El fixador de Karnovsky evita que els artefactes apareguin com a vacuolització derivada del processament de teixits en ronyons tractats amb oligonucleòtids antisentit Ⅰ

Resum: Oligonucleòtid antisentit(ASO) s'han identificat com una nova modalitat de tractamentmalalties intractables. Enronyons tractats amb ASO, els vacúols, a més dels grànuls basòfils, s'observen sovint als túbuls proximals. Alguns informes han descrit que és probable que aquests vacúols siguin un fenomen secundari derivat de laextracció d'ASOdurant el processament dels teixits. En aquest estudi, es va comparar la morfologia renal després de la fixació amb el fixador de Karnovsky o el tampó de fosfat de paraformaldehid (PFA) al 4% amb la de la solució de formaldehid tamponat neutre al 10% (NBF). Es van examinar rates Sprague-Dawley femelles, tractades per via intravenosa quatre vegades amb 50 mg/kg d'àcid nucleic bloquejat que contenia oligonucleòtids antisentit (LNA-ASO) durant 1 o 2 setmanes. Microscòpicament, es van observar vacúols i grànuls basòfils als túbuls proximals als ronyons fixats amb NBF. Els grànuls basòfils són indicatius de l'acumulació d'ASO. A més, alguns dels vacúols també contenien grànuls basòfils febles, cosa que suggereix que els vacúols eren rellevants per a l'acumulació d'ASO. Tot i que es va observar una vacuolació moderada als túbuls proximals, la majoria dels epitelis vacuolats van ser negatius per a la molècula de lesió renal -1 en la tinció immunohistoquímica. No es van observar vacúols als túbuls proximals en mostres sotmeses a la fixació de Karnovsky, tot i que es van observar grànuls basòfils. En mostres sotmeses a fixació de PFA, es van observar vacúols i grànuls basòfils als túbuls proximals, similars als de les mostres sotmeses a la fixació de NBF. En general, les nostres troballes van demostrar la possibilitat de sobreestimar la vacuolització a causa d'artefactes durant el processament de teixits quan s'utilitza la fixació convencional de NBF. El fixador de Karnovsky es considera una alternativa útil per distingir vacúols artificials de la veritable nefrotoxicitat. (DOI: 10.1293/tox.2021-0007; J Toxicol Pathol 2021; 34: 367–371)

Paraules clau:oligonucleòtid antisentit, artefacte,El fixador de Karnovsky, vacuolització, grànul basòfil, ronyó

Suplement de Cistanche Suplement de suport a la funció renal PhGs75% Ech 30% Act 12%

Recentment, s'han establert teràpies d'oligonucleòtids antisentit (ASO) com a noves modalitats per al tractament de malalties intractables1, 2. Els ASO són ​​oligodesoxinucleòtids curts, sintètics i monocatenaris que s'uneixen a l'àcid ribonucleic i suprimeixen l'expressió gènica3.

Toxicològicament, les toxicitats induïdes per ASO es classifiquen en toxicitats dependents de la hibridació, que estan relacionades amb la seqüència ASO, i toxicitats independents de la hibridació, que estan relacionades amb la modificació química. Les toxicitats independents de la hibridació s'indueixen per tres mecanismes principals: 1) acumulació d'ASO, 2) efectes proinflamatoris i 3) efectes d'unió aptamèrica4. L'acumulació d'ASO s'observa principalment al fetge i als ronyons, i l'acumulació excessiva condueix a una disfunció d'aquests òrgans5. L'efecte proinflamatori és induït per l'estimulació del sistema immunitari innat mitjançant la unió a receptors Toll-like en rosegadors i micos o l'activació de la via alternativa del complement mitjançant la inhibició del factor H per part dels ASO en micos6. L'efecte d'unió aptamèrica indueix l'activació plaquetària i l'agregació/trombocitopènia per unir-se al receptor específic de plaquetes7. A més, la unió aptamèrica a proteïnes intracel·lulars dels hepatòcits es considera una de les causes de l'hepatotoxicitat8–10. Per detectar aquestes toxicitats, els investigadors han desenvolupat diversos assajos no clínics; entre aquestes, l'examen histopatològic és una de les proves més sensibles per detectar l'acumulació d'ASO.

Histopatològicament, l'acumulació d'ASO s'observa habitualment com a grànuls basòfils al citoplasma de les cèl·lules de Kupffer al fetge o als túbuls proximals dels ronyons. L'acumulació destacada de grànuls basòfils es correlaciona amb una major incidència o gravetat dels canvis degeneratius, que s'observen habitualment com a vacuolització o degeneració/necrosi de l'epiteli tubular proximal als ronyons4. Els grànuls basòfils sols no es consideren toxicològicament significatius11; per tant, la diferenciació de l'acumulació de grànuls basòfils dels canvis degeneratius és important per avaluar les toxicitats relacionades amb ASO.

Els vacúols, que sovint s'observen als túbuls proximals dels ronyons dels micos cynomolgus tractats amb ASO, contenen material basòfil i presenten la mateixa distribució general a les cèl·lules que els grànuls basòfils11, 12. Alguns informes han suggerit que el procés de fixació pot influir en el aparició d'acumulació d'ASO dins del compartiment fagolisosomal5, 11. A més, Henry et al. i Engelhardt van descriure que és probable que els vacúols dels túbuls proximals siguin un fenomen secundari derivat de l'extracció d'ASO durant el processament perquè els vacúols estan absents en els ronyons fixats per perfusió de paraformaldehid/glutaralde hyde5, 11. Vacúols dels túbuls proximals dels micos tractats. amb mipomersen es va especular que apareixien durant el procés de fixació13.

Així, tot i que la vacuolització a causa del tractament amb ASO pot ser un artefacte en alguns casos, aquesta hipòtesi no s'ha demostrat clarament, i cap informe ha identificat el mètode de fixació adequat per a l'avaluació toxicològica. En conseqüència, en aquest estudi, es va comparar la morfologia renal després de la fixació amb el fixador de Karnovsky o el tampó de fosfat de paraformaldehid (PFA) al 4% amb la de la solució de formaldehid tamponada neutre al 10% (NBF). A més, vam demostrar la utilitat del fixador de Karnovsky com a fixador alternatiu per evitar la vacuolització derivada d'artefactes.

Es van comprar rates Sprague-Dawley femelles de quatre setmanes a Charles River Laboratories Japan Inc. (Kanagawa, Japó) i es van aclimatar a les condicions de laboratori. Els animals es van mantenir en condicions controlades (12-cicle de llum/foc per hores, temperatura de 23 ± 2 graus, humitat relativa del 50 ± 25%) i se'ls va permetre l'accés lliure a una dieta comercial estàndard (CR-LPF autoclau; Oriental Yeast Co., Ltd., Tòquio, Japó) i aigua de l'aixeta. Es van assignar vint animals als quatre grups següents (amb cinc animals cadascun): el grup de 1-setmana tractat amb solució salina (Control- 1W), 2-grup de setmana tractat amb solució salina (Control- 1W). {14}}W), el grup tractat amb oligonucleòtids antisentit (LNA-ASO) (ASO-1W) i 2-setmana d'àcid nucleic bloquejat (ASO-1W) i 2-setmana el grup tractat amb LNA ASO (ASO-2W). Els animals tenien 5 setmanes en el moment de l'inici de l'administració de 50 mg/kg de LNA-ASO. LNA-ASO es va administrar per via intravenosa quatre vegades en total segons el règim següent: dies 1, 4, 8 i 11 al grup ASO-2W; i els dies 1, 2, 3 i 4 del grup ASO-1W. Els animals dels grups Control-1W i ASO-1W es van sacrificar el dia 7. Els animals dels grups Control{-2W i ASO-2W es van sacrificar el dia 14. A cada necròpsia terminal es van recollir mostres de sang per a patologia clínica de la vena cava abdominal sota anestèsia profunda amb isoflurà. Després de la presa de mostres de sang, totes les rates van ser sacrificades per exsanguinació tallant immediatament l'aorta abdominal. Es van examinar macroscòpicament la superfície corporal externa, les cavitats toràciques i abdominals i les vísceres i es van extreure els ronyons esquerres i es van processar per a un examen microscòpic. Tots els procediments es van realitzar d'acord amb les Normes per a l'alimentació i l'emmagatzematge d'animals experimentals i experiments amb animals de Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation.

Les mostres de sèrum es van obtenir per centrifugació de les mostres de sang a 4 graus. L'anàlisi bioquímica sèrica es va realitzar mitjançant un instrument TBA-2000FR (Canon Medical Systems Corporation, Tochigi, Japó) per avaluar els nivells de nitrogen ureic en sang (BUN) i creatinina (CRE)

Els ronyons es van fixar mitjançant tres solucions fixadores de la següent manera: després de dividir el ronyó transversalment en tres segments, la part mitjana, inclosa la pelvis renal, es va fixar en 10% NBF durant 5 dies; la part cranial es va fixar amb el fixador de Karnovsky (Muto Pure Chemicals Co., Ltd., Tòquio, Japó); i la porció caudal es va fixar en 4% PFA durant 17 hores a 4 graus i després es va col·locar en 10% NBF durant 24 hores. Cada mostra fixa es va deshidratar i es va incrustar en parafina. Es van preparar seccions de teixit per a la tinció d'hematoxilina i eosina (H&E). La tinció immunohistoquímica es va realitzar mitjançant anticossos dirigits a la molècula de lesió renal-1 (KIM-1; R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, EUA; dilució 1:300) i la proteïna 2 de membrana associada a lisosomals (LAMP{{{ 13}}; Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EUA; dilució 1:1000) després de la recuperació d'antigen (tampó de citrat, pH 6,0, escalfat durant 10 min o escalfat a pressió durant 20 min). Com a anticossos secundaris es va utilitzar Histofine Simple Stain Rat MAX PO (Nichirei Biosciences Inc., Tòquio, Japó).

Servei de suport de Wecistanche:

Correu electrònic:wallence.suen@wecistanche.com

WhatsApp/Tel:+86 15292862950}

Compreu per obtenir més detalls de les especificacions:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop