Trasplantament de ronyó

Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

INTRODUCCIÓ

Ronyótrasplantamentés la millor opció per al tractament en fase final de la malaltia renal crònica. Actualment, el rebuig mediat per anticossos (AMR), que es caracteritza per la presència d'un anticòs específic del donant (DSA) dirigit a l'antigen leucòcit humà (HLA), s'ha convertit en la principal causa de dany crònic a l'empelt renal, que limita en gran mesura la supervivència a llarg termini de l'empelt. (1, 2). Tanmateix, els esquemes existents no han aconseguit resultats prometedors en la clínicatractament de la RAM (1, 3, 4). Per tant, hi ha una necessitat urgent d'identificar biomarcadors potencials i factors de risc per a la RAM després del trasplantament de ronyó, que és fonamental per al tractament i els resultats dels pacients.

L'evidència acumulada suggereix que en circumstàncies inflamatòries, les cèl·lules B es poden diferenciar en plasmablasts secretors d'anticossos i cèl·lules B reguladores (Bregs), que són un subconjunt especial de cèl·lules B que secreten citocines immunosupressores, especialment interleucina (IL)-10. (1, 5–7). Així, els plasmablasts produeixen alloanticossos, donant lloc a AMR, mentre que els Bregs presenten funcions immunoreguladores i ajuden a induir l'homeòstasi immune. Així, s'ha informat que els Bregs estan estretament associats amb la resistència a la RAM després dels trasplantaments de ronyó (1, 8, 9).

Encara que els diferents marcadors de superfície dels subconjunts de Breg encara no s'han identificat en humans (1), estudis anteriors han informat de quatre subpoblacions comunes de Breg: Bregs de memòria (mBregs) definits amb el CD19 més CD24 més CD27 plus (10), Bregs de transició (10). tBregs) definits amb CD19 més CD24 més CD38 més (10, 11), Bregs de memòria que produeixen IL-10-(IL{-10 més mBregs) definits amb CD19 més CD24 més CD27 més IL-10 més (12) i produint IL-10-Bregs de transició (IL-10 més tBregs) definits amb CD19 més CD24 més CD38 més IL-10 més (13). Laguna-Goya et al. va informar que la reducció de tBregs i IL-10 més tBregs s'associa positivament amb el rebuig agut després dels trasplantaments de ronyó (14). Tanmateix, Zhou et al. va informar que els mBregs, més que els tBregs, van disminuir significativament en cinc pacients amb rebuig agut després del trasplantament hepàtic (10). A més, Shabir et al. va informar que els tBregs no es van associar amb el rebuig de l'al·loempelt renal en tres pacients amb AMR (15). A la llum d'aquests resultats inconsistents, cal aclarir encara més quina subpoblació de Breg té un paper vital en pacients amb RAM després dels trasplantaments de ronyó.

En el present estudi, es van comparar les proporcions de quatre subpoblacions de Bregs circulants entre els grups sans, estable (ST) i AMR. A continuació, es va determinar la biodistribució de cèl·lules B, IL-10 i quimiocines als empelts renals de pacients sans, ST i AMR. A més, es va investigar la dinàmica de les quatre subpoblacions de Bregs circulants en pacients amb ST durant 90 dies després de la cirurgia. Aquests resultats actuals, juntament amb els reportats per estudis anteriors (1), suggereixen que IL-10 més mBregs i IL-10 més tBregs són les principals subpoblacions de Breg que contribueixen a la resistència a la RAM.

Cistanche tubulosa en polsimpedeixmalalties renals, feu clic aquí per obtenir la mostra

Paraules clau:Fenotipat Breg, trasplantament de ronyó, rebuig mediat per anticossos, homeòstasi, dinàmica

MATERIALS I MÈTODES

Pacients i Grups

Tots els pacients van proporcionar un consentiment informat signat abans de l'estudi. El present estudi va ser aprovat pel Comitè d'Ètica del Primer Hospital Afiliat de la Universitat de Zhengzhou (2018-KY-72). El número de registre de l'assaig clínic és ChiCTR1900022501.

Aquests pacients es van dividir en tres grups: (1) grup control saludable (san, n=9): donants de ronyó sans d'entre 18 i 55 anys (lliures de malaltia), format pels germans i cònjuges dels receptors; (2) receptors amb grup de funció d'empelt estable (ST, n=25): pacients d'entre 18 i 55 anys, la funció renal dels quals era estable (lliure d'infecció o rebuig abans i després del trasplantament de ronyó) durant el seguiment. període (superior o igual a 6 mesos); (3) receptors amb grup AMR (AMR, n=18): pacients d'entre 18 i 55 anys, als quals se'ls va diagnosticar AMR. Es van obtenir els empelts renals de receptors amb ST i AMRdonant de ronyó sas. El diagnòstic diferencial entre els grups ST i AMR va ser confirmat per dos patòlegs renals, segons el consens de Banff 2017 (3, 16).

Sang perifèrica, teixits renals i mostres de cèl·lules

Les mostres de sang perifèrica del grup sa es van recollir abans de l'operació i als 1, 7 i 14 dies després de l'operació. Les mostres obtingudes del grup ST es van recollir abans de l'operació i als 1, 7, 14, 30 i 90 dies després de l'operació. Les mostres obtingudes del grup AMR es van recollir quan es va produir el rebuig (abans de la teràpia anti-rebuig per a la RAM). Es van aïllar cèl·lules mononuclears de sang perifèrica (PBMC).

5 ml de sang per centrifugació en gradient de Ficoll-Paque i conservada amb un 10 per cent de sulfòxid de dimetil (Solarbio Inc., Pequín, Xina) en nitrogen líquid.

Les mostres de biòpsia renal amb agulla central obtingudes del grup sa es van recollir abans de la cirurgia per a biòpsies de ronyó de donant temps zero. Les mostres de biòpsia renal amb agulla central obtingudes del grup ST es van recollir als 90 dies després de l'operació després que la seva funció renal s'estabilitzés a causa de la biòpsia del protocol. A la llum del segon deteriorament de la funció renal per punció, tots els pacients amb AMR van rebutjar la biòpsia renal amb agulla central després de la teràpia anti-rebuig per a AMR. Així, les mostres de biòpsia renal amb agulla central del grup AMR només es van recollir quan es va produir el rebuig (abans de la teràpia anti-rebuig per a la RAM). Un total de tres donants sans, nou pacients amb ST i nou pacients amb AMR van proporcionar un consentiment informat signat abans de la biòpsia renal amb agulla central. Els sis donants sans restants, 16 pacients amb ST i nou pacients amb AMR van rebutjar la biòpsia renal amb agulla bàsica per por a una hemorràgia important associada a la biòpsia. Es van aïllar cèl·lules individuals de les mostres de biòpsia renal amb agulla central de tres donants sans, tres pacients amb ST i tres pacients amb AMR, combinant la dissociació mecànica amb la degradació enzimàtica de la matriu extracel·lular, que manté la integritat estructural dels teixits (Multi Tissue Disssociation Kit). 1; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanya). Les cèl·lules renals es van conservar amb un 10 per cent de dimetilsulfòxid (Solarbio Inc., Pequín, Xina) en nitrogen líquid, i les mostres de biòpsia renal amb agulla central restants es van incrustar en parafina a 4 graus.

Citometria de flux

Les cèl·lules emmagatzemades en nitrogen líquid es van descongelar ràpidament en un bany d'aigua a 37 graus durant 3 minuts. Es van incubar un total de 2–3 × 106 PBMC amb el còctel d'estimulació de cèl·lules de dilució 1640 de Roswell Park Memorial Institute (500 ×), que constava de PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetat), un ionòfor de calci (ionomicina) i inhibidors del transport de proteïnes Brefeldin A i Monensin, (eBioscience, San Diego, CA), a 37 graus amb un 5% de CO2 durant 5 h. Les cèl·lules mortes es van excloure tenyint amb 7-aminoactinomicina D (Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA) i els marcadors superficials de Bregs es van tenyir amb anticossos marcats amb fluorocrom (Brilliant Violet 421™ anti-CD19 humana, ficoerythrin). (PE)/Cy7 anti-humà CD24, Alexa FluorR647 anti-humà CD27, Alexa FluorR488

anti-CD38 humà i Brilliant Violet 510™ anti-humà CD45; els controls d'isotip adequats: Brilliant Violet 421™ Mouse

Control d'isotip IgG1 k, control d'isotip del ratolí PE/Cy7 IgG2a k, control d'isotip del ratolí Alexa FluorR647 IgG1 k, control d'isotip del ratolí Alexa FluorR488 IgG1 k i brillant violeta

510™ Mouse IgG1 k Isotype Control; Biolegend, San Diego, CA,

EUA) durant 30 min a 4 graus, amb protecció de la llum. Per a la tinció intracel·lular, les cèl·lules es van tacar amb anticossos dirigits a les citocines intracel·lulars de Bregs (PE anti-IL-10; els controls d'isotip adequats: PE Rat IgG1 k Isotype Control; Biolegend, San Diego, CA, EUA) per a 30 minuts a temperatura ambient, amb protecció de la llum. Les cèl·lules marcades es van analitzar mitjançant l'instrument BD Biosciences Canto II (BD Biosciences, EUA). Es van adquirir un total de 100,000 esdeveniments a la porta dels limfòcits. L'anàlisi de dades es va realitzar mitjançant el programari FlowJo (Tree Star, San Carlos, CA, EUA).

Immunohistoquímica

Immunohistochemistry staining of CD19, IL-10, and C-X-C motif chemokine 13 (CXCL13) in kidney tissues was performed, respectively. Brieflfly, 4 mm sections obtained from formalin-fifixed, paraffifin-embedded kidney tissue samples were incubated with 1:500-diluted anti-CD19, 1:1000-diluted antiCXCL13 (rabbit anti-human; Abcam, Cambridge, UK), and 1:500-diluted anti-IL-10 (rabbit anti-human; Absin, Shanghai, China) primary antibodies overnight at 4°C, followed by Horseradish Peroxidase-conjugated 1:20,000-diluted goat antirabbit secondary antibody (Abcam, Cambridge, UK) for 1 h at room temperature and then 3,3′-diaminobenzidine for another 10 min. DAPI appears in blue. Immunohistochemistry images were acquired with an Aperio ScanScope AT Turbo (Aperio, Vista, CA). Numbers of CD19, IL-10, and CXCL13 positivities were scored as follows: 0 positivity, score = zero; 1–5 positivities, score = one; 6–10 positivities, score = two; 11–20 positivities, score = three; >20 positius, puntua=quatre

Anàlisi estadística

A l'estudi de casos i controls imbricats, MedCalc v18.11.3 va realitzar l'anàlisi de la corba de la característica operativa del receptor (ROC). Les anàlisis estadístiques restants es van realitzar mitjançant IBM SPSS 21.0. Les dades de mesura distribuïdes normalment amb una homogeneïtat de la variància es van expressar com a mitjana ± desviació estàndard (x ± s) i es van analitzar mitjançant una prova t de mostra independent (comparacions entre grups) o anàlisi unidireccional de la variància (comparacions entre grups). Les dades de mesura que no tenien una distribució normal ni una homogeneïtat de variància es van expressar en mediana amb rang interquartil (IQR) i es van analitzar mitjançant la prova U de Mann-Whitney (comparacions entre grups) o la prova de Kruskal-Wallis (comparacions entre grups). Les dades de recompte es van analitzar mitjançant una prova c2, una prova c2 corregida o la prova exacta de Fisher, segons calia. Anàlisi de la variància de mesures repetides unidireccionals

s'ha utilitzat en diferents moments. Valors P<0.05 were="" considered="" statistically="">

RESULTATS

Característiques inicials dels pacients

En el present estudi es van incloure un total de nou donants sans, 25 pacients amb ST i 18 pacients amb AMR. Tal com es mostra a la taula 1, el gènere dels receptors, l'edat, l'índex de massa corporal (IMC), la nefropatia inicial, el desajust HLA, els CNI, el temps d'isquèmia calenta i el temps d'isquèmia freda no difereixen entre grups ni entre grups (P). > 0.05, per a tots). No obstant això, la incidència de la positivitat de DSA anticlasse I i anticlasse II en el grup AMR va ser significativament més alta, en comparació amb les del grup ST (P <0.001 per="" a="" anti="" -classe="" i="" dsa,="" p=""><0,001; p="0,001" per="" a="" anticlasse="" ii="" dsa).="" a="" més,="" en="" comparació="" amb="" els="" pacients="" amb="" st,="" els="" pacients="" amb="" amr="" tenien="" puntuacions="" significativament="" més="" altes="" en="" tubulitis="" (t),="" inflamació="" intersticial="" (i)="" i="" capil·laritis="" peritubular="" (ptc)="" (p="0,012" per="" a="" t;="" p=""><0,001 per="" i="" i="" ptc).="" ),="" segons="" la="" classificació="" de="" banff="" (normal,="" puntuació="0;" lleu,="" puntuació="1;" moderat,="" puntuació="2;" greu,="" puntuació="3)" (3,="" 16)="" (="" taules="" complementàries="" 1="" i="">

cistanche echinacosideper diabetis