Les interaccions entre els antioxidants polifenòlics quercetina i naringenina dicten el comportament químic i biològic de les seves mescles relacionat amb el redox distintiu Part 3

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

Activitat antioxidant mitjançant test DPPH.

La determinació de l'activitat antioxidant dels antioxidants investigats i les seves mescles es va dur a terme perespectrofotomètricassaig que utilitza el radical DPPH tal com es va descriure anteriorment l3,55. En primer lloc, la solució de reserva del radical DPPH es va diluir amb metanol fins que l'absorbància va ascendir a 0.9±{0.05 a 515 nm. En segon lloc, els antioxidants i les seves mescles es van diluir adequadament amb etanol al 70 per cent per aconseguir concentracions que es troben dins del rang lineal de l'assaig355. A continuació, es va barrejar la solució de DPPH (1 mL) amb les mostres diluïdes (30 μL) i es va mesurar l'absorbància a 515 nm després de 10 min a 37 graus C. Totes les reaccions es van dur a terme en 48-plaques de pous. Les mesures d'absorbància es van realitzar amb l'ajut d'un espectrofotòmetre TECAN Infinite M200 (Tecan Group Ltd., Suïssa). L'activitat antioxidant de la mostra es va recalcular al coeficient d'estequiometria ng tal com es va descriure anteriorment, amb modificacions5. Breument, el nombre de radicals eliminats per les mostres provades es va calcular a partir de la llei Beer-Lambert i el coeficient d'extinció molar de DPPH després de les mesures realitzades després de 10 minuts de reacció entre la solució d'antioxidants i el radical55. El valor de n es calcula com una tangent de la relació lineal entre el nombre de mols de DPPH eliminats per 1 mL deantioxidant(s)solucions dins d'un rang de concentració, on la solució "estoc" té la concentració "100 per cent" i les altres concentracions són una fracció del 100 per cent tal com es defineix pels factors de dilució.

Feu clic aquí per saber-ne més

Activitat antioxidant per valoració potenciomètrica i voltametria de pols diferencial.

Els potencials de reducció estàndard (E) per a Q i R es van mesurar per valoració potenciomètrica (PT) tal com es descriu en altres llocs5. En resum, els compostos estudiats i el valorant (K,[Fe(CN)]) es van dissoldre en PBS. La concentració de compostos purificats va ser de 0,3 mg/mL, les mescles contenien 0,3 mg/mL de cada compost. Les mesures es van dur a terme mitjançant un equip de microoxidació-reducció JENCO 6230 N ORP-146C (EUA) amb l'ajut d'un elèctrode de referència AglAgCl (RE) i un elèctrode de mesura de platí. Els PT es van realitzar a 37 ± 0,01 graus que es va mantenir principalment per Ultra Thermostat (PolvScience, EUA). Es va afegir el volum igual de titulant a l'analit i es va llegir el potencial estable. Com a resultat, es van analitzar les corbes de valoració, E=f(V..), amb l'ajuda del programari SigmaPlot Versió 13.0 (Systat Software Inc., Regne Unit) ajustant els paràmetres sigmoïdals5-matemàtics. model a dades experimentals35. El potencial en el punt d'equivalència (EP vs. RE) es va llegir directament d'aquest model basat en el paràmetre a. És igual al volum del valorant afegit al punt d'inflexió. Finalment, es van calcular els valors de EP versus SHE (potencial de reducció estàndard, EO). El terme de correcció del potencial del RE(c) es va establir mitjançant la valoració de parelles redox, FeCl.6H, O i Na,S, O3.5H,O, caracteritzats per potencials de reducció estàndard coneguts.

Al seu torn, el poder antioxidant (AOP) dels compostos estudiats i les seves mescles es va mesurar mitjançant voltametria de pols diferencial (DPV), tal com es mostra abans amb modificacions. Breument, les mesures es van dur a terme mitjançant el potentiòstat Gamry Reference 60{{10}} (Gamry Instruments, EUA) que conté un sistema de tres elèctrodes. L'elèctrode de carboni vidre (GC, 1,6 mm de diàmetre), filferro de platí i elèctrode AgAgCl (Hydromet SC, Polònia) es van aplicar com a elèctrode de treball (WE), auxiliar (AE) i elèctrode de referència (RE), respectivament13. Abans dels experiments, la superfície del WE es va polir amb suspensió d'alúmina （0.{0partícules de 5 μm, Buehler, EUA）en coixinets de micro tela (MF{-1040, BASi, EUA) i després es neteja amb aigua destil·lada i metanol. Els compostos estudiats es van diluir en DMSO i tampó de fosfat sòdic (pH=7.4±0.1), de manera que la concentració final de tampó de fosfat va ser de {{30}}.1 M a la mostra. El tampó va servir com a electròlit de suport. La concentració de compostos purificats va ser de 3 mM. Les mescles contenien 3 mM de cada compost. Per tal d'eliminar l'oxigen electroquímicament reactiu, les solucions estudiades es van desoxidar per percolació d'argó abans de les mesures. Voltamogrames DPV per a N-.N més i mescles: ON- i RN més es van registrar en el rang-0,2 a més 1,3 V, mentre que per a Q i R en el rang-0},2 a més 0,6 V vs.RE.Es va establir la velocitat d'exploració potencial de 0,1 V, l'alçada del pols de 0,05 V i un temps de pols de 0,1 s a 25 ± 0,01 graus.

Els voltamogrames DPV es van analitzar mitjançant el programari SigmaPlot Version 13.0 (Systat Software Inc., Regne Unit). Els valors AOP es van calcular en dos passos. Els càlculs van considerar no només el potencial màxim anòdic i el corrent (E,; I,), sinó també el potencial establert i el corrent mesurat en cada punt de la corba voltamètrica. Va permetre obtenir valors més precisos que els reportats en el nostre treball anterior3. En primer lloc, es va calcular el paràmetre d'energia antioxidant (AOE) segons l'eq. 1:

on AwE és l'àrea superficial del WE (igual a {{0}},162±{0,004 cm'en el nostre estudi), E és un conjunt de potencials enfront de RE [V], és un factor de correcció tenint en compte la presència de la unió líquida entre el WE i el RE (aquí 0,103 V), I és el corrent mesurat enfront del corrent de fons [A], és el temps de mostreig potencial [dt=0 .5 s].

En segon lloc, l'AOP expressat en unitats W cm² es va calcular a partir de l'eq.2∶

on tt;—és la diferència entre el moment de l'inici del pic d'oxidació (t) i el seu final (t).

Per tal de determinar Awp, es va realitzar voltametria cíclica per a una solució d'1.10-3MK,[Fe(CN).] en 0.1 M KCl. Aquest valor es va calcular a partir de l'equació de Randles-Sevcik82 a partir del pendent del corrent màxim anòdic en funció de l'arrel quadrada de la velocitat d'exploració, I, =f(pi/2). Es va mesurar de la mateixa manera que en la valoració potenciomètrica. A més, en el present treball, el paràmetre termodinàmic del procés d'oxidació va ser el potencial de pic anòdic corregit per la unió líquida entre WE i RE (E.,=E.. més e), mentre que els paràmetres cinètics abraçaven la càrrega transferida ( Q) i corrent anòdic (I,).

Cistanche pot millorar la immunitat

Cultiu cel·lular. En l'estudi presentat, la línia cel·lular HT29 (còlon humàadenocarcinoma) de l'ATCC es va utilitzar com a model de l'intestí humà, les cèl·lules es van mantenir en el medi de McCoy complementat ambantibiòtics(100 U/mL d'estreptomicines i 100 g/L de penicil·lina) i sèrum fetal boví (100 mL/L)13. La línia cel·lular HT29 es va mantenir a un 37% amb un 5% de CO, l'atmosfera en una incubadora cel·lular (Heal Force)3. La línia cel·lular es va utilitzar entre els passatges 6 i l1. Les cèl·lules cultivades es van provar per a la contaminació de micoplasmes mitjançant el kit universal de detecció de micoplasmes d'ATCC (EUA).

Valoració de la citotoxicitat. Per determinar l'impacte del purificatantioxidants(Q, N més, R, N-) i les seves mescles (QN-, RN més) sobre el creixement de cèl·lules HT29, es va aplicar MTTtest tal com es va descriure anteriorment3,5. Breument, les cèl·lules en creixement exponencial es van sembrar en plaques de cultiu de teixits de 96-pou (5 × 10 cèl·lules per pou en 0,18 ml de medi) i es van deixar reposar durant 24 h. a 37 graus sota un 5 per cent de CO. Després, les cèl·lules es van tractar durant 6,24 o 72 h amb 0.02 ml de diferents concentracions dels antioxidants purs o les seves mescles3,5. Els antioxidants i les seves mescles es van dissoldre en etanol (naringenina, naringina i mescles: 30 per cent (v/v), quercetina{-40 per cent (v/v), rutina: 20 per cent (v/v). )). Les concentracions finals de compostos purificats van oscil·lar entre 10 nM i 100 uM. Les mescles contenien concentracions equivalents de cada compost (10 nM-100 μM). La concentració final d'etanol en medis de cultiu va ser del 2% (v/v) en el cas de rutina, 3% (v/v)naringenina, naringina i mescla, així com un 4% (v/v)quercetina. Després d'exposicions de 6 i 24 hores, el medi es va aspirar dels pous i es va substituir per 0,2 ml de medi fresc. Les cèl·lules es van incubar a 37 graus fins a les 72 h del temps total d'incubació13,55. Després de 72 h d'incubació, a tots els pous es van afegir 0, 05 mL de solució MTT (4 g/L) i les cèl·lules es van mantenir durant 4 h més a 37 graus C13,5. A continuació, es va aspirar el medi dels pous i es van dissoldre els cristalls de formazan en 0, 05 ml de DMSO. L'absorció de les solucions obtingudes es va mesurar a 540 nm amb l'ajuda del lector de plaques TECAN Infinite M200 (Tecan Group Ltd, Suïssa)15. Els tractaments es van realitzar com a quatre rèpliques tècniques. Es van realitzar tres repeticions independents de cada tractament. L'impacte de les mostres investigades en el creixement de les cèl·lules HT29 es va expressar com un percentatge d'inhibició del creixement de les cèl·lules exposades a antioxidants individuals i les seves mescles en comparació amb les cèl·lules de control tractades només amb el dissolvent, el creixement de les quals es va considerar un 100% 13,55.

Assaig CAA (activitat antioxidant cel·lular). L'assaig CAA (The OxiSelect Cell Biolabs, Inc. USA) es va utilitzar per avaluar l'activitat antioxidant cel·lular de compostos sols (O, N plus, R, N-) i mescles (ON-, RN plus) a les cèl·lules HT29 tal com es va descriure anteriorment35. Les cèl·lules de creixement exponencial es van sembrar en plaques negres de cultiu de teixits 96-pous amb fons transparents per a mesures de fluorescència (3 × 104 cèl·lules per pou en 0,2 ml de medi) i es van Es deixa reposar durant 24 h a 37 graus sota un 5 per cent de CO, i3,55. Tots els antioxidants es van dissoldre en etanol al 10 per cent. A continuació, es van tractar les cèl·lules amb una solució diluïda de 50{{50}} vegades de diacetat de 2',7'-diclorofluoresceïna (0.05 ml) proporcionada amb el kit, i el mateix volum de diferents concentracions de mostres d'antioxidants durant 1, 3 o 6 h. Les concentracions finals de compostos purificats oscil·laven entre 1 i 100 uM. Les mescles contenien concentracions equivalents de cada compost (1-100uM). Les cèl·lules de control es van tractar només amb etanol a l'10 per cent (v/v). La concentració final d'etanol en medis de cultiu va ser del 5 per cent (v/v). Tots els tractaments es van dur a terme en tres rèpliques tècniques i es van realitzar tres experiments independents. Els passos posteriors es van dur a terme segons les recomanacions del fabricant (https://www.cellbiolabs.com). Els càlculs es van realitzar com s'ha descrit anteriorment, Efectes genotòxics. Per determinar els efectes genotòxics que presenten els antioxidants individuals (O, N plus, RN-) i les seves mescles (ON-, RN plus) a les cèl·lules HT29, es va aplicar un procediment d'assaig de cometes tal com s'ha descrit anteriorment. Les cèl·lules HT29 de creixement exponencial es van sembrar en 24-plaques de cultiu de teixits de pou (10 cèl·lules per pou en 1,8 ml de medi) i es van deixar reposar durant 24 h a 37 graus amb un 5% de CO, 55, A continuació, les cèl·lules es van tractar durant 24 h amb 0,2 ml de diferents concentracions d'antioxidants sols o en mescles. Les concentracions finals de compostos purificats van oscil·lar entre 1 i 100 uM. Les mescles contenien concentracions equivalents de cada compost (1-100 uM). La concentració final d'etanol al medi de cultiu va ser del 3 per cent (v/v). Les cèl·lules utilitzades com a controls negatius només es van tractar amb dissolvent. Després del temps de tractament, es va aspirar el medi dels pous i es van rentar les cèl·lules amb 0, 5 ml de PBS. A continuació, es van separar les cèl·lules utilitzant 0,2 ml de solució de tripsina (0,5 g/L)55 L'activitat de la tripsina es va aturar afegint 1,8 ml de medi de creixement complet a cada pou. Les cèl·lules es van tornar a suspendre, es van comptar i es van repartir alíquotes en tubs d'1,5 ml (30 × 103³ cèl·lules per tub). La suspensió cel·lular es va centrifugar (100 × g, 5 min, 4 graus). Els pellets de cèl·lules es van rentar amb 1 ml de PBS i es van centrifugar de nou (100 × g, 5 min, 4 graus ） 5. A continuació, es va descartar el PBS i es van tornar a suspendre les cèl·lules en 150 μL d'agarosa LMP al 0, 5 per cent en aigua pre- Es va escalfar a 42 graus C i es van col·locar 40 μL d'aquesta barreja com a dos punts en un portaobjectes de microscopi recobert prèviament amb un 1% d'agarosa de punt de fusió normal (agarosa NMP). Les diapositives es van cobrir amb cobreobjectes. col·locant els portaobjectes del microscopi en una safata gelada durant almenys 5 min 5. Es van preparar tres diapositives amb dues repeticions a cadascuna per a cada concentració de les substàncies provades.Després de la lisi durant la nit en un tampó alcalí d'alta sal (NaCl 2,5 M, EDTA 0,1 M). ,0,01 M Tris, 1% Triton X100,pH10), les diapositives es van acomodar en una plataforma d'electroforesi Bio-Rad Sub-Cell GT (Regne Unit), coberta amb tampó d'electroforesi en fred (0,3 M NaOH, 1 mM EDTA, pH 13) i La cromatina es va deixar relaxar durant 25 minuts abans de l'electroforesi.L'electroforesi es va dur a terme a 26 minuts. V i 300 mA (0,75 V/cm) durant 30 min a la foscor a 4-8 graus . Després d'aquest pas, les diapositives es van rentar primer amb PBS i després amb aigua. Posteriorment, l'ADN es va tacar amb SybrGreen en tampó TE (0, 1 M Trizma-Base, 1 mM EDTA, pH 7, 5) durant 20 min ~. Després de la tinció, les diapositives es van rentar amb aigua destil·lada durant 5 minuts. Els "cometes" d'ADN es van analitzar amb un microscopi de fluorescència (Zeiss ImagerZ2, EUA) juntament amb un sistema d'escaneig de diapositives informatitzat (Metafer4, Alemanya). L'anàlisi de cometes va implicar comptar 200 nuclis consecutius per mostra5. La genotoxicitat de les mostres analitzades es va expressar com el percentatge d'ADN a la cua del cometa. Es van realitzar tres rèpliques independents de cada tractament.

Cistanche pot millorar la immunitat

Metilació global de l'ADN.

For the determination of global methylation of DNA, a modified comet assay procedure was developed. Methylation sensitive comet assay was performed according to Wentzel's procedure with significant modifications. The cells were seeded in 6-well tissue culture plates(4×105 cells per well in 3.6 mL of medium) and were allowed to settle for 24 h at 37°C under 5%CO,Then, the cells were treated with 0.4 mL, of different concentrations of the tested antioxidants or their mixtures for 24 h at 37C. The final concentrations of individual compounds and solvents were the same as used for genotoxic effect assessment. After incubation time, the medium was aspirated from the wells and the cells were washed with 2 mL of PBS. The cells were detached using 0.4 mL of trypsin solution (0.5 g/L). Then,3.6 mL of medium was added to each well. The cells were re-suspended, counted, and aliquoted into 1.5 mL tubes(30×10 cells per tube). The cell suspension was centrifuged (100×g,5 min, 4°C). The cell pellets were washed with 1 mL of PBS and centrifuged again(100×g 5 min,4℃C）.PBS was discarded and the cell pellet was re-suspended in 100μL of 1%LMP agarose in water pre-warmed to 45 °C. Then,40 μL of this mixture was placed as two spots on a microscope slide pre-coated with 1%normal melting point agarose(NMP agarose)5. The slides were then covered with coverslips and left to set on an ice-cold tray for at least 5 min to solidify agarose5. Each treatment embraced a set of 3 microscope slides. After overnight lysis in a high salt alkaline buffer(2.5 M NaCl, 0.1 M EDTA, 0.01 M Tris,1% Triton X100, pH 10), the slides were washed twice with water>5. La cromatina ben empaquetada es va desenrotllar tractant els nuclis amb una solució de proteïnasa K 1,5 mM (0,2 mL per diapositiva)3. Les diapositives es van cobrir amb parafilm, es van col·locar en un recipient de plàstic folrat amb un mocador humit, es van deixar durant 10 min a 37 graus i després es van rentar amb aigua3. D'aquesta manera, es van preparar nucleoides per a la digestió amb endonucleases de restricció (Hall i MspI). Tots dos enzims reconeixen la mateixa seqüència de restricció (5'-CCGG-3') però mostren una sensibilitat diferent cap a la citosina metilada. Es suposa que HpalI només digereix seqüències no metilades. MspI pot escindir seqüències no metilades així com seqüències totalment metilades. Així, els nivells relatius de metilació de l'ADN de la seqüència CpG es reflecteixen com la diferència entre la quantitat global d'ADN dins de la cua del cometa observada amb la digestió amb MspI i els nucleoides digerits amb HpalI. Per crear les condicions adequades per a la digestió enzimàtica. {{20}} Es van aplicar 0,2 ml de tampó Tango diluït amb aigua de grau molecular en una proporció 1:9 (v/v) a cada portaobjectes del conjunt. Les diapositives es van cobrir amb parafilm, es van col·locar en un recipient de plàstic folrat amb un teixit humit i es van deixar durant 1 0 min a 37 graus Ce. A continuació, es va eliminar l'excés de tampó. Cadascuna de les tres diapositives del conjunt va ser tractada de manera diferent. A la primera diapositiva (control), només es va aplicar 0,15 ml de tampó Tango diluït. Els nuclis incrustats d'agarosa a la segona diapositiva es van tractar amb 0,15 ml d'enzim Hall (0,37 μunitats), mentre que a la tercera diapositiva es va afegir el mateix volum de MspI (0,26 μunitats). Les solucions enzimàtiques es van preparar utilitzant tampó Tango diluït. Les diapositives es van cobrir amb un parafilm i es van col·locar en un recipient de plàstic humit. La digestió enzimàtica es va dur a terme durant 45 min a 37 graus. Després de la digestió, les diapositives es van rentar dues vegades amb aigua. Es van realitzar altres passos de l'assaig del cometa, com ara l'electroforesi i la tinció d'ADN, tal com es descriu a la secció "Metilació global de l'ADN". Els "cometes" d'ADN es van analitzar amb un microscopi de fluorescència (Zeiss ImagerZ2, EUA) juntament amb un sistema d'escaneig de diapositives informatitzat (Metafer4, Alemanya). L'anàlisi de cometes es va realitzar amb l'ajuda del programari de puntuació Comet (EUA) i va implicar el recompte de 100 nuclis per mostra. El percentatge mitjà d'ADN a la cua del cometa era una mesura de la fragmentació de l'ADN. Per calcular l'ADN globalmetilació(per cent de metilació CpG), es va utilitzar l'equació següent: percentatge de metilació CpG=100: Hpal/MspI × 100, on Hpal/MspI és la relació entre el percentatge d'ADN a la cua del cometa del nucleoide digerit amb HpalII i l'ADN percentatge a la cua del cometa del nucleoide digerit amb Mspl85. Els artefactes de dany a l'ADN es van comptabilitzar restant el percentatge d'ADN a la cua de la mostra de control dels valors obtinguts per a les mostres digerides amb enzims de restricció. Es van realitzar tres repeticions independents de cada experiment.

Anàlisi de microarrays.

L'anàlisi genòmica s'ha realitzat tal com es mostra abans de 355, les cèl·lules HT29 es van sembrar en 24-plaques de cultiu de teixits de pou (105 cèl·lules per pou en 1,8 ml de medi) i es van deixar reposar durant 24 h a 37ºC. grau inferior al 5 per cent de CO, després, les cèl·lules es van tractar durant 24 h amb 0,2 ml de diferents concentracions d'antioxidants sols (Q, N-) o a la barreja (QN-). Les concentracions finals dels compostos investigats van oscil·lar entre 1 i 10 uM. La mescla contenia concentracions equivalents de cada compost. Les cèl·lules utilitzades com a controls negatius només es van tractar amb el dissolvent. La concentració final d'etanol en medis de cultiu va ser del 3 per cent (v/a). Aïllament d'ARN. La transcripció inversa i la PCR en temps real de la matriu que consta de 84 gens implicats en la resposta antioxidant, així com l'anàlisi de dades es van realitzar tal com es va descriure anteriorment. Es van realitzar tres repeticions independents de cada tractament de cèl·lules.

Anàlisi estadística.

Tots els valors s'expressen com a mitjana ± SD de tres experiments independents tret que s'indiqui el contrari. La significació estadística de les determinacions de l'activitat antioxidant en un sistema lliure de cèl·lules mitjançant assaigs DPV i DPPH, així com en models cel·lulars obtinguts per prova CAA es va examinar mitjançant la prova de Tukey no aparellada (p Menor o igual a 0.{{). 6}}5). Els resultats de la genotoxicitat i la metilació global de l'ADN analitzats mitjançant assajos de cometes es van examinar mitjançant ANOVA unidireccional amb la prova post-hoc de Dunnett. Aquestes anàlisis estadístiques es van realitzar mitjançant el paquet de programari Prism 4.0 (GraphPad Software, Inc., EUA). La importància estadística dels canvis en l'expressió gènica entre mostres i controls també es va avaluar mitjançant la prova t de Student no aparellada per a cada gen d'interès mitjançant GenGlobe Data Analysis Center (Qiagen, EUA). El nivell de significació estadística es va establir a p Menor o igual a 0,05.

Aquest article està extret dewww.nature.com/scientificreports