjançant densitometria mitjançant el programari Scion Image per a Windows (Scion Corporation, 2000–2001. versió Alpha 4.0.3.2. MD, EUA) i es van expressar com a canvis de plecs en relació amb els controls. Els anticossos primaris i secundaris utilitzats en immunoblot es mostren a la taula S1.
Reacció en cadena de la polimerasa en temps real (PCR en temps real)
L'anàlisi de la reacció en cadena de la polimerasa es va realitzar tal com es va descriure anteriorment [37]. Les còrtexs renals es van homogeneïtzar en el reactiu Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). L'ARN es va extreure amb cloroform, es va precipitar amb isopropanol, es va rentar amb etanol al 75% i després es va dissoldre en DW. La concentració d'ARN es va determinar per l'absorbància a 260 nm (Ultraspec 2000; PharMacia Biotech, Cambridge, Regne Unit). L'expressió d'ARNm de citocines inflamatòries i molècules d'adhesió es va determinar mitjançant PCR en temps real. L'ADNc es va fer mitjançant la transcripció inversa de 5 ug d'ARN total mitjançant l'amortiment d'oligo (dT) i la transcriptasa inversa de superíndex II (InvitRogen, Carlsbad, CA, EUA). L'ADNc es va quantificar mitjançant un sistema Smart Cycler II (Cepheid, Sunnyvale, CA, EUA) i es va utilitzar SYBR Green per a la detecció. Cada reacció de PCR es va realitzar en 10 pM d'imprimació directa, 10 pM d'imprimació inversa, 2X SYBR Green Premix Ex Taq (TAKARA BIO INC, Seta 3-4-1, Japó), 0,5 ul d'ADNc i H2O per portar el volum final a 20 ul. Els nivells relatius d'ARNm es van determinar mitjançant PCR en temps real, utilitzant un sistema detector Rotor-GeneTM 3000 (Corbette research, Mortlake, NSW, Austràlia). Les seqüències dels primers s'enumeren al fitxer addicional 1: taula S2. La PCR es va realitzar segons els passos següents: 1) 95 graus durant 5 min; 2) 95 graus durant 20 s; 3) 58 a 60 graus durant 20 s (optimitzat per a cada parell d'imprimadors) i 4) 72 graus durant 30 s per detectar SYBR Green. Els passos 2-4 es van repetir durant 40 cicles addicionals, mentre que al final de l'últim cicle, la temperatura es va augmentar de 60 a 95 graus per produir una corba de fusió. Les dades de la reacció es van recollir i analitzar amb el programari de recerca Corbett. Els valors de llindar crítics comparatius de mesures quadruplicades es van utilitzar per calcular l'expressió gènica, amb la normalització a GAPDH com a control intern. Es va realitzar una anàlisi de la corba de fusió per millorar l'especificitat de la reacció d'amplificació.
Histologia
La preparació del teixit renal va procedir tal com es va descriure anteriorment [37]. Els teixits renals es van fixar amb paraformaldehid al 4%, es van incrustar en parafina i es van tallar en seccions de 3- μm de gruix. La tinció periòdica d'àcid-Schif es va realitzar segons les instruccions del fabricant (Abcam, Cambridge, MA, EUA). Per a la immunohistoquímica, les seccions de teixit desparafinat es van recuperar l'antigen escalfant-se a 1{{10}}0 grau durant 15 min en tampó de citrat, pH 6.0 (Sigma- Aldrich). Les seccions es van incubar durant la nit a 4 graus amb anticossos primaris diluïts en tampó de bloqueig (1% [p/v] d'albúmina sèrica bovina dissolta en 0,3% [v/v] Triton X-100 preparat en PBS [0,3% PBS- T]). Després de rentar breument les seccions tres vegades amb PBS-T al 0, 3%, es van incubar durant 1 h a RT amb anticossos secundaris diluïts en tampó de bloqueig. Les puntuacions de lesions tubulars es van calcular mitjançant el mètode descrit anteriorment [39, 40]. La puntuació de la lesió tubular es va mesurar mitjançant l'examen d'una unió corticomedul·lar superior o igual a 10 HPF (ampliació × 200) en seccions tacades de PAS (n=5-7). Els anticossos primaris i secundaris utilitzats en les anàlisis immunohistoquímiques es mostren a la taula S3. L'apoptosi de cèl·lules epitelials tubulars es va detectar amb la tinció de TUNEL amb ApopTag Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Kit (Sigma-Aldrich), segons les instruccions del fabricant. Es van recollir seccions de teixit de tots els òrgans principals incrustades en parafina i es van tacar amb hematoxilina/eosina (H&E) per comparar els canvis histològics.
Anàlisi estadística
Els resultats s'expressen com l'error estàndard mitjà de la mitjana (SEM). Es van realitzar múltiples comparacions entre els tres grups mitjançant l'anàlisi unidireccional de la variància (ANOVA) i la prova de diferència significativa de Tukey post hoc. Les diferències amb valors p inferiors a 0,05 es van considerar significatives.
