Les interaccions entre els antioxidants polifenòlics quercetina i naringenina dicten el comportament químic i biològic de les seves mescles relacionat amb l'oxidació-redox, part 1

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

Recerca realitzada durant les últimes dues dècades sobre la base molecular de malalties cròniques no infeccioses com araaterosclerosi, hipertensió, la diabetis i, sobretot, el càncer, que han captat un gran interès, ha revelat que totes aquestes malalties comparteixen un factor de risc comú, que és la interrupció de l'homeòstasi redox sovint anomenada estrès oxidatiu12. Sorgeix com a conseqüència d'un augment del nivell endògen d'espècies reactives d'oxigen (ROS) a causa de la fallada de la barrera antioxidant del cos i es creu que promou el desenvolupament de totes aquestes malalties.3. Així, es va suposar que els factors exògens capaços de neutralitzar les ROS, per exemple els antioxidants vegetals, podrien contrarestar o frenar el desenvolupament de malalties cròniques i donar suport al seu tractament. La verificació d'aquesta hipòtesi va iniciar estudis detallats sobre els antioxidants presents en els aliments que podrien presentar potencial preventiu4. De fet, diversos estudis resumits en la metaanàlisi que comparen el consum d'aliments i les malalties cròniques relacionades amb la dieta van revelar una disminució del risc en el cas de dietes riques en fruites i verdures, cereals integrals i begudes com el vi, el cafè i el te. per tant, productes rics en fitoquímics antioxidants. No en va, es va suposar que aquestes substàncies un cop aïllades de les seves fonts naturals, purificades i consumides després en forma de suplements dietètics que contenien dosis més altes que les que es poden aconseguir en la dieta podrien convertir-se en potents agents quimiopreventius. Aquesta hipòtesi va ser confirmada per un gran nombre d'evidències procedents d'estudis que exploten diversos models experimentals in vitro i in vivo de malalties cròniques, inclòs el càncer. . Per exemple, dues metaanàlisis d'investigacions de cohorts humanes i casos-control amb vitamina E8 o preparats de micronutrients" van concloure que els nivells baixos d'antioxidants no tenien cap efecte, mentre que les dosis altes podrien augmentar tant la incidència com la mortalitat del càncer i les malalties cardiovasculars. Els suplements es basaven en plantes reals, com ara una barreja específica d'aliments concentrats rics en polifenols (magrana, te verd, bròquil i cúrcuma), es va observar un efecte protector significatiu en homes amb càncer de pròstata1.

Feu clic aquí per saber-ne més

Els efectes prometedors dels aliments integrals en contrast amb els compostos aïllats estan en línia amb el concepte de sinergia alimentària, que es defineix com un additiu o més que la influència additiva de la combinació de diferents ingredients alimentaris sobre la salut humana. El nostre estudi anterior va verificar aquest concepte comparant les bioactivitats dels aliments reals amb el seu antioxidant principal aïllat. Això va demostrar que els efectes biològics dels extractes de baies difereixen enormement dels que presenta l'antocianina cianidina-3-O-glucòsid. Alguns altres informes també van indicar la importància de les interaccions entre diferents compostos bioactius i components de la matriu alimentària que van resultar ser factors cooperants, que determinen la bioactivitat final dels aliments3-1. Les nostres investigacions mecàniques recents que impliquen la reconstitució gradual de la composició de cacau de bioactiu també van donar suport a la idea de la sinergia alimentària, però van demostrar que els efectes biològics de mostres amb composicions complexes no són només una combinació de les activitats que mostren els components individuals. Totes aquestes observacions van suggerir que quan es consideren bioactivitats relacionades amb redox d'antioxidants aïllats versus les seves mescles, s'han de tenir en compte les interaccions entre components. La creixent complexitat d'una barreja defitoquímicssemblava crear un nousubstància redox-activaen lloc d'enriquir la mescla amb noves activitats característiques del compost afegit, que es dedueix pel concepte de sinergia alimentària.

Cistanche pot millorar la immunitat

En la investigació actual, hem simplificat el sistema experimental limitant-lo a només dues estructures bàsiques per tal d'aprofundir en els detalls de les seves interaccions en el context de l'estructura química, la reactivitat redox i les bioactivitats relacionades amb redox, per permetre una millor comprensió i predicció del potencial quimiopreventiu dels antioxidants. 'Els fitoquímics utilitzats per a aquest propòsit eren antioxidants comuns presents en diverses herbes, verdures i fruites, especialment en els cítrics, a saber: flavonols representats per la quercetina (O) i la seva rutina-rhamno-side ( R) i flavanones per la naringenina (N-) i la sevaneohesperidósidnaringina (N plus ) així com dues mescles d'aquests compostos (QN-, RN plus ). La composició química de l'estudi va incloure determinacions que van donar una visió de la termodinàmica i la cinètica dels processos oxidatius, és a dir, la prova de DPPH, la titulació potenciomètrica i la voltametria de pols diferencial (DPV). Les proves biològiques van examinar l'impacte de les mostres estudiades en el creixement cel·lular (test MTT), l'activitat antioxidant cel·lular (assaig CAA), la genotoxicitat (assaig de cometes), el nivell global de metilació de l'ADN (versió epigenètica de l'assaig de cometa) i l'expressió de 84 redox. -gens relacionats (tecnologies basades en matrius de PCR en temps real). Els experiments biològics es van dur a terme utilitzant la línia cel·lular recomanada per a estudis nutricionals d'adenocarcinoma de còlon HT29 com a model de l'epiteli intestinal que pot estar exposat a concentracions relativament altes d'antioxidants ingerits.

Resultats

Les nostres investigacions anteriors que van comparar les propietats relacionades amb redox del cacau en pols i els seus components principals van assenyalar la importància de les interaccions entre els components polifenòlics de la mescla en l'activitat antioxidant global. En la investigació actual, hem simplificat el sistema experimental per examinar aquestes interaccions amb més detall per a un parell de flavonoides que són components alimentaris comuns. Es van triar dos flavonoides, tant en forma d'aglicones com de glicòsids. Els flavonols estaven representats per la quercetina (Q) i la sevaramnòsid-rutina(R) iflavanonesper la naringenina (N-) i la seva naringina neohesperidósid (N plus ). Aquests polifenols es diferencien pel nombre i la ubicació dels grups hidroxil actius redox, així com per la capacitat de formar enllaços H intramoleculars, és a dir, tres característiques estructurals que poden interferir amb la reducció de les propietats dels compostos antioxidants. Com es mostra a la figura 1, els radicals semiquinona intermedis es van formar en el primer pas d'oxidació de la part catecol a l'anell B

de Q o R es pot estabilitzar de dues maneres:8,19. La primera manera és la conjugació de l'estructura del nucli sobre els anells B i C i la formació del segon enllaç H amb un grup OH vicinal o substituents a l'anell C, especialment en R. la presència de grups hidroxil en el substituent del sucre a la posició 3 de l'anell C pot millorar encara més aquest efecte d'estabilització a causa de més possibilitats de formació d'enllaços H (directament o a través de la molècula d'aigua), en canvi, el radical fenoxil intermedi en N plus o N-s'estabilitza ni per enllaços dobles conjugats que impliquen també l'anell. Enllaç C ni H amb substituents veïns. A més, a N més, la part de sucre s'uneix a l'anell A i, per tant, està massa lluny per formar un enllaç H amb el radical de l'anell B. Es pot esperar que aquestes característiques estructurals influeixin en l'activitat redox dels flavonoides estudiats.

Activitat antioxidant mitjançant proves químiques.

La determinació de les propietats reductores dels polifenols estudiats i les seves mescles es va realitzar mitjançant dos assaigs químics a 37 graus C per adaptar-se a les condicions cel·lulars dels processos redox. El primer mètode va ser la prova DPPH espectrofotomètrica per lots d'ús habitual; els resultats dels flavonoides individuals i les seves mescles es presenten a la figura 2A. S'expressen com a valors d'estequiometria n on el nombre 10 fa referència a la durada de la reacció: 10 min. En introduir el paràmetre de temps en les mesures, es va incorporar un aspecte cinètic a l'avaluació de l'activitat antioxidant, tal com s'ha descrit anteriorment13. En aquestes determinacions, ambdues aglicones mostraven propietats reductores més fortes que els glicòsids corresponents, com també s'havia demostrat anteriorment amb aquesta prova2021, mentre que els flavonols eren més. actiu que les flavanones. O va ser el compost més eficient en l'eliminació de DPPHradical i va ser seguit per R. Malgrat la reactivitat insignificant cap a DPPH, ambdues flavanones, inclòs N, que per si mateix no van mostrar propietats redox durant el període de 10 minuts de la reacció, van augmentar significativament l'activitat antioxidant total del mescles, tant en el cas d'aglicones ON- com de glicòsids RN plus .

El segon mètode va implicar una valoració potenciomètrica (PT) que permet mesurar el potencial de reducció estàndard (E), i així va avaluar la capacitat termodinàmica dels compostos purs per guanyar electrons. Els valors determinats de Confirmen que Q i R són compostos reductors forts (Fig. 2B). No obstant això, a PT, R va acceptar electrons donants amb més voluntat que Q. La determinació d'E per a N- i N plus no va ser possible a causa de la transferència d'electrons molt lenta durant el procés d'oxidació (més lenta per a N més). PT mesura la diferència de potencial entre l'elèctrode de referència i l'elèctrode de mesura després d'afegir cada part del valorant. El potencial estacionari significa que el quocient de reacció (Q) entre el valorant i l'analit és estable (Q= constant). Si la velocitat de transferència de càrrega durant una reacció és baixa (baixes corrents en voltametria), es necessita molt de temps per estabilitzar la Q en PT. En conseqüència, per a reaccions molt lentes, la corba de valoració potenciomètrica és difícil d'obtenir i, per tant, el valor trobat de E" és menys fiable.

Activitat antioxidant per voltametria de pols diferencial,

Les proves químiques utilitzades van suggerir que l'elucidació de l'acció antioxidant dels polifenols ha de tenir en compte aspectes cinètics, on l'estabilitat dels radicals intermedis podria tenir un paper. Tal com s'il·lustra a la figura 1, els radicals semiquinona formats en la primera etapa de l'oxidació de flavanols estan molt millor estabilitzats que els radicals fenoxil que sorgeixen després de l'oxidació de flavanols. Aquesta relació s'il·lustra a la figura 1 i pot afectar la velocitat dels processos redox. Per tant, les propietats de reducció-oxidació dels antioxidants purs estudiats i les seves mescles es van analitzar més amb l'ajut de voltametria de pols diferencial (DPV). Com que aquesta tècnica permet controlar tant els aspectes termodinàmics com cinètics de les reaccions d'oxidació, finalment tots dos es combinen en un paràmetre anomenat poder antioxidant (AOP)15.

Les observacions realitzades amb mesures de DPV (Fig.2B-F) van contradir les obtingudes amb la prova DPPH (Fig.2A). Sorprenentment, DPV va revelar que Q descrit a la literatura com un excel·lent reductor, quan només es consideren aspectes termodinàmics (potencial de pic anòdic, E.), va resultar l'antioxidant més feble (Fig. 2B, C). Termodinàmicament, R era un antioxidant lleugerament més fort. Curiosament, N-i N plus es consideren a la literatura com a antioxidants febles, mostrant termodinàmicament els valors més alts d'E, el que significa que eren agents reductors molt forts. Per a ambdues classes de flavonoides, la part de glicòsid va augmentar l'activitat antioxidant de les aglicones. Tanmateix, els paràmetres relacionats amb la cinètica (Fig.2E, F), és a dir, el corrent anòdic (I,.) i la densitat de càrrega (Q), van revelar que l'oxidació de N plus és el procés més lent en comparació amb l'oxidació de Q i R. De la mateixa manera , el corrent anòdic (I) era menor per a N-que per a Q i R, però la transferència de càrrega d'aquest compost va assolir el valor més alt.

En el cas de les mescles, es van detectar dos pics anòdics (1r i 2n) en corbes voltamètriques com es podria esperar per a la mescla de dos components. Els valors determinats dels potencials pics anòdics (E.) van indicar que el 1r pic observat reflecteix l'oxidació dels flavonols, mentre que 2" d'acumulen l'oxidació de les flavanones (materials suplementaris-Fig. S1). En la majoria dels casos, la presència de l'altre component en una mescla va influir en la termodinàmica i/o cinètica del procés redox en comparació amb l'oxidació dels compostos purs.Per exemple, per a QN-, el valor d'E., per al primer pic d'oxidació era igual al potencial de pic anòdic de Q. No obstant això, el pic anòdic de 2" corresponent a l'oxidació de l'N i el potencial d'aquesta transició era superior al potencial anòdic de l'N- pur (Fig.2C). Es va observar la situació contrària per a la cinètica d'aquesta reacció. El pic anòdic I i Q de 1s de QN estaven a prop dels paràmetres cinètics de l'oxidació dels components purs (Fig. 2E, F), mentre que la càrrega intercanviada durant el pas 2n d'oxidació ON era molt inferior a la de l'oxidació N. (Fig.2F). Aquests efectes termodinàmics i cinètics combinats van donar lloc a la millora de l'AOP (Fig. 2D) d'aquesta barreja, que està d'acord amb els resultats de la prova DPPH.

Valoració de la citotoxicitat.

L'impacte de les aglicones flavonoides estudiades (Q, N-), glicòsids (R, N plus ) i les seves mescles (QN-, RN plus ) en el creixement de les cèl·lules intestinals es va avaluar mitjançant la prova MTT. La línia cel·lular d'adenocarcinoma de còlon humà HT29 es va escollir com a model d'epiteli del tracte digestiu, és a dir, el teixit en contacte directe amb ingredients alimentaris ingerits com els polifenols. Les cèl·lules es van tractar amb flavonoides individuals i les seves mescles a concentracions fisiològiques potencialment presents a la sang (0.01-1 uM)22-2 o concentracions assolides en el tracte digestiu (10-100 uM) després de la ingestió d'aliments25-27. Les corbes dosi-resposta per als tractaments de 6,24 i 72 h es presenten a la Fig.3.

Els compostos individuals no van influir significativament en el creixement cel·lular a cap de les concentracions investigades, ni per a tractaments curts ni prolongats. L'excepció va ser la concentració més alta de N-que després de 72 h va inhibir el creixement cel·lular fins al 75 per cent en comparació amb el control. En canvi, les mescles investigades (QN-, RN plus) van estimular significativament el creixement cel·lular de manera dependent de la concentració durant tots els temps d'exposició provats. Aquest efecte es va observar a concentracions baixes (0.01-1 uM) que s'arribava al torrent sanguini i era encara més potent a concentracions més altes (10-100 uM) a les quals les cèl·lules epitelials del tracte digestiu. pot estar exposat. Només en el cas de la concentració més alta de QN-, després de 72 h de tractament, l'estimulació va cessar, probablement a causa dels efectes inhibidors observats en aquestes condicions per a N-. Activitat antioxidant cel·lular. L'eficiència dels flavonoides purificats i les seves mescles per donar suport a la barrera antioxidant endògena de les cèl·lules HT29 es va verificar amb l'ajuda de l'assaig CAA. Aquest mètode es basa en la capacitat d'una mostra que conté compostos actius redox per inhibir o promoure l'oxidació de la sonda absorbida. per les cèl·lules fins a la seva forma fluorescent. L'atenuació de l'oxidació de la sonda, observada com l'extinció de la fluorescència, és una mesura de la capacitat reductora dels antioxidants a les cèl·lules (valors positius de CAA), mentre que l'augment de l'oxidació de la sonda denota la seva activitat pro-oxidativa (valors negatius de CAA)28. . Les determinacions es van dur a terme per a glicones i glicòsids a concentracions que reflecteixen exposicions intestinals tant fisiològiques, endògenes, com derivades dels aliments, exògenes. La incubació amb flavonoides estudiats es va dur a terme durant un període estàndard recomanat d'1 h18 per als aglicons i glicòsids. Els tractaments prolongats (3 i 6 h) destinats a controlar la cinètica de la resposta redox en el model cel·lular aplicat es van utilitzar només en el cas de les aglicones, pel seu impacte més destacat en l'activitat antioxidant cel·lular.

Les flavanones i flavonols investigats difereixen en el seu impacte en l'estat redox de les cèl·lules HT29. En el cas de les aglicones individuals, les respostes depenents de la concentració definides es van observar després d'una exposició d'1 h. Tanmateix, l'activitat antioxidant del flavonol-Q va augmentar amb la concentració aplicada, mentre que en el cas de la flavanona-N-es va observar la millora gradual de l'efecte pro-oxidatiu (Fig. 4A). La dependència de la dosi dels glucòsids individuals era menys evident; només R en la seva concentració més alta va augmentar de manera convincent l'activitat antioxidant cel·lular (Fig. 4A). Curiosament, ambdues mescles van mostrar una activitat antioxidant millorada, aparentment no influenciada per l'efecte pro-oxidatiu observat per a compostos individuals.

La figura 4B presenta la cinètica dels canvis dels valors de CAA determinats després del tractament l,3 i 6h de cèl·lules HT29 amb aglicones. Per a la concentració més baixa (1 μM), coincidint amb les exposicions fisiològiques, no es va observar la dependència del temps ni per als aglicons individuals ni per a la seva barreja. Tanmateix, les influències d'una concentració més alta sobre els valors de CAA depenien clarament del temps. Les exposicions prolongades van disminuir tant l'efecte pro-oxidatiu de N- com l'activitat antioxidant de Q i QN-.

Les aglicones investigades van mostrar una activitat nutrigenòmica diferent, modificada addicionalment per la concentració aplicada a les cèl·lules.

Flavanone N-a l μM va disminuir significativament l'expressió de CCL5, CYGB, GTF2I, MT3 (p<0.05) as="" well="" as="" showing="" some="" tendency="" to="" down-regulate="" alox12="" and="" ucp2="" transcription=""><><0.09). the="" increased="" expression="" caused="" by="" n-was="" observed="" for="" the="" ncf2="" gene="" only=""><0.05). these="" genes,="" though="" in="" one="" or="" another="" way,="" related="" to="" cellular="" redox="" status,="" do="" not="" fall="" into="" any="" specific="" common="" pathway="" nor="" are="" involved="" in="" any="" coordinated="" process.="" the="" protein="" encoded="" by="" ccl5="" belongs="" to="" a="" group="" of="" inflammation-relevant="" genes,="" while="" the="" cytoglobin="" gene(cygb)functions="" as="" a="" tumor="" suppressor="" gene2930.="" gtf2i="" protein="" acts="" as="" a="" general="" transcription="" factor="" and="" is="" involved="" in="" the="" coordination="" of="" cell="" growth="" and="" division31.="" so,="" the="" other="" gene="" down-regulated="" by="" the="" n-at="" l="" um="" gene—mt3—may="" cooperate="" with="" it,="" because="" although="" it="" plays="" a="" role="" in="" zinc="" and="" copper="" homeostasis,="" it="" is="" also="" known="" as="" growth="" inhibition="" factor2.="" the="" enzyme="" encoded="" by="" alox12="" acts="" on="" different="" polyunsaturated="" fatty="" acid="" substrates="" to="" generate="" bioactive="" lipid="" mediators3.="" the="" protein="" coded="" by="" ucp2="" has="" been="" described="" as="" a="" mitochondrial="" scavenger="" of="" ros.="" the="" only="" up-regulated="" gene="" by="" n-at="" 1="" um="" was="" ncf2="" which="" encodes="" a="" cytosolic="" protein="" required="" for="" the="" activation="" of="" the="" nadph="" oxidase="" system="" responsible="" for="" superoxide="">

Aquesta flavanona aplicada a cèl·lules HT29 a 10 uM va influir en l'expressió de 5 gens, que també estaven regulats a la baixa per la seva dosi més baixa, a saber: CCL5, CYGB.MT3(p<0.05)as well="" as="" gtf2i="" and=""><><0.09).additionally,in contrast="" to="" lower="" dose,="" n-at="" 10="" um="" showed="" tendency="" to="" decrease="" expression="" of=""><><0.09). the="" latter="" gene="" codes="" for="" a="" protein="" with="" superoxide="" dismutase="" activity,i.e.,="" the="" antioxidant="" enzyme="" catalyzing="">

dismutació dels radicals superòxid a peròxid d'hidrogen i oxigen6. El lleuger augment de l'expressió causat per N-a 10uM només es va observar per al gen VIMP (0,05<><0.09)that is="" involved="" in="" the="" degradation="" process="" of="" misfolded="" endoplasmic="" reticulum(er)luminal="">

Aquest article està extret de www.nature.com/scientificreports