La protecció intestinal per proantocianidines implica accions antioxidants i antiinflamatòries en associació amb una millora de la sensibilitat a la insulina, l'homeòstasi dels lípids i la glucosa Part 2

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

Expressió de tein mitjançant Western blot. La figura 6 mostra que l'addició de Fe/Asc a les cèl·lules Caco-2/15 va augmentar el nivell dels dos enzims importants, però els PAC van contrarestar la seva regulació a l'alça induïda per Fe/Asc.

Atès que la senyalització d'insulina modula els processos de lipogènesi, oxidació de FA i gluconeogènesi, va ser important investigar la influència de Fe/Asc i PAC en MAPKs i PI3K/Akt, les dues vies principals de senyalització de la insulina. Amb aquesta finalitat, les cèl·lules Caco-2/15 es van preincubar amb insulina abans que les altres cèl·lules Caco{-2/15

Figura 6. Efectes dels PAC sobre la glucogènesi a les cèl·lules Caco-2/15. Les proantocianidines (PAC, 250 ug/mL) es van afegir al compartiment de les cèl·lules apicals durant 24 hores abans del tractament amb Fe/Asc (200 μM/2 mM) durant 6 hores a 37 graus. L'expressió de proteïnes de (A) G6Pase i (B)PEPCK es va avaluar mitjançant Western blot.cistanche en polsEls resultats representen la mitjana ± SEM de 3 experiments independents, cadascun per triplicat. Es mostra un Western blot representatiu, que il·lustra un experiment per triplicat en el mateix gel i a la mateixa exposició.*P<0.05 vs="" untreated=""><0.05 vs="" fe/asc="" treated="" cells.="">arrel de cistancheG6Pasa glucosa-6-fosfatasa, PEPCK fosfoenolpiruvat carboxicinasa.

Feu clic aquí per saber-ne més

tractaments per activar la via de senyalització. Mentre Fe/Asc va augmentar l'expressió de la proteïna p38-MAPK i la relació fosfo p{38-MAPK/p{38-MAPK, els PAC van impedir aquestes accions (Fig. 7A-C). D'altra banda, mentre que Fe/Asc va reduir la massa proteica de fosfo Akt (pAkt) i la relació Akt/Akt, els PAC van mostrar la capacitat de mantenir el seu nivell normal. Es va observar una tendència similar per a PI3K (Fig. 7D-I. Per tant, aquestes observacions donen suport al paper favorable dels PAC en la senyalització d'insulina.

Discussió

Els polifenols són coneguts pels seus efectes biològics i medicinals pleiotròpics, fet que explica l'atracció de molts científics i indústries alimentàries per aquests fascinants productes naturals derivats de les plantes. Els PAC destaquen entre la varietat i un elevat nombre de polifenols pels seus impactes farmacològics i terapèutics en els trastorns crònics2021. Malgrat les seves característiques lloables, encara hi ha molt que es desconeix sobre la seva influència en el tracte gastrointestinal, que desplega xarxes digestives, immunològiques, neuronals i metagenòmica esteses2.son de cistanchePer aquest motiu, s'han dedicat esforços en la present investigació per aclarir el paper dels PAC en l'OxS intestinal, la defensa antioxidant, la inflamació, l'oxidació de FA, la lipogènesi i la gluconeogènesi, alhora que s'intenta dilucidar mecanismes subjacents com la senyalització d'insulina. i l'estat dels factors de transcripció.

Per investigar els efectes de la PAC, hem utilitzat la línia cel·lular Caco-2/15, un model intestinal popular apreciat principalment per la comunitat científica2 i reconegut per la Food and Drug Administration per als processos d'absorció i transport4. Les cèl·lules Caco-2/15 no només es diferencien espontàniament en enteròcits humans funcionalment i morfològicament semblants3,25, sinó que també serveixen per a l'exploració eficient de l'absorció i les interaccions intestinals, nutrició, toxicologia, microbiologia alimentària, proves de biodisponibilitat i cribratge de permeabilitat del fàrmac al programa de descobriment2²627. Com en els nostres informes anteriors sobre diversos temes28-3】, la línia cel·lular Caco{-2/15 ha estat fonamental en l'estudi actual per descobrir el potencial dels PAC per regular les vies metabòliques diverses. És important destacar que en aquest estudi, les cèl·lules es van sembrar en filtres porosos, permetent l'accés a ambdós costats de l'epiteli intestinal bipolar: compartiments apical i basolateral corresponents al lumen intestinal o circulació serosa, respectivament. A més, hem preincubat Caco-2 /15 amb Fe/Asc, ja que aquest sistema era molt rellevant al nostre laboratori per induir una forta OxS i una inflamació, que al seu torn es van veure desafiades per un gran espectre d'efectors17,1932-3 Cal destacar, Fe/Asc com a oxigen fort. -El sistema generador de radicals causa dany oxidatiu a les macromolècules biològiques, altera el medi redox intracel·lular i està implicat en nombrosos estats patològics2.35,56. Els nostres resultats mostren una elevació significativa de la peroxidació lipídica (nivells alts de MDA) juntament amb una defensa antioxidant vulnerable (baix GPx i Expressions de proteïnes SOD2).Beneficis de cistanche tubulosaA més, en virtut de la seva capacitat per generar peròxids de lípids, el complex Fe/Asc promou la inflamació, com ho demostra l'augment de l'expressió de TNFa, COX2 i NF-is. Col·lectivament, els resultats actuals validen la generació radical i inflamatòria en resposta a Fe/Asc

La presència de PAC va contrarestar la peroxidació lipídica mediada per Fe/Asc. Com que el fracàs de la defensa antioxidant podria explicar la inducció de l'OCS, vam examinar la seva acció sobre els enzims antioxidants endògens. De fet, els PAC van ser capaços de restaurar el descens de SOD2 i GPx mediat per Fe/Asc. Per delimitar el mecanisme per a l'exacerbació de l'OxS per Fe/Asc i l'alleujament per PAC, vam avaluar la via de senyalització de l'element de resposta antioxidant (ARE) de Keap1-NRF2-, que es considera la via de senyalització antioxidant endògena més potent. regulador37.té de cistancheNRF2 és un sensor OCS cel·lular la funció del qual és mantenir l'homeòstasi redox. En condicions normals. NRF2 està contínuament ubiquitinat i s'adreça a la degradació del proteasòmic pel seu regulador negatiu Keap18. En presència d'efectors endògens i exògens, Keapl està inactivat i regulat a la baixa, interrompent així la interacció Keapl-NRF2 i alliberant NRF2, que es trasllada al nucli cel·lular, s'uneix als promotors que contenen.

Figura 7. Efectes dels PAC sobre la sensibilitat a la insulina a la línia cel·lular Caco-2/15. Les proantocianidines (PAC, 250 ug/mL) es van afegir al compartiment de les cèl·lules apicals durant 24 hores abans del tractament amb Fe/Asc (200 μM/2 mM) durant 6 hores a 37 graus. Dues hores abans del final de la incubació de 6 hores amb la barreja Fe/Asc, es va afegir insulina (100 nM) per avaluar la sensibilitat a la insulina. L'expressió proteica de (A) p38-MAPK, (B) fòsfor p38-MAPK, (D) Akt, (E) fosfo Akt, (G) PI3k i (H) fosfo PI3k va ser avaluat per Western blot. Aleshores es van calcular les proporcions (C) fosfo p38-MAPK/p38-MAPK, (F)fosfo Akt/Akt i (Dphospho PI3k/PI3k. Els resultats representen la mitjana ± SEM de 3 experiments independents). cadascun per duplicat. Es mostra un Western blot representatiu, que il·lustra un experiment per triplicat en el mateix gel i amb la mateixa exposició.*P<0.05 vs+/-insulin="" untreated=""><0.05 vs="" fe/asc+/-insulin-treated="" cells.p38-mapkp38-mitogen-activated="" protein="" kinase,="" pi3k="" phosphoinositide="" 3-kinase,="" akt="" protein="" kinase="">

ARE, i accelera la transcripció dels enzims antioxidants39. Segons les nostres dades, el tractament de cèl·lules Caco-2/15 amb PAC va reprimir Keapl i probablement va permetre que NRF2 es traslladés al nucli permetent la unió a ARE (seqüència central: 5'TGACnnnGC3') a la regió promotora dels gens antioxidants. (SOD2 i GPx), donant lloc a l'estimulació de la seva transcripció i a la regulació coordinada. D'acord amb aquestes dades, el compost fenòlic de resveratrol va prevenir l'OxS en sinoviòcits semblants a fibroblasts d'artritis reumatoide tractats amb H, O mitjançant la promoció de l'expressió de NRF2 i la disminució de l'expressió de Keap12. A més, segons Kanzaki et al, l'activació d'enzims antioxidants i citoprotectors es pot associar amb la relació NRF2/Keapl1.

Com s'esperava de la millora de l'OCS, els PAC van reduir significativament la inflamació, com ho demostra la baixada de TNFa i COX2. Com que NF-KB és un regulador clau de les citocines proinflamatòries, vam examinar la seva resposta als PAC. D'acord amb la tendència dels agents inflamatoris, els PAC van abrogar la inducció de NF-KB mediada per Fe/Asc i van reduir la relació NF-KB/IikB. Així, podem suposar raonablement que els PAC ajuden a protegir-se de la inflamació que posa en perill les funcions de les cèl·lules intestinals mitjançant el control de NF-kB, el regulador principal de la resposta inflamatòria. Val la pena esmentar que els PAC poden protegir de la inflamació estimulant els mecanismes defensius antioxidants cel·lulars, ja que hi ha una estreta relació entre els biomarcadors de desequilibri redox i la inflamació2.

El present estudi pretenia investigar els efectes de Pac sobre l'homeòstasi lipídica intestinal. Els nostres interessants descobriments van demostrar que els PAC regulaven CPTla, d'una banda, i regulaven a la baixa FAS, que representen els biomarcadors de l'oxidació de FA i la lipogènesi, respectivament. Per tant, aquests enzims són objectius potencials dels PAC, la qual cosa indica el potencial polifenòlic per prevenir l'acumulació de lípids, considerada una manifestació patològica de la inflamació d'OxSand en molts teixits*3. Els mecanismes moleculars probablement estan relacionats amb la regulació a l'alça de PPARa i la baixada de SREBPlc, dos factors de transcripció que regulen el metabolisme dels lípids. El FAS és l'enzim central de la lipogènesi, responsable de catalitzar la conversió de malonil-CoA a FAs45. Per la seva banda, l'ACC catalitza la formació de malonil-CoA, un substrat essencial per al FAS. D'acord amb les nostres troballes, també es va trobar que els polifenols de Solanum nigrum disminueixen FAS i SREBP, alhora que augmentaven CPTla i PPARa en hepatòcits tractats amb àcid oleic".

Els mecanismes d'acció dels polifenols s'associen generalment amb l'activació de la fosforilació d'AMPKa7. És important destacar que l'AMPKa fosforilada del nostre estudi va ser reduïda per Fe/Asc, però estimulada pels PAC, la qual cosa explica la regulació a la baixa del fosfo ACC, donant lloc a una lipogènesi inhibida i un augment del metabolisme energètic. Tanmateix, l'expressió de proteïnes d'AMPKa es va incrementar per OxS induït per Fe/Asc a les cèl·lules Caco2/15. En conseqüència, ROS i OxS poden induir AMPKa mitjançant diferents quinases aigües amunt8.

L'OCS i la inflamació indueixen fortament la resistència a la insulina i trastorns metabòlics addicionals9,50, cosa que ens va portar a avaluar la capacitat de Pac per regular algunes proteïnes clau en relació amb la via de senyalització de la insulina. Primer ens vam centrar en p38-MAPK l'expressió del qual es va trobar regulada per OxS mentre interferia amb la cascada de senyalització del receptor d'insulina. Tant l'anàlisi de la p38-fosforilació de MAPK com el càlcul de la relació fosfo p{38-MAPK/p{38-MAPK van revelar un augment significatiu de la resposta a Fe/Asc, que és compatible amb un IS deteriorat a Caco{ {6}}/15 cel·les. La validació es va obtenir mitjançant la disminució de pAkt i PI3K. En canvi, els PAC van invertir la tendència, ja que mostraven la capacitat de reduir la fosforilació p38-MAPK i la relació fosfo p{38-MAPK/p{38-MAPK alhora que milloraven la via de senyalització PI3K/Akt, que se sap que media les principals accions biològiques de la insulina mitjançant la regulació del transport de glucosa, la síntesi de proteïnes, la proliferació cel·lular, la supervivència cel·lular i la gluconeogènesi. El deteriorament de l'IS a causa de l'OxS i la inflamació crònica també poden afectar el procés de gluconeogènesi3,54. L'anàlisi dels dos enzims principals implicats en la síntesi de glucosa de novo (PEPCK, G6Pase) va revelar un augment significatiu de la resposta a Fe/Asc, mentre que l'administració de PAC els va tornar a nivells normals a les cèl·lules Caco2/15.

En conclusió, nombrosos estudis de la literatura científica demostren efectes significatius sobre la salut dels compostos fenòlics, ja sigui com a molècula fenòlica específica o com a barreja de diversos polifenols per evidència indirecta. El present treball assenyala l'efecte crucial dels PAC (flavanols complexos) en l'homeòstasi intestinal mitjançant la prevenció de l'OxS, la inflamació i els trastorns metabòlics relacionats. Com que els PAC poden no ser totalment absorbits per l'intestí prim, calen estudis addicionals per investigar els mecanismes implicats en els seus efectes beneficiosos per a la salut a l'intestí prim.

material i mètodes

Cultiu i tractament de cèl·lules de caco intestinal-2/15. Per a tots els experiments, hem utilitzat la línia cel·lular d'adenocarcinoma colorectal epitelial humà Caco-2/15, un clon estable de les cèl·lules Caco-2 pares (American Type Culture Collection, Rockville, Md., EUA), que es va obtenir del Dr. JF Beaulieu (Departament de Biologia Cel·lular, Facultat de Medicina, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canadà). La línia cel·lular Caco-2/15 té la propietat única de diferenciar-se in vitro en enteròcits madurs polaritzats i de formar un mon-over impermeable. Les cèl·lules Caco-2/15 es van cultivar tal com es va descriure anteriorment323455 i es van utilitzar per a l'estudi de la integritat cel·lular, l'OCS i la inflamació17,19 i IS56.

Anàlisi de l'expressió de proteïnes per immunoblot. Després de la incubació amb diversos tractaments, les cèl·lules Caco-2/15 es van lisar en tampó fred amb gel que contenia 20 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM de NaCl, 1 mM de Na2E-DTA, 1 mM d'EGTA, 1 per cent de NP. -40, 1 per cent de desoxicolat, 2,5 mM de pirofosfat de sodi, 1 mM de Na2VO4, 1 ug/mL de leupeptina i 1 mM de PMSF. La concentració de proteïnes de cada mostra es va determinar mitjançant el mètode Bradford (Bio-Rad). Les proteïnes es van desnaturalitzar durant 5 min en un tampó de mostra que contenia SDS i ß-mercaptoetanol. Els homogeneïts que contenien 15 ug de proteïnes totals es van separar en un gel de poliacrilamida SDS al 10% segons els pesos moleculars de les proteïnes i es van electroblot a membranes de nitrocel·lulosa. La llet sense greixos es va utilitzar per bloquejar llocs inespecífics de les membranes abans d'afegir anticossos primaris durant la nit a 4 graus. La dilució dels anticossos s'informa a la informació suplementària i a la nostra publicació recent. Les bandes reactives es van capturar mitjançant un sistema d'imatge ChemiDoc MP (Bio-Rad). Totes les dades s'expressen com la relació entre la proteïna diana i l'actina de la mateixa mostra.

Anàlisi estadística. Tots els valors s'expressen com a mitjana ± SEM d'almenys tres experiments diferents realitzats per triplicat. Les dades es van analitzar mitjançant ANOVA unidireccional seguit de les proves de comparacions múltiples de Tukey mitjançant PRISM 7.0(GraphPad Software, San Diego, CA, EUA). Les diferències es van considerar significatives a P<>

Aquest article està extret de Scientifc Reports|(2021) 11:3878|https://doi.org/10.1038/s41598-020-80587-5