Lamivudina millora la disminució cognitiva dels ratolins SAMP8: integració en l'avaluació farmacològica Vivo i la farmacologia de xarxa
May 30, 2023
Taxol Alternative Chinese Herbes Cistanche
Paraules clau:Aspergillus favus · Jojoba · Fongs endofítics · Nanopartícules d'or · Taxol · - Irradiació · Optimització nutricional
Introducció
Taxol és un dels d'ampli espectre més comercialitzatfàrmacs anticancerígens[1]. L'activitat de Taxol s'elabora a partir de la seva especificitat única per unir-se amb l'heterodímer de subunitats de tubulina cel·lular, promovent la polimerització de la tubulina, interrompent així la divisió mitòtica de les cèl·lules tumorals [2]. Taxol va mostrar una forta activitat contra els càncers de mama, pulmó, cap i coll, uterins i formes avançades de sarcoma de Kaposi [3]. El taxol es va produir en primer lloc a partir de l'escorça dels teixos Taxus brevifolia "família Taxaceae" [4, 5]; tanmateix, el menor rendiment de Taxol que ser<0.001%, i.e., to produce 1 g Taxol, it requires~10 kg of plant bark that collected from 3 to 5 trees [6], is the main challenge. In addition, the vulnerability of this plant to unpredicted fluctuations with the environmental conditions strongly influences the Taxol yield, heterogeneity, and reproducibility [7–9]. Exploring the Taxol producing potency of the endophytic fungi inhabiting medicinal plants raises the hope for overcoming the low yield by the above-mentioned method [10, 11], due to their fast growth, cost-effectiveness, independence on climatic changes, and feasibility for genetic manipulation [12, 13]. Subsequently, a plethora of endophytic fungi with metabolic potency to produce Taxol has been reported as reviewed [1, 14–25]. However, the anticipation of these fungi for industrial production of Taxol has been challenged by the attenuation and loss of Taxol productivity by the fungal storage and multiple subculturing [21, 22, 26–28]. Thus, searching for a novel fungal isolate with affordable metabolic stability and sustainability for Taxol production is the challenge. Medicinal plants of well-known ethnopharmacological relevance and traditional pharmaceutical applications could be the repertoire of novel fungal isolates with unique features of metabolic stability for Taxol biosynthesis. Among the most common medicinal plants, jojoba "Simmondsia chinensis" is a monogenetic dioecious grey-green shrub belonging to the Simmondsiaceae family. Jojoba seeds contain up to 65% of light golden and odorless high-viscosity oily metabolites [29]. Jojoba oil has been frequently used for the relief of headaches, throat inflammation, and wound treatment [30, 31]. As well as Jojoba oil has been used as an anti-inflammatory and antimicrobial agent [30, 31]. The leaves of jojoba are rich with antioxidant flavonoid compounds that are traditionally used for treating of various disorders such as asma,inflamació, icàncer[32]. Així, l'objectiu principal d'aquest treball va ser explorar un nou aïllat de fongs de planta de jojoba amb una estabilitat metabòlica única per a la producció de Taxol, per avaluar els diferents enfocaments per maximitzar el seu rendiment de Taxol, així com, per millorar l'activitat antiproliferativa dels compostos de Taxol extrets. mitjançant la conjugació amb nanopartícules d'or, mediada per irradiació gamma.
Material i mètodes
Aïllament i cultiu dels fongs endofítics
Es van recollir diferents parts de jojoba (Simmondsia chinensis) com fulles, escorces, branquetes i brots de la Facultat d'Agricultura de la Universitat del Caire i es van utilitzar com a font de fongs endofítics. Les parts de la planta es van recollir i es van rentar amb aigua corrent, es van esterilitzar la superfície amb etanol al 70 per cent durant 1 min i després es van esbandir amb aigua estèril [28]. Les parts de la planta esterilitzades a la superfície es van tallar en trossos petits en condicions estèrils i es van col·locar en plaques de medi d'agar dextrosa de patata (PDA), Czapek's-Dox i mitjà d'agar extracte de malta [33–36], i les plaques es van incubar a 30 graus per 10 dies. L'eficàcia de l'esterilització superficial de les parts de la planta es va avaluar mitjançant la centrifugació de l'aigua d'esbandida, després es va afegir 500 ul d'aigua estèril al precipitat i es va xapar al medi PDA [37]. Els aïllats de fongs endofítics purificats es van inocular en inclinacions de PDA durant 7 dies i es van emmagatzemar a 4 graus.
Cribratge, extracció i quantificació de taxol dels fongs endofítics
Els fongs endofítics recuperats que habiten jojoba es van examinar per a la producció de Taxol creixent en brou de dextrosa de patata (PDB) [38]. Es va inocular un tap de cadascun dels aïllats fun gal de 7 dies en 100 ml de tasques Erlenmeyer PDB/250 ml, incubat durant 15 dies a 30 ± 1 grau, en condicions de sacsejada (120 rpm). Després de la incubació, es van filtrar els cultius i es va modificar el filtrat amb bicarbonat de sodi al 0, 2 per cent per precipitar els àcids grassos. El taxol s'ha extret amb diclorometà i la fase orgànica es va recollir i evaporar fins a sequedat, i els residus es van tornar a dissoldre en metanol [17, 39]. El taxol es va separar i es va identificar mitjançant TLC mitjançant plaques de gel de sílice prerevestides Merck d'1 mm (20 × 20 cm) (TLC Gel de sílice 60 F254, Darmstadt, Alemanya), detectades per il·luminació UV a 254 nm [39]. Les taques putatives de Taxol es van eliminar de les plaques de gel de sílice TLC i es van dissoldre en metanol, es van vortexar vigorosament durant 10 min i es van centrifugar a 1000 rpm durant 5 min. Es van eliminar les partícules de sílice precipitades i es va prendre el sobrenedant per a la quantificació del taxol i la comprovació de la puresa mitjançant HPLC (YOUNG In, Chromass, 9110 més Quater nary Pump, Corea) de la columna de fase inversa C18 (Eclipse Plus C18 4.6). ×150 mm, 3,5 μm, núm. cat 959.963–902). La fase mòbil utilitzada va ser metanol/acetonitril/aigua (25:35:40, v/v/v) a una velocitat d'1,0 ml/min durant 20 min [40], i les fraccions de taxol es van mesurar a 227 nm i la seva La identitat química i les concentracions es van confirmar a partir del temps de retenció i l'àrea del pic d'absorció en comparació amb la mostra autèntica.
Identificació morfològica i molecular dels fongs endofítics recuperats
Els aïllats de fongs endofítics es van identificar als seus nivells d'espècie en funció de les seves característiques macro i micromorfològiques creixent en mitjans PDA, Czapek's-Dox i extracte de malta segons les claus de la referència [33–36]. La identitat dels aïllats de fongs productors de taxol més potents es va confirmar molecularment a partir de la seqüència de l'espaiador intern transcrit (ITS) [41, 42]. L'ADN genòmic dels fongs (gDNA) es va extreure polveritzant el miceli (~0,2 g) en nitrogen líquid, després es va dispensar en 1 ml de tampó d'extracció CTAB (2 per cent de CTAB, 2 per cent de PVP40, { {21}},2 per cent 2-mercaptoetanol, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl en 100 mM Tris−HCl, pH 8,0). Els conjunts d'imprimadors de PCR eren ITS4 5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3′ i ITS{5 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′. La reacció de PCR conté 10 ul de mescla mestra 2×PCR (i-Taq™, núm. cat. 25027), 2 ul de gDNA, 1 ul de cada imprimació (10 pmol/ul) i es completa a 20 ul amb destil·lat estèril. aigua. La PCR es va programar per a la desnaturalització inicial a 94 graus durant 2 minuts, desnaturalització a 94 graus durant 30 s, recuit a 55 graus durant 10 s, extensió a 72 graus durant 30 s durant 35 cicles i extensió final a 72 graus durant 2 s. min. Els amplicons de PCR es van analitzar amb un gel d'agarosa a l'1,5 per cent en un tampó 1 × TBE (Ambion Cat # AM9864), utilitzant una escala d'ADN d'1 kb (Cat. # PG{010-55DI) i es van visualitzar mitjançant el sistema de documentació del gel. Els amplicons es van purificar i seqüenciar mitjançant Applied Biosystems Sequencer, HiSQV Bases, versió 6.0 amb els mateixos conjunts d'imprimadors. Les seqüències obtingudes es van cercar BLAST de manera no redundant a la base de dades NCBI, es van importar al programari MEGA 6.0 i es van alinear amb l'algorisme muscular Clustal W [43] i l'arbre filogenètic es va construir amb el mètode d'unió de veïns de MEGA 6.0 [44].
Estructura química del taxol extret
Les taques putatives de Taxol es van eliminar de les plaques de gel de sílice TLC i es van purificar, i la puresa i la concentració es van determinar mitjançant les anàlisis UV-Vis a λ 227 nm (RIGOL, Sèrie Ultra-3000) en comparació amb Taxol autèntic [39]. Es van utilitzar mitjans en blanc en les mateixes condicions com a línia de base negativa per a les anàlisis espectrofotomètriques. L'espectre FT-IR de les mostres de Taxol purificades es va analitzar mitjançant l'espectrofotòmetre JASCO FT-IR 3600. La mostra de Taxol es va triturar amb pellets de KBr, es va premsar en discos al buit i es va mesurar l'absorció a la regió de 400 a 4000 cm−1 [3], en comparació amb l'autèntic. L'estructura química del Taxol extret es va confirmar a partir de l'espectroscòpia HNMR (JEOL, ECA-500II, 500 MHz RMN) en comparació amb el Taxol autèntic. Les mostres es van dissoldre en CDCl3, els desplaçaments químics es donen en ppm (escala δ) i les constants d'acoblament s'expressen en hertz (Hz).
Efecte dels diferents tipus de mitjans en la producció de taxols
Es van inocular dos taps d'agar (9 mm) de cultius de 7 dies de cada aïllat de fongs per triplicat en un matràs Erlenmeyer de 100 ml de mitjà/250 ml de dextrosa de patata (PDB), Czapek's-Dox (CZD), M1D i extracte de malta (ME). ) medi de brou. Es van utilitzar controls no inoculats de cada medi que no contenen espores de fongs com a control negatiu, incubats a 30 graus durant 15 dies en les mateixes condicions. Després de la incubació, es van filtrar cultius de fongs i es va extreure Taxol i es va determinar com s'ha esmentat anteriorment.
Optimització de bioprocessos de les condicions nutricionals per maximitzar el rendiment de taxols
L'optimització de la composició mitjana per maximitzar el rendiment de Taxol per part del potent aïllat fun gal es va dur a terme mitjançant la metodologia de la superfície de resposta mitjançant el disseny Placket-Burman seguit d'un disseny compost central [17–20, 45). A partir dels dissenys RSM, les variables positives i significatives que afecten la producció de Taxol pel potent aïllat de fongs es van avaluar mitjançant el paquet de programari estadístic de Design-Expert 7.0 (Stat Ease Inc., Minneapolis, EUA). Cada experiment es va realitzar en tres rèpliques biològiques i es van considerar els valors mitjans. Després de la incubació a les condicions desitjades, es va filtrar la biomassa fúngica i es va extreure Taxol i es va quantificar per TLC i HPLC tal com es descriu anteriorment.
Placket-Disseny birmà
El disseny placket-Burman s'ha utilitzat freqüentment per a l'optimització del component medi per al creixement de fongs i la producció de metabòlits secundaris bioactius, avaluant les variables significatives que afecten la producció de Taxol [18, 20, 46). L'elecció del factor es va basar en els mitjans utilitzats en el cribratge qualitatiu i quantitatiu. S'han inclòs onze factors; L'extracte de malta, la peptona, la sacarosa, la soja, la glutamina, l'extracte de vedella i els valors i factors de temperatura, pH, temps d'incubació i velocitat d'agitació es van variar en dos nivells, i es van seleccionar els rangs de nivells mínims i màxims. Es va utilitzar l'estadístic Design-Expert 7.0 per generar un conjunt de 12 experiments. Per a cada experiment, es va determinar la producció de Taxol en tres rèpliques biològiques i es va considerar la mitjana del rendiment de Taxol.
L'anàlisi de regressió de les dades es va realitzar mitjançant un programari estadístic. L'efecte de cada variable es va calcular (Biometrika, 2020), mitjançant l'equació següent:
on, E és l'efecte d'una variable de prova, M més i M- són la concentració de taxol dels assaigs en què el paràmetre es trobava en els seus nivells més alt i inferior respectivament, i N és el nombre d'experiments que es van dur a terme. L'efecte de cada variable en la producció es va determinar calculant els seus respectius valors E.
On Tot alt és el total de respostes al nivell alt, Tot baix és el total de respostes al nivell baix i No és el nombre de proves.
Disseny central compost i interaccions entre factors que afecten la producció de taxols
Els factors positius més significatius que afecten la producció de Taxol per l'aïllat de fongs seleccionat es van optimitzar mitjançant un disseny experimental de model CCD de superfície de resposta [47]. Mitjançant l'ús de CCD, es van optimitzar les concentracions dels components del medi i es van utilitzar les seves interaccions estudiades per generar un total de 20 experiments per a les tres variables. Per determinar els nivells òptims de les variables per a la producció de Taxol a partir del potent aïllat de fongs, es van representar corbes de superfície de resposta tridimensionals (3D) per estudiar la interacció entre els diversos factors i per determinar la condició variable de cada factor que afecta la producció de Taxol. Els gràfics en 3D es van realitzar mantenint les constants de tres factors en un nivell ideal i representant la resposta obtinguda del rendiment de taxol per a diferents nivells dels altres dos factors.
Efecte de la irradiació gamma sobre el rendiment del taxol
Els potents aïllats endofítics que produeixen Taxol van ser exposats a irradiació amb 60font de cobalt (cèl·lula gamma 4000-A-Índia) a diferents dosis de radiació gamma (0,25-3,0 kGy) en comparació. al control del cultiu no irradiat; una taxa de dosi 1,2 kGy/h en el moment dels experiments. Els medis optimitzats van ser inoculats pel cultiu irradiat en condicions de cultiu estàndard, en comparació amb l'inòcul de l'espora no irradiada com a control. Els cultius es van incubar a 30 ± 2 graus durant 15 dies en un agitador rotatiu (120 rpm). Després de la incubació, es van filtrar els cultius i es va extreure Taxol, es va purificar i es va quantificar per TLC i HPLC tal com es descriu anteriorment.
Síntesi i Caracterització de Nanopartícules d'Or (AuNPs); Conjugació amb Taxol
Activitat anticancerígena de Taxol
L'activitat dels conjugats purificats de Taxol i Taxol-PVP-AuNPs contra el carcinoma hepàtic (HPG2) i el carcinoma de mama (MCF7) es va determinar per 3- (4,5-dimetiltiazol- 2-il) -2,5-assaig de bromur de difenil tetrazoli (MTT) [48]. La placa 96-pou es va sembrar amb 103 cèl·lules per pou i es va incubar durant la nit a 37 graus, després es van afegir diferents concentracions del fàrmac i les plaques es van tornar a incubar durant 48 h. Es va afegir el reactiu MTT (25 ul) i es va incubar durant 2 h i es va mesurar el color morat del complex de formazan desenvolupat a λ570 nm. El valor IC50 es va expressar per la quantitat de fàrmac que redueix el creixement del 50 per cent d'un nombre inicial de cèl·lules tumorals que es normalitzen al control positiu.
Activitat antimicrobiana dels conjugats Taxol i Taxol-AuNPs
Es va avaluar l'activitat antimicrobiana dels conjugats Taxol i Taxol-AuNPs contra diferents aïllats bacterians; Bacillus subtilis ATCC 6633 i Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli i Enterobacter agglomerans, a més de Candida albicans. Les cèl·lules bacterianes provades es van suspendre en aigua de peptona estèril per obtenir un inòcul estàndard de ~0,5 McFarland (1–1,5) × 1{{10}}8 CFU/ml a λ6{{18 }}0 nm. La inhibició del creixement (mm) del creixement dels patògens microbians es va avaluar mitjançant el mètode de difusió del disc d'agar. Es van utilitzar discos antibiòtics estàndard estèrils amb un diàmetre de 6,0 mm com a controls positius. Els discos antibiòtics estèrils (6, 0 mm) es van carregar amb 20 ul de metanol i àcid amoxicil·lina-clavulànic (AMC) com a control negatiu i positiu. Els discos es van carregar amb la mateixa concentració de Taxol, Taxol-PVP-AuNPs i AuNPs (1, 0 ug/ml). Es van preparar tres rèpliques biològiques. Les plaques es van incubar a 37 graus durant 24 h i es van mesurar les zones d'inhibició. L'àcid clavulànic amoxicil·lina (AMC) i la nistatina es van utilitzar per normalitzar l'activitat antimicrobiana de Taxol. La zona d'inhibició del creixement es va determinar mitjançant un calibre vernier (mm).
Anàlisis estadístics
Diferència menys significativa de Fisher de la prova post hoc.
Deposició de fongs
Resultats
Aïllament de fongs endofítics de jojoba; Projecció de Taxol Production
Es van recuperar vint-i-quatre aïllats de fongs endofítics de les escorces, branques, fulles i brots de jojoba carregats al medi PDA, CZD i ME. Aquests aïllats de fongs es van derivar d'escorces (6 aïllats), branquetes (7 aïllats), fulles (4 aïllats) i cabdells (7 aïllats), tal com es registra a la taula 1. Aquests aïllats de fongs es van identificar inicialment al seu nivell d'espècie en funció de la seva morfologia. característiques segons les claus universals, pertanyents a tres gèneres, a saber, Aspergillus, Penicillium i Fusarium. Entre aquests aïllats, es va informar que la prevalença del gènere Aspergillus era (83,4 per cent), mentre que Fusarium i Penicillium estaven representades en un 8,3 per cent. El gènere Aspergillus estava representat per cinc espècies, és a dir, A. favus (3 aïllats), Aspergillus oryzae (5 aïllats), A. niger (5 aïllats), A. fumigatus (4 aïllats) i A. terreus (3 aïllats). La productivitat de Taxol pels aïllats de fongs recuperats es va avaluar creixent en PDB, incubació en les condicions estàndard, extracció i quantificació de Taxol per TLC i HPLC (Fig. 1). A partir dels resultats, la productivitat màxima de Taxol va ser informada per A. favus Bd1 (88,65 µg/l), seguit de P. polonicum Br1 (54,42 µg/l), A. niger Lv1 (43,95 µg/l), A. oryzae Bd1 (38,87 µg/l), F. oxysporum Tw1 (26,80 µg/l), A. niger Lv2 (23,{01 µg/l) i A. fumigatus Bd2 (17,62 µg/l) l). La identitat química estructural de Taxol dels productors de fongs més alts es va revelar a partir dels seus espectres UV-Vis, en comparació amb l'espectral químic de l'autèntic Taxol. A més, s'ha validat l'estructura química del Taxol extret dels quatre aïllats fun gal més potents mitjançant anàlisis FT-IR (Fig. 1). Notablement, el Taxol extret dels potents aïllats de fongs mostrava el mateix paradigma espectral del Taxol autèntic. Es va assignar el pic a 3393,3 cm−1 per a l'hidroxil (OH). Mentre que els pics a 2923,5 es van assignar a l'estirament CH alifàtic, els pics a 1661.0 cm−1 corresponen a la freqüència d'estirament C{=O. El pic observat a 1452,0–1404,0 cm−1 es va deure a la freqüència d'estirament de NH. La freqüència d'estirament del grup carbonil-oxigen es va observar a 1109 cm−1. Els pics observats en el rang 1020–979,7 cm−1 es van deure a la presència de corbes aromàtiques C i H. A partir de les anàlisis cromatogràfiques i espectrals, es podria concloure que el Taxol extret és idèntic a l'autèntic. Aparentment, l'activitat metabòlica de la mateixa espècie de fongs va fluctuar molt amb les diferents plantes, assegurant la interacció biològica única i l'alliberament de senyals específics de la part de la planta per desencadenar l'expressió del sistema de maquinària de biosíntesi de Taxol. Curiosament, la fluctuació del sistema metabòlic no només depèn de les parts de la planta sinó també de la interacció aïllat-aïllat, per exemple, el rendiment de Taxol dels aïllats d'A. niger que habiten les fulles de jojoba va ser de 43,9 µg/l, mentre que el rendiment de El taxol va ser zero per a l'aïllat d'A. niger recuperat de l'escorça de la planta.
Identificació Morfològica i Molecular dels Potents Productors de Taxol
Les característiques morfològiques del potent aïllat fúngic productor de Taxol es van examinar segons les claus descriptives macroscòpiques i microscòpiques, tal com es descriu a Materials i mètodes, i van revelar la seva proximitat morfològica amb A. favus (Fig. 2). L'aïllat de fongs es va cultivar a PDA a 30 graus durant 10 dies i les característiques macroscòpiques i microscòpiques van revelar la seva identitat com ara caps conidials, mode de ramificació, identitat de l'estigma i ontologia conidial i formació de cossos fructífers, segons l'universal. claus morfològiques [33], i es va trobar que eren idèntiques a Aspergillus favus. El potent aïllat productor de Taxol A. favus es va identificar més a partir de les seves seqüències ITS, utilitzant gDNA com a plantilla. Els amplicons de PCR (~ 550 pb) d'A. favus es van resoldre, es van purificar i es van seqüenciar (Fig. 2). La seqüència ITS d'A. favus es va cercar amb explosió no redundant a la base de dades NCBI, mostrant un 99 per cent de similitud amb A. favus, amb zero valors d'E. i una cobertura de consultes del 95 per cent. Així, a partir de les anàlisis microscòpiques i moleculars, l'aïllat objectiu es va confirmar com A. favus i es va dipositar a GenBank amb el número d'adhesió MW485934.1, així com, l'aïllat s'ha dipositat al Centre Micològic de la Universitat d'Assiut (AUMC), Egipte amb un número de deposició AUMC13892. L'aïllat actual tenia un 99 per cent de similitud amb els aïllats d'A. favus MW485934, MT446145, KJ863514, MW522551,
Fig. 1 Vista morfològica d'una planta de jojoba. B Cultius en placa dels potents fongs endofítics productors de taxols; A. favus Bd1 (13), A. niger Lv1 (21), Penicillium polonium (23) i A. oryzae Bd (25) a PDA després de 8 dies d'incubació a 30 graus. Els aïllats de fongs es van cultivar a PDB i es van incubar en les condicions estàndard i es va extreure Taxol i es va comprovar per TLC (C). Cromatograma HPLC D de Taxol a partir dels potents aïllats de fongs. E Rendiment de taxol quantificat per HPLC. F, anàlisi espectral UV-Vis del taxol extret dels aïllats de fongs. Anàlisi G FT-IR del Taxol extret en comparació amb l'autèntic
Fig. 2 A Característiques macromorfològiques d'A. favus, un endòfit de jojoba després de 3, 5 i 8 dies de creixement a PDA. Característiques micromorfològiques, cap conidial d'A. favus amb augment de 400X. Amplicó C PCR de la regió ITS d'A. favus de 500 pb, normalitzant-se a una escala d'1 kb (núm. cat. SM0312). D Anàlisi filogenètica d'ITS A. favus pel mètode de màxima probabilitat [44]
