L'hormona de creixement no hipòfisi local s'indueix amb l'envelliment i facilita el dany epitelial

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

RESUM

Els factors microambientals que modulen els danys DINA relacionats amb l'edat no estan clars. L'hormona del creixement no hipòfisi (np) s'indueix al còlon humà, a les cèl·lules del còlon humà no transformades i als fibroblasts, i als organoides intestinals 3-dimensionals amb danys a l'ADN associats a l'edat. La npGH autocrina/paracrina suprimeix p53 i atenua la resposta al dany de l'ADN (DDR) induint TRIM29 i reduint la fosforilació ATM, donant lloc a una reparació reduïda de l'ADN i a l'acumulació de danys a l'ADN. Els organoides cultivats fins a 4 mesos presenten marcadors d'envelliment, p16 i SA- -galactosidasa i una disminució de la longitud dels telòmers, així com una acumulació de danys a l'ADN, amb augment de npGH, p53 suprimit i DDR atenuat. La supressió de GH en organoides envellits augmenta p53 i disminueix el dany a l'ADN. Els ratolins WT presenten una acumulació de danys a l'ADN del còlon depenent de l'edat, mentre que en ratolins vells sense senyalització de GH del còlon, el dany a l'ADN es manté baix, amb p53 elevat. Com que la inducció de npGH associada a l'edat permet un microentorn pro-proliferatiu, l'abrogació de la senyalització de la npGH es podria orientar com a teràpia anti-envelliment impedint el dany a l'ADN i les patologies relacionades amb l'edat.

INTRODUCCIÓ

Les funcions biològiques disminueixen amb l'envelliment simultàniament amb l'augment de la malaltia relacionada amb l'edat.flavonoidesLes patologies relacionades amb l'edat estan motivades per danys acumulats a l'ADN i deficiències en la reparació de l'ADN que causen mutacions i aberracions cromosòmiques associades a l'edat. El dany persistent a l'ADN també pot bloquejar la proliferació cel·lular, donant lloc a senescència i apoptosi, impulsant així encara més el procés d'envelliment (Ou i Schumacher, 2018). El dany a l'ADN s'acumula amb l'edat en cèl·lules humanes i murines de tipus salvatge (WT), no transformades, com ho demostra l'augment de la variant de la histona fosforilada 2A (yH2AX), un marcador de trencaments d'ADN de doble cadena (DSB) (Sedelnikova et al., 2004) i danys a l'ADN no reparats (Dolle et al., 1997; Hasty et al., 2003; Lombard et al., 2005; Petr et al., 2020). La inestabilitat genòmica resultant de la reparació defectuosa del dany a l'ADN pot afavorir la transformació cel·lular (Negrini et al., 2010). El dany a l'ADN desencadena la fosforilació de gens mutats per atàxia-telangiectàsia (ATM), responsables de la reparació de trencaments d'ADN d'una sola cadena i DSB. L'ATM fosforila i estabilitza el supressor de tumors p53, assegurant així la reparació del dany a l'ADN facilitant diverses vies de reparació de l'ADN. Així, l'ATM té un paper clau en l'activació tant de la resposta al dany de l'ADN (DDR) com de la reparació de l'ADN (Ou i Schumacher, 2018).

Feu clic aquí per saber-ne més

L'expressió i l'activitat de l'ATM es deterioren amb l'edat (Feng et al..2007; Gutierrez-Martinez et al.,2018), probablement provocant una pèrdua funcional de p53 relacionada amb l'edat i provocant danys acumulats en l'ADN i inestabilitat cromosòmica (Simon et al, 2009) Les respostes .p53 a factors estressants com la radiació són més baixes en ratolins més grans (Feng et al., 2007) i en fibroblasts dèrmics humans derivats d'individus envellits (Goukassian et al., 2000). Així, els distintius de l'envelliment inclouen una disminució de l'activitat de la DDR i la supressió de p53 amb danys acumulats a l'ADN no reparat, tot permetent un entorn favorable per a la proliferació epitelial (Lopez-Otin et al., 2013).

Com que la secreció de l'hormona del creixement hipofisiària (GH) disminueix amb l'edat, la senyalització de GH alterada s'ha implicat en el procés d'envelliment (Ho i Hoffman, 1993). No obstant això, un conjunt d'evidències recolzen els efectes beneficiosos de l'atenuació de la GH sobre l'envelliment. , i models de malalties humanes (Brown-Borg et al., 1996; Junnila et al., 2013), els beneficis de la deficiència de GH provenen principalment d'observacions que afavoreixen factors secundaris que allargan la vida útil, inclosa la sensibilitat millorada a la insulina, la disminució de l'oxidació de proteïnes hepàtiques. , disminució de la incidència de càncer i disminució de la inflamació associada a l'edat (Aguiar-Oliveira i Bartke, 2019; Bartke, 2016; Junnila et al., 2013; Spadaro et al., 2016). La descendència de famílies d'estudi de Leiden amb longevitat familiar i mortalitat més baixa. que els controls compatibles amb el medi ambient tenen nivells de GH circulant integrat més baixos (van der Spoeletal., 2016), mentre que GHexcess disminueix la vida útil tal com es veu en pacients amb acromegàlia (Chesno-kova et al., 2019a; Melmed, 2020; Waters i Barclay, 200). 7) i en models murins transgènics que sobreexpressen GH (Bartke, 2003).usos de l'hesperidinaAlguns han suggerit una correlació negativa entre l'alçada i la longevitat en humans (He et al., 2014; Samaras and Storms, 1992) i en gossos (Greer et al., 2007). Hem plantejat la hipòtesi que els efectes adversos de la GH sobre l'envelliment poden, almenys en part, s'atribueix al dany acumulat a l'ADN (Ches-nokova i Melmed, 2020). En suport d'aquesta premissa, els limfòcits derivats de pacients amb acromegàlia presenten danys a l'ADN amb un augment d'aberracions cromosòmiques (Bayram et al, 2014), mentre que el dany a l'ADN no reparat s'acumula al fetge d'un model d'acromegàlia de peix zebra (Elbialy et al., 2018). Els alts nivells de GH circulant atenuen la reparació de l'ADN del còlon murí, provocant l'acumulació de danys a l'ADN, mentre que el dany a l'ADN s'atenua després de bloquejar el receptor de GH (GHR) a les cèl·lules del còlon humà i en ratolins amb senyalització GHR abrogada (Chesnokova et al., 2019a).

La GH no hipòfisi (np) sintetitzada localment als teixits perifèrics és idèntica a la GH1 endocrina produïda per la hipòfisi i actua a través de mecanismes autòcrins/paracrins mitjançant el GHR àmpliament expressat (Ballesteros et al., 2000) que reconeix tant lligands GH hipòfisi com npGH. Waters i Barclay, 2007; Waters et al, 2006).cistanche de l'imperi perdutCom que l'activació de DDR indueix npGH (Chesnokova et al., 2013), vam plantejar la hipòtesi que el dany acumulat a l'ADN del còlon associat a l'edat indueix l'expressió de npGH, que, al seu torn, limitaria encara més la reparació del dany a l'ADN.

Cistanche pot anti-envelliment

Utilitzant models humans in vitro i ex vivo que reflecteixen l'envelliment, mostrem aquí que s'indueix npGH i s'acumula danys a l'ADN en teixits humans envellits, com ho demostra l'augment de la fosforilació H2AX (yH2AX). A més, el dany a l'ADN del còlon augmenta significativament en els ratolins WT vells, mentre que el dany a l'ADN epitelial continua sent baix en els ratolins GHR--de l'edat sense senyalització de GH i en els ratolins GHR knockout específics del còlon (GHRcolKO).

La npGH local també es va induir en organoides intestinals 3-dimensionals (3D) envellits generats a partir de cèl·lules mare pluripotents humanes (iPSC) induïdes (Barrett et al, 2014; Chesnokova et al, 2019a). La npGH organoide, al seu torn, va suprimir p53 i va atenuar la reparació del dany a l'ADN.fracció de flavonoides purificada micronitzada 1000 mg utilitzaEls efectes de la npGH probablement eren paracrins, ja que es co-cultivaven fibroblasts que expressaven GH amb dispositius microfluídics Colon Intestine-Chip incrustats amb colonoides humans per suprimir p53/p21 i augmentar el dany a l'ADN. Per contra, la supressió de la GH en organoides envellits va evitar danys a l'ADN.

Així, mostrem que la npGH epitelial s'indueix fortament durant l'envelliment i que la npGH redueix la reparació de l'ADN i facilita l'acumulació de danys a l'ADN associat a l'edat. En general, els resultats suggereixen que la npGH epitelial local del còlon desencadena un canvi del camp de la mucosa, creant un entorn d'inestabilitat cromosòmica que és favorable per al desenvolupament neoplàstic en el teixit envellit.

És important destacar que, tot i que hi ha un ús inadequat generalitzat de la GH com a hormona "anti-envelliment" malgrat la manca d'impacte convincent en el procés d'envelliment (Blackman et al.,2002; Clemmons et al..2014; Lieut al.,2007; Melmed, 2019), els nostres resultats mostren que la senyalització local de GH contribueix al microambient dels teixits, afavorint el desenvolupament de patologies relacionades amb l'edat. La supressió de la senyalització local de npGH per limitar el dany advers a l'ADN epitelial pot oferir, per tant, un objectiu terapèutic per a l'envelliment anovulant. Els resultats d'aquests estudis informen un enfocament innovador per a l'extensió de la vida útil (és a dir, la supressió més que la inducció de la senyalització local de GH). RESULTATS

El dany a l'ADN del còlon humà i la npGH s'acumulen amb l'envelliment

Es va avaluar el dany de l'ADN associat a l'edat en mostres de teixit de parafina de còlon humà no tumorals derivades de cohorts de pacients que abasten 3 grups d'edat: joves (18-39 anys), de mitjana edat (40-60 anys) i d'edat ({18-39 anys). 61-88 anys). Quan es va puntuar per a yH2AX, 3 de les 11 mostres (27 per cent) de la cohort jove van mostrar danys a l'ADN, 8 de 16 (50 per cent) van mostrar danys a l'ADN a la mitjana edat i 8 de 18 (45 per cent) mostres d'edat van mostrar danys a l'ADN (figures). 1A-1C i 1J).

Com vam demostrar anteriorment que el dany a l'ADN indueix npGH (Chesnokova et al, 2013), vam intentar determinar si l'acumulació de danys a l'ADN depenent de l'edat estava associada amb l'expressió de GH en teixit de còlon no tumoral. Com que no s'expressa a les cèl·lules del còlon neuroendocrí (Chesnokova et al, 2016), vam excloure aquestes cèl·lules de l'anàlisi.

L'expressió epitelial de GH es va detectar en un 16 per cent -17 per cent de mostres de còlon normals derivades de cohorts de mitjana edat i edat (38 i 42 mostres, respectivament), però només en el 2 per cent de la cohort jove (37 mostres), mentre que el La puntuació d'expressió de GH va augmentar a la cohort de mitjana edat i va augmentar encara més a les mostres de la cohort d'edat (p<0.01) (figures="" 1d-1f="" and="" 1k).="" furthermore,="" colon="" mrna="" gh="" expression="" increased="" in="" both="" middle-aged="" (30%="" of="" 10="" samples)="" and="" aged="" (26%="" of="" 14="" samples)="" versus="" young="" cohort="" samples(17%="" of9=""><0.01 and=""><0.05, respectively)(figures="" 1g-1).="">oteflavonoideEn resum, aquests resultats apunten a l'acumulació de danys a l'ADN sense inducció al còlon envellit.

L'activació de DDR indueix npGHin local en el còlon humà i muri

A continuació, vam considerar si la DDR activada desencadena l'expressió local de npGH de còlon i vam tractar ratolins amb nutlin3 per estabilitzar p53 (Vassilev et al, 2004) i vam observar p53 de còlon induït o superior (Figura 2A). A més, en mostres d'adenocarcinoma de còlon derivats dels mateixos pacients abans i després de les teràpies perjudicials per a l'ADN (taula S1), vam observar una expressió de npGH epitelial de base pre-tractament modesta i un augment de l'expressió de npGH després de la teràpia a les 6 mostres de pacients estudiades (p<0.01) (figure="" 2b).="" enhanced="" gh="" expression="" was="" also="" observed="" in="" tumor-associated="" fibroblasts="" after="" dna="" damage(figure="" 2c),="" indicating="" that="" these="" findings="" are="" likely="" not="">

La DDR activa l'expressió de GH in vitro

Hem utilitzat l'etopósid inhibidor de la topoisomerasa Il per produir tant trencaments d'ADN d'una sola cadena com DSB (Walles et al, 1996) i per determinar si la DDR activa la GH in vitro. La npGH induïda per danys a l'ADN a les cèl·lules d'adenocarcinoma de còlon humà NCC, hNCF i HCT116 (figures 3A i S1A-S1C); en organo-ids, l'ARNm de GH i GH induït per etopósid (figures 3B i S1D), mentre que els nivells d'ARNm d'IGF1 i prolactina no van canviar (figura S1E). La fosforilació STAT5, un senyal de GH aigües avall (Waters, 2016), es va induir en tots els tipus de cèl·lules (figures 3A-3C i S1A-S1C). Per contra, l'abrogació de la npGH amb un petit ARN interferent de GH (siRNA) va impedir que l'etopòsid induís pSTAT5 (figures 3C i S1F), proporcionant evidències que la npGH de còlon induïda per danys a l'ADN és funcionalment activa. Les imatges de NCC tractades amb etopòsid durant 24 h van mostrar la coexpressió de GH i yH2AX en múltiples cèl·lules (figura 3D).

Les cèl·lules epitelials que pateixen danys a l'ADN segreguen GH Per determinar si la npGH intracel·lular induïda exerceix efectes autocrins/paracrins, es van avaluar els nivells de GH secretats al NCC i al medi de cultiu organoide després del tractament amb etopòsid. El medi recollit de l'ANCC a les 8 i 24 h després del tractament i dels organoides a les 4-48 h després del tractament va mostrar augments de GH dependents del temps després de l'activació de DDR (figura 3E). Com que l'NCC i els organoides expressen receptors de GH com ho fa el teixit del còlon humà (Chesnokova et al., 2016), aquests resultats suggereixen que la GH local induïda en resposta al dany de l'ADN pot sotmetre el teixit envellit a accions autocrines/paracrines.

La GH autòcrina/paracrina suprimeix la cèl·lula p53 del còlon humà

Com que la GH endocrina suprimeix la p53 del còlon murí (Chesnokova et al, 2016), vam determinar si la GH local exerceix efectes au-autocrins / paracrins similars a les cèl·lules epitelials del còlon humà. L'anàlisi de dues línies NCC separades derivades de dos pacients diferents després de la nucleofecció amb hGH o la infecció amb lentivirus que expressen GH (lenti-GH) (figures 4A, 4B i S2), així com els organoides que expressen de manera estable hGH (figura 4C) p53 i sobreexpressió concomitant. Les cèl·lules derivades d'organoids infectats amb lenti-GH o vector buit (lenti-V) polsat amb bromodeoxiuridina (BrdU) van mostrar una supressió de p53 seguida d'una incorporació de BrdU modesta però significativament augmentada, avaluada per la classificació de cèl·lules activades per fluorescència (FACS) (figura). S3A). Per contra, la supressió de la GH amb lentivirus que expressava una petita forquilla de pèl (GH) va provocar una disminució de la formació de colònies i la mida de la colònia a NCC (figures S3B i S3C), cosa que indica accions de npGH pro-literatura.

Efectes de la GH paracrina en el xip de l'intestí de còlon humà Per avaluar els efectes paracrins de la npGH sobre les cèl·lules epitelials de la mucosa intestinal, vam cocultivar UNCF infectat amb dispositius microfluídics de lenti-GH i Colon Intestine-Chip (Kasendra et al, 2020) sembrats amb un còlon saludable. cèl·lules epitelials derivades d'organoides durant 8 dies. La secreció local de GH de hNCF al medi es va confirmar mitjançant ELISA (338 ng/mL/1 × 10 graus de cèl·lules). 5-Etinil-2'-desoxiuridina (EdU) (20 μM) es va afegir el dia 7 , els xips es van arreglar 24 h després i es van tacar per EdU i H2AX i es van comptar els nuclis EdU més a les cèl·lules epitelials. Un conjunt separat de xips sembrat

amb cèl·lules epitelials es va utilitzar per avaluar p53/p21 mitjançant western blot. La proliferació de cèl·lules epitelials xip va augmentar (pàg<0.05), likely="" due="" to="" decreased="" p53="" and="" p21="" (figures="" 4d="" and="" 4e).="" moreover,="" dna="" damage="" accumulation="" was="" evident,="" with="" increased="" numbers="" of="" cells="" expressing="" γh2ax="" （p=""><0.01） （figure="">

La GH autocrina/paracrina suprimeix la DDR

L'activació de l'ATM amb danys a l'ADN fosforila H2AX, que marca els llocs d'ADN danyats per activar la DDR i promoure la reparació (Turinetto i Giachino, 2015). ATM també fosforila p53, millorant encara més la reparació de l'ADN (Blackford i Jackson 2017). Tant en hNCC com en organoides infectats amb pIRES2-ZsGreen1hGH o amb llentia-GH, la sobreexpressió de GH va suprimir la fosforilació d'ATM i DNA-proteïna quinasa (PK)cs, ambdues implicades en la reparació de l'ADN (Blackford i Jackson. 2017) i va disminuir la fosforilació d'una proteïna objectiu p53 (figures 5A-5C).

Tip60 histona acetilasa activa ATM (Jackson i Bartek, 2009) i està regulada negativament per TRIM29 (Sho et al., 2011; Sun et al, 2005). Vam observar que la sobreexpressió de GH en NCC i en organoides també va donar lloc a la inducció TRIM29, que al seu torn va suprimir Tip60 (figures 5A -5C). Es van observar resultats similars a la segona línia NCC 48 h després de la nucleofecció amb un plasmidi que expressava GH i als 6 dies després de la infecció amb lenti-GH (figures S4A i S4B).

La GH autòcrina/paracrina atenua la reparació de l'ADN

A continuació, vam mesurar els efectes sobre els mecanismes de reparació de DSB, específicament la unió d'extrems no homòlegs propensa a errors (NHEJ) (Jackson i Bartek, 2009) i la recombinació homòloga a prova d'errors (HR) (Beucher et al., 2009). ; Blackford i Jackson, 2017; Chapman et al., 2012). Hem nucleofectat NCC que expressava de manera estable cassets reporters NHEJ i HR amb plasmidis pcDNA3.1-GH1 humà (hGH1), vam induir DSB mitjançant la co-transfectació amb un plasmidi que codificava l'endonucleasa I-Excel i vam mesurar la unió dels reporters de reparació de DSB. L'eficiència de la transfecció es va controlar mitjançant la co-transfecció amb el plasmidi que codifica per DsRed (Seluanov et al, 2010). L'eficiència de NHEJ després de pcDNA3.1-La nucleofecció de hGH1 va ser de 0,77-0,83 i es va reduir a les 48 h (p<0.05)(figure5d), and="" hr,while="" low(0.05),="" consistent="" with="" other="" reports="" (chitnis="" et="" al,2014;gatei="" et="" al.,2011),showed="" consistently="" decreased="" efficiency="" by="" up="" to="" 38.7%±3.5%="" (n="4" independent=""><0.05) at="" 72="">

La GH autòcrina/paracrina augmenta el dany a l'ADN no reparat

Examinant si npGH augmenta el dany a l'ADN, vam observar que NCC i organoides transfectats de manera estable amb lenti-GH mostraven un augment del dany endògen no reparat a l'ADN mesurat per l'assaig Comet (p).< 0.05)="" (lee="" and="" paull,="" 2007)(figures="" 5e="" and="" 5f).="" levels="" of="" unrepaired="" dna="" were="" also="" markedly="" increased="" in="" a="" second="" ncc="" line="" in="" cells="" nucleofected="" with="" a="" plasmid="" expressing="" gh="" or="" infected="" with="" lenti-gh="" (figures="" s4c="" and="" s4d).="" overall,="" these="" results="" show="" that="" npgh="" is="" induced="" in="" response="" to="" dna="" damage="" and="" enhances="" dna="" damage="" accumulation="" by="" interfering="" with="" both="" ddr="" and="" dna="" repair="">

La GH s'indueix en organoides intestinals humans 3D envellits i atenua la DDR

Després de l'augment observat de l'expressió de GH i del dany a l'ADN en exemplars de còlon humà envellits, vam "envellir" orgànics generats a partir de tres línies iPSC independents per recapitular un model de teixit humà envellit. Aquests organoides es compon d'enteròcits, cèl·lules caliciformes, cèl·lules de Paneth i cèl·lules enteroendocrines i expressen homeobox de tipus caudal 2 (CDX2) (Barrett et al..2014; Gao et al.,2009; Workman et al.,2017). Dues de les tres línies iPSC (línies 1 i 3) es van obtenir d'individus majors de 60 anys, i la tercera línia iPSC (línia 2) es va derivar de fibroblasts d'un individu de 30-anys. Els organoides generats a partir de les línies 1 i 3 es van cultivar fins a 2 mesos, moment en què la proliferació cel·lular es va alentir significativament. Per contra, els organoides generats a partir de la línia 2 van proliferar de manera robusta en cultiu fins a 4 mesos. L'envelliment cel·lular es va confirmar a les 3 línies per l'augment de p16, així com per la disminució de la longitud dels telòmers (p<0.05)(figures 6a="" and="" 6b).="" in="" aged="" organoids,="" we="" also="" found="" increased="" senescence-associated="" β-galactosidase="" (sa-β-galactosidase)="" activity,="" which="" has="" been="" shown="" to="" increase="" with="" age="" (kurz="" et="" al.,="" 2000;="" lee="" et="" al.,="" 2006),="" as="" well="" as="" increased="" β-galactosidase="" protein="" expression,="" which="" correlates="" with="" sa-β-galactosidase="" enzymatic="" activity(figures="" 6a="" and="">

Com que aquestes característiques organoides in vitro semblen recapitular fidelment els canvis cel·lulars consistents amb l'envelliment del teixit humà (Baker et al.,2011;Lieut al.,2019; Lopez-Otin et al.,2013), hem utilitzat això. model per estudiar més els mecanismes de senyalització subjacents a l'envelliment epitelial del còlon humà. A la línia 1, els nivells d'ARNm de GH es van induir després d'1 mes en cultiu i van augmentar encara més després de 2 mesos (p <0, 05)="" (figura="" 6c),="" cosa="" que="" és="" coherent="" amb="" un="" augment="" significatiu="" de="" npgh="" observat="" en="" organoides="" envellits="" tant="" en="" western="" blot="" com="" en="" immunohistoquímica="" (ihc)="" (figures="" 6d,="" 6e="" i="" s5b).="" yh2ax="" també="" es="" va="" induir="" fortament="" amb="" un="" cultiu="" prolongat,="" cosa="" que="" indica="" un="" dany="" en="" l'adn="" endògen="" acumulat="" amb="" l'envelliment="" in="" vitro.="" d'acord="" amb="" els="" resultats="" que="" mostren="" p53="" suprimit="" en="" ncc="" i="" organoides="" transfectats="" amb="" gh="" (figures="" 4a-4c),="" vam="" observar="" p53="" suprimit="" a="" 1="" i="" 2="" mesos="" de="" cultiu,="" d'acord="" amb="" l'augment="" de="" npgh="" (figures="" 6e="" i="" s5b).="" resultats="" similars="" (="" a="" i="" b)="" western="" blot="" de="" cèl·lules="" (a)="" ancc,="" hncf="" i="" hct116="" i="" organoides="" (b).="" les="" cèl·lules="" es="" van="" tractar="" amb="" les="" dosis="" indicades="" d'etopòsid="" i="" es="" van="" analitzar="" 24="" hores="" després.="" els="" organoides="" es="" van="" tractar="" amb="" etopòsid="" 3="" um="">

( C ) El NCC nucleofectat amb GH siRNA (siGH RNA) o scramble RNA (Scr RNA) com a control durant 24 h es va tractar amb les dosis indicades d'etopòsid (Etop) i es va analitzar 24 h després. La quantificació d'ImageJ de taques occidentals es mostra a la figura S1.

（D） Imatge representativa de NCC tractat amb 20 μM d'etopòsid durant 24 h. GH, vermell; yH2AX, verd; fal·loidina, grisa; DAPI, blau. Un nucli verd brillant indica apoptosi. Barra d'escala, 20 um. Cèl·lules control, no tractades.

(E) Western blot de GH en el medi de cultiu d'ANCC i organoides tractats amb 20 o 5 uM d'etopòsid, respectivament. El medi es va recollir de la calor 8 i 24 h i dels organoides a les 4-48 h després del tractament. Ponceau es va utilitzar com a control de càrrega. Es mostren taques representatives d'almenys 3 experiments independents.

es van obtenir cultivant organoides generats a partir de les línies iPSC 2 i 3 durant 4 i 2 mesos, respectivament (figures S6A-S6D).

A més, l'augment de npGH en organoides envellits es va associar amb una DDR atenuada, amb una fosforilació suprimida tant d'ATM com d'ADN-PKcs i nivells més baixos de p53 fosforilat (figures 6E i S5B). Aquests resultats suggereixen que la supressió de l'activitat de DDR condueix a danys acumulats a l'ADN no reparat, com també s'evidencia per la inducció de yH2AX (figures 6E i S5B). Després de 2 mesos en cultiu, els organoides envellits infectats amb GH shRNA van mostrar un augment de p53 (figures 6F i S7A) i una disminució del dany a l'ADN mesurat per l'assaig Comet (p<0.01)(figure 6g),="" indicating="" a="" requirement="" for="" npgh="" in="" age-related="" dna="" damage="" accumulation="" in="" this="">

La deficiència de senyalització de GH atenua el dany a l'ADN del còlon in vivo en ratolins envellits

Per confirmar els nostres resultats obtinguts en organoides envellits, vam estudiar ratolins vells WT i GHR-7 in vivo. El dany de l'ADN del còlon va augmentar significativament en els ratolins WT vells (24-mes) en comparació amb els joves (3-mes) (p<0.01), but,="" strikingly,="" was="" not="" increased="" in="" aged="" ghr-mice="" (figures="" 7a="" and="" s7b),="" likely="" due="" to="" p53="" in-duction.="" we="" also="" generated="" transgenic="" mice="" with="" colon-specific="" ghr="" excision="" (car1-cre/ghr"loxmox,="" ghrcolko)(figure="" s7d).="" control="" mice="" were="" derived="" from="" the="" same="" breeding,="" but="" they="" did="" not="" harbor="" the="" cre="" enzyme.="" colon="" dna="" damage="" was="" much="" reduced="" in="" 20-month-old="" male="" ghrcolko="" mice="" with="" ghr="" excision="" compared="" to="" control="" mice,="" but="" not="" in="" the="" small="" intestine="" with="" intact="" ghr(figure="" 7d).="" thus,="" it="" appears="" that="" dna="" is="" repaired="" more="" efficiently="" in="" mice="" devoid="" of="" gh="" signaling,="" likely="" due="" to="" the="" higher="" colon="" p53="" expression="" we="" observed="" in="" both="" ghr-/-and="" in="" ghrcolko="" animals(figures="" 7b,7c,="" 7e,="" s7c,="" and="" s7e).="" these="" in="" vivo="" results="" buttress="" our="" hypothesis="" that="" npgh="" en-hances="" age-associated="" colon="" dna="" damage="">

DISCUSSIÓ

Mostrem aquí que la npGH augmenta amb l'edat en el teixit del còlon humà i en els organoides intestinals humans en 3D. Demostrem diverses línies d'evidència que suggereixen que en el teixit de còlon humà envellit, la npGH és induïda per danys a l'ADN, tal com s'observa en models humans, incloses cèl·lules epitelials no tumorals, fibroblasts normals de còlon, organoides i teixit de càncer de còlon de pacients sotmesos a teràpies perjudicials per a l'ADN. ; també mostrem troballes similars in vivo en els còlons de ratolins amb DDR activat.

Utilitzant organoides intestinals humans en 3D, vam observar un augment de p16, senescència i escurçament dels telòmers, tot coherent amb els canvis associats a l'edat en el teixit humà (Baker et al., 2011; Liu et al., 2019; Lopez-Otin et al., 2013). ). Malgrat les limitacions del model d'organoides, els nostres resultats donen suport als organoides intestinals com una recapitulació humana fidel per estudiar els mecanismes de senyalització subjacents als canvis de còlon associats a l'edat (Hu et al., 2018).

Vam trobar que la npGH local, actuant de manera autòcrina/paracrina, suprimeix p53 i augmenta la proliferació cel·lular veïna. La GH induïda també suprimeix la DDR i la reparació de l'ADN, millorant encara més l'acumulació de danys a l'ADN. Els resultats també són coherents amb els efectes observats sobre l'acumulació de danys a l'ADN dins dels tumors pituïtaris humans que secreten GH (Ben-Shlomo et al., 2020).

Les accions de GH al teixit normal del còlon afavoreixen el desenvolupament d'un entorn pro-proliferatiu que pot ser la base de l'augment de les taxes de pòlips del còlon relacionat amb l'edat, exemplificat per l'edat de danys a l'ADN associat a l'edat i la inestabilitat cromosòmica com a motors de la prevalença del càncer de còlon en pacients més grans 50 anys (Aunan et al.,2017). L'augment del dany a l'ADN relacionat amb l'edat que mostrem aquí també és coherent amb els informes que yH2AX augmenta linealment amb l'edat en exemplars normals de còlon (Risques et al., 2008). La nostra marcada regulació observada d'yH2AX en organoides envellits és indicativa de l'acumulació de danys a l'ADN, ja que yH2AX marca els llocs de danys a l'ADN per atraure proteïnes reparadores de l'ADN (Turinetto i Giachino, 2015). Aquests resultats poden ser aparentment inconsistents amb el fet que la GH induïda a les cèl·lules envellides suprimeix la fosforilació H2AX. Tanmateix, interpretem aquestes observacions per demostrar que la GH disminueix l'activitat de la DDR disminuint la fosforilació de l'ATM, que, al seu torn, disminueix (però no suprimeix completament) la fosforilació de proteïnes aigües avall inclosa H2AX. Quan la DDR no s'activa adequadament, la reparació de l'ADN s'altera, però yH2AX encara s'acumula a mesura que marca els llocs de danys a l'ADN no reparats. Així, els nivells de yH2AX observats en el teixit humà i els organoides envellits reflecteixen un resultat net de l'activitat DDR i la quantitat d'ADN no reparat.

El dany de l'ADN es pot acumular en el teixit envellit a causa de la pèrdua de la reparació de l'excisió de bases, probablement per la pèrdua de la resposta p53 al dany de l'ADN (Cabelof et al., 2006; Simon et al., 2009, 2012). En els nostres experiments, p53 va disminuir en cèl·lules de còlon i organoides que expressaven npGH, d'acord amb les troballes anteriors de la supressió de la GH (Chesnokova et al., 2016). Per contra, els ratolins GHR-/- vells, que són resistents al càncer i tenen una vida útil més llarga (Basu et al., 2018), així com els ratolins GHRcolKO específics del còlon presenten una expressió més gran de p53 del còlon, que probablement millora la reparació de l'ADN. Com que la GH suprimeix p53 (Chesnokova et al., 2013), la inducció de npGH pot provocar canvis en el microambient local consistents amb la disminució de p53 associada a l'edat (Feng et al., 2007; Goukassian et al., 2000). El promotor de GH conté un lloc d'unió de p53 (Chesnokova et al., 2013) i p53 induït per danys a l'ADN activa l'expressió de GH (Chesnokova et al. 2013, 2019a). Així, els nostres resultats mostren que en organoides envellits, l'acumulació de danys a l'ADN indueix npGH, que, al seu torn, regula a la baixa p53.

És important destacar que, com que npGH es secreta localment a partir de cèl·lules danyades per l'ADN, podria funcionar una acció paracrina per a la GH secretada a les cèl·lules veïnes. Mentre co-cultivava hNCF que expressava GH amb el Colon Intestine-Chip, vam observar un augment del dany i la proliferació de l'ADN i vam reduir p53/p21 a les cèl·lules epitelials incrustades en xip exposades als efectes paracrins dels fibroblasts derivats. Aquests resultats suggereixen que l'envelliment local no induït en el teixit humà altera el microambient dels teixits suprimint les proteïnes supresores de tumors i millorant la proliferació epitelial i el dany a l'ADN.

Els resultats són coherents amb les observacions que el tractament amb GH exògena augmenta la capacitat proliferativa, la formació de colònies i les metàstasis en ratolins DJ-1 KO (Chien et al., 2016) i amb evidència que la inducció de GH a les cèl·lules tumorals humanes s'associa amb la progressió de diversos càncers (Perry et al., 2017); aquests s'ajusten als nostres resultats que mostren menys formacions de colònies i una mida de colònia més petita amb la supressió de la GH.

Les vies de reparació de danys a l'ADN protegeixen contra la inestabilitat cromosòmica que impulsa la transformació cel·lular (Negrini et al. 2010). Per exemple, Tip60 activa ATM (Jackson i Bartek, 2009) i ATM, un regulador central de DDR, fosforila i estabilitza p53. Les cèl·lules envellides presenten una supressió d'ATM i p53 reduïda, així com una desregulació de la reparació de l'ADN amb danys posteriors no reparats a l'ADN (Lan et al., 2019). Així, a les cèl·lules del còlon, el dany a l'ADN s'acumula amb l'edat (Risques et al., 2008; Schu-macher et al., 2008), almenys en part a causa de la disminució de l'eficiència de DDR (Jackson i Bartek, 2009) i va suprimir p53 en La resposta a la irradiació y en ratolins envellits es va atribuir a la disminució relacionada amb l'edat de l'ATM p53-estabilitzador (Feng et al, 2007). a la disminució de la reparació de l'ADN, tal com ho demostra la fosforilació ATM i p53 atenuada, respectivament. Aquests resultats suggereixen que la sobreexpressió local de npGH pot contribuir a la reparació d'ADN i DDR desregulada relacionada amb l'edat. En els organoides envellits, la inducció de GH va atenuar la DDR, mentre que la supressió de la GH va activar la DDR, com ho demostra la disminució del dany a l'ADN. Aquests resultats estan recolzats per les nostres observacions anteriors que el bloqueig de la senyalització de GH a l'ANCC va provocar una disminució del dany a l'ADN (Chesnokova et al., 2019a). A més, mostrem que el dany a l'ADN del còlon no s'acumula en ratolins GHRcolKO dirigits al còlon amb GHR extirpat, però sí que s'acumula a l'intestí prim, on el GHR estava intacte. Aquests resultats, juntament amb la nostra demostració que els ratolins GHR-7-vells no acumulen danys a l'ADN del còlon, donen suport in vivo a la hipòtesi que la inducció local de npGH amb cèl·lules agemayrender susceptibles de transformació i potser també contribueixen a la resistència a la teràpia del càncer, ja que s'ha suggerit (Basu i Kopchick, 2019).

Els resultats que es mostren aquí també plantegen la possibilitat que els efectes de la GH puguin estar mediats pel factor de creixement semblant a la insulina 1 (IGF1). A diferència de la GH, la senyalització d'IGF1 activa la reparació de l'ADN en cèl·lules no tumorals i tumorals (Chesnokova i Melmed, 2020; Chitnis et al., 2014; Turney et al., 2012), i hem demostrat que la supressió de la GH de p53 i la inducció de l'ADN l'edat de les danys es produeix independentment de l'IGF1 al teixit normal del còlon (Ches-nokova et al., 2019a, 2019b). Tanmateix, a les cèl·lules i teixits en què la GH activa IGF1, aquest darrer factor de creixement també pot indicar de manera específica per a la cèl·lula per contrarestar l'acció de la GH sobre l'estabilitat del genoma.

Els resultats suggereixen que la npGH induïda en l'envelliment del teixit del còlon en resposta al dany acumulat a l'ADN facilita més danys a l'ADN i sembla ser un determinant advers de la reparació del dany a l'ADN. L'extrapolació d'aquestes troballes proporciona una plataforma per a diverses aplicacions clíniques potencials. Com que l'acumulació de danys a l'ADN és un segell distintiu de les malalties relacionades amb l'edat, dirigir la senyalització de GH per bloquejar cap efecte autòcrí/paracrí pot resultar útil per impedir el dany epitelial relacionat amb l'edat i, finalment, millorar la progressió de les patologies epitelials relacionades amb l'edat (Miman et al. ,2016) Aquest enfocament també pot beneficiar els pacients amb càncer sotmesos a teràpies perjudicials per a l'ADN, en els quals els canvis de camp epitelial generats per cap acció autocrina/paracrina poden danyar el teixit veí normal. En aquest sentit, la interrupció de la senyalització de GH amb un antagonista de GHR aprovat (List et al., 2011; Trainer et al, 2000) pot aportar beneficis clínics. És important destacar que la GH humana s'ha promogut de manera inadequada com a teràpia anti-envelliment i que millora la força no aprovada (Giordano et al., 2008; Holt i Ho, 2019; Medeiros i Siegel Watkins, 2018; Melmed, 2019). Tenint en compte els efectes paracrins nocius de la npGH que informem aquí, l'administració inadequada de GH a llarg termini com a elixir anti-envelliment pot provocar la senyalització de GHR i arriscar el desenvolupament de danys a l'ADN de les cèl·lules epitelials, així com l'activació potencial de lesions proliferatives ocultes.

Aquest article està extret de Cell Reports 37, 110068, 14 de desembre de 2021, ª 2021 L'autor(s). 1 Aquest és un article d'accés obert sota la llicència CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)