Producció de lipasa per Yarrowia Lipolytica en fermentació en estat sòlid utilitzant subproductes de fruites d'Amazones i farina de soja com a substrat part 1
Jun 30, 2023
Resum: La producció d'àcids grassos poliinsaturats a partir d'oli de peix, que està relacionada amb diversos beneficis per a la salut, com ara efectes contra malalties cardiovasculars, efectes antihipertensius, anticancerígens, antioxidants, antidepressius, antienvelliment i antiartritis, entre d'altres, es pot dur a terme de manera avantatjosa mitjançant l'aplicació de la lipasa. Tanmateix, l'alt cost associat a la producció d'enzims pot fer que el procés sigui inviable i, per tant, s'han d'investigar substrats alternatius per resoldre aquests problemes. Aquesta investigació tenia com a objectiu produir lipasa per Yarrowia lipolytica IMUFRJ50682 en fermentació en estat sòlid utilitzant subproductes de la indústria de processament d'aliments (pastís d'oli d'andiroba i farina de soja) i verificar la possible aplicació en la hidròlisi inicial de l'oli de peix. per produir més àcids grassos poliinsaturats en un procés adequat. Es va realitzar un cribratge per a l'anàlisi de combinacions de pastís d'oli d'andiroba i farina de soja en diferents proporcions (0:1{{{20}}0 a 100:0, respectivament) a les 48 h del procés de fermentació. Després, la matriu sòlida composta per farina de soja i pastís d'oli d'andiroba es va complementar amb oli de soja i Tween 80 per millorar l'activitat de la lipasa. L'extracte enzimàtic es va caracteritzar pel perfil proteic mitjançant electroforesi. Finalment, es va aplicar l'extracte enzimàtic i el biocatalitzador sòlid produït per avaluar la hidròlisi potencial de l'oli de peix en un estudi inicial. La màxima activitat lipolítica (63,7 U·g -1 ) es va aconseguir mitjançant pastís d'oli d'andiroba i farina de soja (50:50) després de 24 h de fermentació. L'oli de soja l'1,5 per cent i el Tween 80 (0,001 per cent) en una emulsió van proporcionar un augment d'1,5- vegades (82,52 U·g -1 ) en l'activitat enzimàtica. L'anàlisi electroforètica va demostrar una banda entre 37 i 40 kDa que pot estar relacionada amb la lipasa i una banda de 75 kDa referida a la subunitat de la -conglicinina present a la farina de soja. Després de 48 h, el biocatalitzador sòlid va mostrar un grau d'hidròlisi (DH) més alt (71,0 per cent) que l'extracte enzimàtic (61,5 per cent). El biocatalitzador sòlid va ser estable durant l'emmagatzematge a temperatura ambient durant 7 mesos. La producció de lipases utilitzant subproductes de fruites d'Amazones i farina de soja en la fermentació en estat sòlid és viable, així com l'aplicació de l'extracte i el biocatalitzador sòlid en l'aplicació inicial per a la hidròlisi d'oli de peix per produir més àcids grassos poliinsaturats de manera industrial. procés adequat.
El glicòsid de cistanche també pot augmentar l'activitat de la SOD en els teixits del cor i del fetge, i reduir significativament el contingut de lipofuscina i MDA a cada teixit, eliminant eficaçment diversos radicals reactius d'oxigen (OH-, H₂O₂, etc.) i protegint contra els danys de l'ADN causats. per radicals OH. Els glucòsids feniletanoides de Cistanche tenen una forta capacitat d'eliminació dels radicals lliures, una capacitat reductora superior a la de la vitamina C, milloren l'activitat de SOD en la suspensió d'esperma, redueixen el contingut de MDA i tenen un cert efecte protector sobre la funció de la membrana espermàtica. Els polisacàrids de Cistanche poden millorar l'activitat de SOD i GSH-Px en eritròcits i teixits pulmonars de ratolins senescents experimentalment causats per D-galactosa, així com reduir el contingut de MDA i col·lagen al pulmó i el plasma, i augmentar el contingut d'elastina. un bon efecte d'eliminació de DPPH, allarga el temps d'hipòxia en ratolins senescents, millora l'activitat de SOD al sèrum i retarda la degeneració fisiològica del pulmó en ratolins senescents experimentalment Amb la degeneració morfològica cel·lular, els experiments han demostrat que Cistanche té la bona capacitat antioxidant. i té el potencial de ser un fàrmac per prevenir i tractar malalties de l'envelliment de la pell. Al mateix temps, l'echinacòsid a Cistanche té una capacitat significativa per eliminar els radicals lliures DPPH i pot eliminar espècies reactives d'oxigen, prevenir la degradació del col·lagen induïda pels radicals lliures i també té un bon efecte reparador sobre el dany dels anions dels radicals lliures de timina.
Feu clic a Suplement de Cistanche Tubulosa
【Per a més informació:george.deng@wecistanche.com/WhatApp:86 13632399501】
Paraules clau: Carapa guianensis Aublet; producció de lipasa; fermentació en estat sòlid; sostenibilitat; Yarrowia lipolytica
1. Introducció
Les fruites amazòniques tenen un alt potencial biotecnològic per a la investigació i aplicació en diversos sectors de l'economia com la farmacèutica i la indústria alimentària per la presència de macro i micronutrients com proteïnes, hidrats de carboni, fibres, carotenoides, àcids grassos poliinsaturats i vitamines, entre d'altres. [1].
L'andiroba (Carapa guianensis Aublet) és una planta amazònica que produeix fruits de llavors oleaginoses amb potencial comercial per a l'extracció d'oli amb propietats medicinals com a efecte analgèsic, antiedematogènic i antiinflamatori [2,3]. A més, presenta propietats tecnològiques interessants per a la indústria cosmètica perquè és ric en compostos emol·lients, sent subministrat com a input per a les indústries cosmètiques d'arreu del món [4]. El fruit d'andiroba és una càpsula que pesa entre 90 i 540 g i està composta per 1 a 16 llavors marrons, amb un pes d'entre 1 i 70 g. Per obtenir l'oli, les llavors es trenquen en trossos petits i s'assequen al forn fins que arriben al 8 per cent d'humitat. Després, es comprimeixen en premses de tipus expeller metàl·lic [5], produint-se l'oli d'andiroba que presenta un gran interès industrial i un alt valor comercial ja que aquest producte pot superar els 50 dòlars per litre, depenent de les seves característiques [6].
La producció anual d'andiroba és d'unes 122,16 tones [7] i la producció d'oli no superava el 30 per cent del pes de la fruita [8]. Aquestes xifres suposen que anualment es generen aproximadament 36.648 tones d'oli i 85.512 tones de pastís. El subproducte obtingut després de l'exploració d'aquests fruits encara pot contenir lípids (20 per cent), cendres (4,2 per cent), proteïnes (7,3 per cent), i hidrats de carboni (17 per cent), i per aquesta composició, el seu ús en processos biotecnològics. és interessant [9]. Una manera d'aplicar aquests subproductes és mitjançant la fermentació en estat sòlid (SSF) per produir compostos d'alt valor afegit com els enzims.
La fermentació en estat sòlid es porta a terme mitjançant una matriu sòlida en absència d'aigua lliure, però el sòlid ha de tenir prou humitat per al creixement microbià [10]. S'ha informat que l'ús de SSF produeix compostos aromàtics [11], antibiòtics [12], àcids orgànics [13], biopesticides [14], biosurfactants [15], enzims [16] i altres compostos. La producció d'enzims en SSF requereix l'ús de microorganismes com ara fongs i bacteris que creixen en condicions que s'utilitzen habitualment en SSF. Entre els microorganismes utilitzats biotecnològicament, destaca el llevat, especialment Yarrowia lipolytica, pel seu potencial per produir lipases [10].
Yarrowia lipolytica és un llevat no convencional que té una temperatura màxima de creixement de 32-34 ◦ C i no pot sobreviure en condicions anaeròbiques. Y. lipolytica està classificat com a generalment reconegut com a segur (GRAS) per la Food and Drug Administration (FDA) i això permet el seu ús segur en processos/productes alimentaris i farmacèutics [9]. Es reconeix que aquest llevat produeix lipases intracel·lulars, extracel·lulars i associades a la paret cel·lular. Yarrowia lipolytica pot produir lipases utilitzant una varietat de fonts de carboni, com ara olis, èsters metílics i àcids grassos [17]. Les característiques esmentades fan que Y. lipolytic sigui versàtil per a aplicacions biotecnològiques, especialment en la producció de lipases.
Les lipases (triacilglicerol acil hidrolases EC 3.1.1.3) són enzims que catalitzen la hidròlisi dels triglicèrids en àcids grassos lliures i glicerol en presència d'aigua [18]. Les lipases es poden aplicar en molts sectors, inclòs la indústria alimentària, entre d'altres. S'ha informat de l'ús de lipases en la hidròlisi de la llet, greix i maduració de formatges, en la modificació de greixos de mantega, en la millora de l'aroma de begudes i fleca, en l'amaniment d'aliments i en el desenvolupament del sabor de la carn i el peix. [19]. A més, les lipases ja s'han aplicat a la hidròlisi del petroli a la concentració d'àcids grassos poliinsaturats que es poden utilitzar en la indústria alimentària com a suplement enriquit [20].
Diversos estudis han informat de l'ús de residus i subproductes en la producció de lipasa, entre ells closques de soja, closques de síndria, farina de llavors de cotó, farina de soja i pastís d'oli d'andiroba [9,21–26]. Tanmateix, encara no s'ha informat de la combinació de pastís d'oli d'andiroba i farina de soja en diferents proporcions per a la producció de lipasa per part de Yarrowia lipolytica. Aquesta investigació tenia com a objectiu produir lipasa de Yarrowia lipolytica mitjançant fermentació en estat sòlid (SSF) utilitzant subproductes de la indústria de processament d'aliments (pastís d'oli d'andiroba i farina de soja) per aplicar-los en la hidròlisi de l'oli de peix per produir més àcids grassos poliinsaturats.
2. Resultats i discussió
L'estratègia adoptada per produir lipasa per Yarrowia lipolytica en SSF utilitzant la combinació de pastís d'oli d'andiroba i farina de soja en diferents proporcions es va basar segons el diagrama de flux que es mostra a la figura 1.
2.1. Caracterització de subproductes agroindustrials
La composició física i química del pastís d'oli d'andiroba es mostra a la taula 1. El pastís d'oli d'andiroba presentava el 13,7 per cent de proteïnes, el 26,9 per cent d'extracte d'èter, el 0,4 per cent d'hidrats de carboni i el 45,6 per cent de fibres insolubles. D'altra banda, la farina de soja presentava un 48,3 per cent de proteïnes, un 2,4 per cent d'extracte d'èter, un 14,0 per cent d'hidrats de carboni i un 18,0 per cent de fibres insolubles. Cada nutrient present al pastís té un paper en el metabolisme microbià. El contingut de nitrogen és essencial per a la síntesi de proteïnes, nucleòtids i metabòlits secundaris per al creixement i metabolisme dels microorganismes, així com per a la biosíntesi d'enzims [25]. El contingut d'oli residual (extracte d'èter) present al pastís d'oli d'andiroba actua com a font de carboni, participant en la formació de biomassa i la producció d'energia per a la realització de la funció cel·lular [26]. A més, l'oli present al pastís d'andiroba és un substrat hidròfob i pot actuar com a inductor en la producció de lipasa, tal com informen Brígida et al. [17]. Inicialment, la lipasa unida a la cèl·lula del microorganisme hidrolitza el lípid present al medi i inicia el creixement cel·lular. Al llarg del procés, la disponibilitat de substrat disminueix, de manera que l'organisme secreta lipases extracel·lulars [27].
La cendra quantificada en el pastís d'oli d'andiroba (4,5 per cent) i farina de soja (6,3 per cent) representa el contingut de diversos minerals i es pot utilitzar en el metabolisme del microorganisme; tanmateix, alguns minerals com els ions de sodi i manganès poden inhibir el creixement de Yarrowia lipolytica [17] i, per tant, és necessari avaluar adequadament els subproductes.
Els continguts de carbohidrats i fibra de les matèries primeres es poden utilitzar en la nutrició microbiana de manera limitada, ja que Yarrowia lipolytica no produeix amilases ni cel·lulases i hemicel·lulases [28,29], cosa que dificulta la descomposició d'aquests polisacàrids i l'alliberament de compostos rics en carboni. s'utilitza en el metabolisme del llevat. Per tant, es suggereix que el creixement del llevat es deu principalment a la presència dels substrats hidrofòbics al pastís.
Els valors de porositat del pastís d'oli d'andiroba i de la farina de soja es mostren a la taula 1. Segons la taula 1, la porositat del pastís d'andiroba i la farina de soja eren de 0,425 i 0,412 m3 aire m−3 llit, respectivament. Els valors de porositat més alts s'associen amb una millora de la massa i la transferència de calor durant la fermentació, donant lloc a una millor producció d'enzims. A més, la porositat és un paràmetre important per entendre la humitat del medi: els valors elevats d'humitat poden estar associats a valors de porositat baixos, i això afecta l'aireació del medi i, en conseqüència, la producció de lipasa [22].
2.2. Producció de lipasa per SSF
L'ús de subproductes per a la producció de lipasa per fermentació en estat sòlid i la producció de biocatalitzadors sòlids estables permet l'aplicació de l'enzim directament en el medi de reacció, reduint els costos associats a l'extracció i purificació de l'enzim per a la seva aplicació posterior. A més, l'ús de subproductes proporciona nutrients per al creixement i desenvolupament microbians, actua com a suport físic per al microorganisme i redueix els costos del medi de cultiu al procés. A més, la fermentació en estat sòlid permet l'ús de residus i subproductes agroindustrials, sent una alternativa per reduir els problemes ambientals associats a una eliminació inadequada de residus [30].
Després de la caracterització, els subproductes es van utilitzar com a substrat de matriu sòlida en la producció de lipasa mitjançant SSF, controlant-se les activitats lipolíticas i proteolítices, la humitat i el pH durant el procés de fermentació. La figura 2 mostra els perfils de la variable de resposta mesurada durant 48 h de fermentació utilitzant Y. lipolytica i la combinació de pastís d'oli d'andiroba i farina de soja en diferents proporcions com a substrats.
Pel que fa a l'ús dels substrats individualment, es va trobar l'activitat lipolítica màxima de 4,36 U·g -1 per a farina de soja (0:100; Figura 2A) i 13,48 U·g -1 per a pastís d'oli d'andiroba (100:0; Figura 2B), després de 12 i 24 h, respectivament. Després d'arribar al punt de major activitat lipasa, es va observar una reducció dels seus valors, que pot estar relacionada amb l'augment de l'activitat de la proteasa. Aquest enzim té afinitat per les estructures proteiques i, per això, pot actuar per degradar l'estructura de la lipasa, reduint la seva activitat [24,31,32].
El pastís Andiroba i la farina de soja utilitzats en diferents proporcions de (25:75), (50:50) i (75:25) van produir els valors màxims d'activitat de la lipasa de 57,21 U·g -1 després de 12 h (Figura 2C), 63,70 U·g -1 (Figura 2D) i 40,13 U·g -1 (Figura 2E) després de 24 h de fermentació, respectivament, cosa que indica que la barreja de les matrius pot millorar l'activitat de la lipasa. La millora de l'activitat enzimàtica després d'una combinació de pastís d'oli d'andiroba i farina de soja es pot explicar observant les composicions fisicoquímiques d'ambdues matèries primeres, tal com es mostra a la Taula 1. La farina de soja té un alt contingut de proteïnes mentre que el pastís d'oli d'andiroba té un contingut d'oli més alt. . Així, la barreja d'oli d'andiroba i farina de soja per a la producció de lipasa va resultar més interessant que utilitzar cadascuna per separat, i això afavoreix la no dependència d'un sol substrat així com l'ús de més d'un subproducte.
El pH inicial de les matrius és àcid per la presència d'àcids grassos lliures presents a la matriu oleaginosa, i aquesta condició afavoreix el creixement de Yarrowia lipolytica ja que aquest llevat necessita un medi lleugerament àcid per a un bon creixement [33], evitant un pas de tampó mitjà. També hi ha un augment gradual del pH al llarg del procés a les matrius que van de 6,39 a 7,32 (figura 2A), 5,69 a 6,82 (figura 2C), 5,64 a 7,68 (figura 2D) i 5,21 a 6,03 (figura 2E). A la matriu que només conté pastís d'oli d'andiroba, es va observar una disminució gradual del pH (4,8 a 4,26, figura 2B) a causa del contingut d'oli residual en el medi sòlid, ja que l'oli és hidrolitzat inicialment per la lipasa, sense ser consumit pel llevat en les primeres hores, mantenint així un pH lleugerament àcid.
Pel que fa al contingut d'humitat, no es van observar variacions al llarg de la fermentació, demostrant que el sistema d'incubació amb humitat saturada i les matrius era eficaç per retenir la humitat. Un medi de fermentació capaç de mantenir un contingut d'humitat òptim és essencial per a la producció de lipasa per Yarrowia lipolytica [24] ja que aquest paràmetre pot afectar l'aireació del sistema. A més, es requereix el contingut d'humitat ideal per proporcionar l'aigua necessària per al metabolisme del microorganisme i per solubilitzar els nutrients. Quan el contingut d'humitat és superior a l'ideal, es pot produir una mala difusió d'oxigen al sistema, quedant fora del rang ideal per al microorganisme [34].
Alguns estudis han informat de l'ús de subproductes com a substrats en la fermentació en estat sòlid. Tanmateix, en aquests estudis, hi ha una incorporació de fonts de carboni i/o nitrogen purs com ara glucosa, extracte de llevat, peptona i urea [35–37] en quantitats que poden augmentar els costos del procés. La matriu ideal ha de presentar unes característiques per a l'aplicació que inclou actuar com a suport, aportant els nutrients necessaris per al creixement del microorganisme, i la secreció del producte biotecnològic d'interès. Trobar totes aquestes característiques en un subproducte pot ser ardu, fet que dificulta trobar un sistema adequat per a un procés de fermentació; així, la recerca de noves matèries primeres i la seva combinació ha de ser contínua [16].
Així, es va triar la proporció de 50:50 entre el pastís andiroba i la farina de soja per a proves posteriors. L'elecció d'aquesta condició està associada a la valorització de residus inexplorats de la regió amazònica.
2.3. Suplementació de la matriu de fermentació
A la segona part d'aquest treball, el pastís d'oli d'andiroba i la farina de soja en una proporció de 50:50 es van complementar amb un 1,5 per cent d'oli de soja, tal com es mostra a la figura 3. La suplementació es va dur a terme per verificar si la disponibilitat d'una font de carboni més fàcilment assimilable (oli de soja) va millorar la producció de lipasa pel que fa al contingut d'oli residual present al pastís d'oli d'andiroba. L'activitat de la lipasa màxima de 56,32 U·g -1 es va obtenir després de 28 h de fermentació i l'activitat de la proteasa va oscil·lar entre 2,71 i 7,60 U·g -1. El pH va oscil·lar entre 5,63 i 7,63 i la humitat es va mantenir sense grans fluctuacions durant tot el període (del 53 al 58 per cent). Com s'ha presentat anteriorment, l'activitat lipolítica obtinguda després de la suplementació va ser inferior al valor trobat sense suplementació. La suplementació de la matriu per a la producció de lipasa va ser estudiada per Farias et al. [38] i Souza et al. [24]. Els autors van trobar una activitat de lipasa de 139 U·g -1 i 93,9 U·g -1 utilitzant fangs i oli de soja, respectivament. Tanmateix, quan Souza et al. [24] van realitzar la fermentació utilitzant només farina de soja (sense suplements), els autors van trobar 9, 4 ± 0, 3 U · g -1 d'activitat de lipasa després de 10 h de fermentació, demostrant que la suplementació augmentava l'activitat de la lipasa a la matriu de fermentació estudiada.
Un altre component comunament informat per a la suplementació mitjana és Tween 80. Això s'informa constantment a la literatura, ja que aquest component pot augmentar l'activitat de la lipasa quan s'utilitza en fermentació submergida [39], però no hi ha informes que utilitzin Tween 80 en fermentació en estat sòlid. Tween 80 pot augmentar la producció extracel·lular de lipasa durant el procés de fermentació a causa de la capacitat d'emulsificació del substrat i, per tant, millorar l'accessibilitat del substrat per al microorganisme, així com alterar la permeabilitat cel·lular [40]. Així, es va realitzar un estudi combinant oli de soja 1,5 (per cent p/v) i Tween 80 0,001 per cent (p/v) en una emulsió per complementar el medi sòlid de fermentació, tal com es mostra a la figura 4.
Sobre la suplementació amb Tween 80, es va comprovar que després de 14 h de fermentació, l'activitat lipolítica era de 57,6 U·g -1. El mateix valor s'obtenia prèviament només amb la suplementació d'oli de soja a les 28 h de fermentació, la qual cosa allarga el procés de fermentació i afecta la viabilitat. L'activitat lipolítica màxima després de 20 h de fermentació va ser de 82,52 U·g -1, un augment d'1,46-vegament respecte a la producció de lipasa utilitzant només oli de soja i una reducció de 8-h en el procés de temps.
Els llargs temps de fermentació augmenten el cost del procés, per la qual cosa és interessant la recerca d'un microorganisme binomi ideal, un medi que produeixi lipasa en un temps més curt (alta productivitat) i que utilitzi subproductes com a matrius. Diversos estudis de la literatura han informat de la producció de lipasa mitjançant SSF per aconseguir les condicions adequades i fer factible l'obtenció de lipases. Es va observar l'ús de diferents matèries primeres, com ara farina de soja, canola, pells de síndria i pastís d'oli de palma, amb activitats que van des de 9 a 127 U·g -1[9,22,24].
Sales, Castro, Ribeiro i Coelho [22] van estudiar la producció de lipasa per Y. lipolytica en fermentació en estat sòlid utilitzant farina de soja complementada amb pell de síndria (5 per cent) va obtenir una millora en l'activitat de la lipasa en un 31 per cent, valor corresponent a 75,22 U. ·g −1. Souza et al. [41] va produir lipasa a partir de Y. lipolytica mitjançant fermentació en estat sòlid per a la seva aplicació en la síntesi d'èsters comercials amb valor per a la indústria alimentària, i els resultats van mostrar que la millor condició de fermentació per produir el biocatalitzador era l'ús de farina de soja i oli de soja ( 3 per cent p/p). L'enzim produït en aquestes condicions va permetre la conversió de fins a 92,9 per sintetitzar els èsters útils d'alt valor afegit aplicats a la indústria alimentària.
A més de les altes activitats enzimàtiques obtingudes en el present treball, podem destacar els avantatges addicionals: (i) la possibilitat d'utilitzar subproductes amb baixa explotació, amb un atractiu de sostenibilitat per a la regió amazònica; (ii) la possibilitat d'una combinació de diferents subproductes, que permeti la complementació nutricional per al metabolisme microbià; (iii) la reducció de la pressió sobre components ja àmpliament utilitzats en la indústria de bioprocessos com la farina de soja; (iv) valorització econòmica de les regions productores de subproductes; (v) ampliació de les opcions de substrat per a la producció de lipases, i (vi) reducció dels costos d'explotació, entre altres avantatges.
2.4. PÀGINA SDS
L'extracte enzimàtic brut obtingut després de la fermentació mitjançant una matriu composta per pastís d'oli d'andiroba i farina de soja (50:50) sense suplementació es va analitzar en SDS-PAGE. L'anàlisi electroforètica va mostrar les bandes de proteïnes contingudes a l'extracte enzimàtic, tal com es presenta a la figura 5.
El carril 1 fa referència als marcadors proteics estàndard i el carril 2 és la mostra obtinguda de la combinació de pastís d'oli d'andiroba i farina de soja en la millor proporció estudiada (50:50). És possible visualitzar una banda al voltant de 37-40 kDa a l'extracte enzimàtic brut que pot estar relacionat amb la lipasa i/o esterasa produïda per Yarrowia lipolytica, tal com ha observat Souza et al. [41], que també pot ser la principal lipasa extracel·lular de Y. lipolytica (Lip2), que es va produir àmpliament en tots els nostres estudis. A més, s'informa que fins i tot per als enzims que estan associats principalment a la paret cel·lular (Lip7 i Lip8) de Y. lipolytica, s'ha observat la mateixa massa molecular (37-41 kDa) [42].
A més, segons els resultats publicats prèviament pel nostre grup de recerca, les mateixes bandes presentades aquí estaven relacionades amb l'activitat de l'esterasa i la lipasa del zimograma revelat per l'acetat de naftil com a substrat [41], cosa que ens va permetre correlacionar-les. Les bandes de 75 kDa es refereixen a la subunitat de la -conglicinina present a la farina de soja tal com van trobar Sales et al. [22] i Cheng et al. [43] en la fermentació de farina de soja.
【Per a més informació:george.deng@wecistanche.com/WhatApp:86 13632399501】
