Les metaanàlisis identifiquen la metilació de l'ADN associada a la funció i el dany renal

edmund.chen@wecistanche.com

Crònicamalaltia de ronyóés una càrrega important per a la salut pública. L'elevada relació albúmina-creatinina urinària és una mesura dedany renal,i s'utilitza per diagnosticar i estadificar la crònicamalaltia de ronyó. Ampliar els coneixements sobre mecanismes reguladors relacionats ambfunció renali malaltia, vam realitzar un estudi d'associació a tot l'epigenoma basat en sang per a la taxa de filtració glomerular estimada (n=33, 605) i la relació albúmina-creatinina urinària (n {= 15, 068) i vam detectar 69 i set llocs CpG on la metilació de l'ADN es va associar amb el tret corresponent. La majoria d'aquestes troballes van mostrar associacions direccionals coherents amb els resultats clínics respectius de la crònicamalaltia de ronyói un augment moderat de l'albuminúria. Associacions de metilació de l'ADN ambfunció renal, com ara CpG a JAZF1, PELI1 i CHD2 es van validarteixit renal. La metilació a PHRF1, LDB2, CSRNP1 i IRF5 va indicar efectes causals sobrefunció renal. Les anàlisis d'enriquiment van revelar vies relacionades amb l'hemostàsia i la migració de cèl·lules sanguínies per a la taxa de filtració glomerular estimada i l'activació i resposta de les cèl·lules immunitàries per als CpG associats a la proporció d'albúmina i creatinina urinària.

Paraules clau:malaltia de ronyó; dany renal; funció renal; teixit renal; estructura renal

crònicamalaltia de ronyó(ERC) és una càrrega important per a la salut pública. Afecta més del 10% dels adults a tot el món i més del 40% de les persones de 70 anys o més1,2. La ERC és una de les principals causes de mort a tot el món3 i contribueix de manera important a la morbiditat i mortalitat cardiovascular2,4,5. La CKD es defineix com la presència sostinguda d'anomalies deronyóestructura o funció. Elfunció renalLes mesures més utilitzades són la taxa de filtració glomerular, estimada normalment a partir de les concentracions de creatinina sèrica (eGFR) i la relació albúmina-creatinina urinària (UACR)6. UACR elevat és una mesura dedany renal, s'utilitza per diagnosticar i estadificar la CKD7, i s'associa amb diabètics i hipertensosmalaltia de ronyó8. Fins i tot la UACR moderadament elevada és un factor de risc de malalties cardiovasculars, independentment d'altresfunció renal markers such as eGFR9. Familial aggregation studies of CKD and eGFR revealed a substantial heritable component of up to 54%9–11. Only a small part of this heritability is attributed to classical monogenic diseases. Rather, CKD susceptibility is influenced by DNA sequence variants in many genes, environmental factors, and their interactions. Genome-wide association studies (GWAS) have successfully identified common variants at >400 loci genètics que estan associatsfunció renal10,12,13. Les variants de l'índex als loci associats a eGFR coneguts expliquen un 8,9 per cent estimat de la variància eGFR12.Una metaanàlisi recent de GWAS d'eGFR va integrar regions de cromatina oberta amb petits conjunts de polimorfismes d'un sol nucleòtid (SNP)10. Els resultats d'aquest estudi donen suport a la importància de la regulació transcripcional alterada com a mecanisme que contribueix a la CKD. Investigar la metilació de l'ADN, respecte afunció renal, s'han realitzat estudis d'associació a tot l'epigenoma (EWAS) d'eGFR i CKD. Com a regulador clau de la transcripció que es pot avaluar d'una manera rendible i d'alt rendiment, s'ha estudiat la metilació de l'ADN en llocs CpG (CpG) amb resolució d'una sola base. Prèviament, vam realitzar un EWAS que inclou 4859 adults de dos estudis basats en la població i vam identificar 18 llocs validats i metilats de manera diferencial a la sang sencera associats amb eGFR14. Tot i que aquest estudi va revelar coneixements sobre els mecanismes reguladors dels gensronyófunció, els CpG associats explicaven només l'1,2 per cent de la variància eGFR. Altres estudis anteriors es van centrar en pacients amb ERC i/o pacients amb diabetis o pacients amb infecció pel virus de la immunodeficiència humana, o estaven limitats per la petita mida de la mostra, la manca de replicació, la falta d'ajust per a possibles factors de confusió o una combinació d'aquests 14-19. Altres estudis es van centrar en els patrons de metilació de l'ADN dels diabèticsmalaltia de ronyópacients (DKD)20–22.

CISTANCHE MILLORARÀ LA MALALTIA RENAL/RENAL

Aquí, vam realitzar un EWAS defunció renaltrets per identificar CpG addicionals relacionats amb mecanismes reguladors de gens d'importància potencial per a la CKD. Vam ampliar l'antiga EWAS per a eGFR i CKD augmentant substancialment la mida de la mostra fins a 33.605 individus. A més, vam incloure UACR i un augment moderat de l'albuminúria (microalbuminúria) com a trets addicionals. Els EWAS es van dur a terme en estudis predominantment basats en la població ajustant-se al sexe, l'edat, la diabetis, la hipertensió, l'índex de massa corporal (IMC), l'estat del tabaquisme i les proporcions de glòbuls blancs més abundants. Vam replicar els nostres resultats EWAS en mostres separades, vam relacionar els llocs CpG amb els nivells d'expressió gènica en diferents teixits, vam aplicar els resultats als resultats clínics i vam avaluar la causalitat entre la metilació de l'ADN i lafunció renal(Fig. 1 suplementària).

Resultats

Estudiar les característiques de la mostra. En aquesta investigació, 36 estudis amb un total de 33.605 participants van contribuir a EWAS d'eGFR i 15.068 a EWAS de UACR. Les seves característiques agrupades es mostren a la taula 1, i les descripcions dels estudis individuals es proporcionen a les dades complementàries 1 i 2.

EWAS d'eGFR i UACR.Hem investigat l'associació deronyótrets amb metilació de l'ADN a la sang fins a 441.870 CpG, la superposició de CpG coberta per Illumina MethylationnEPIC BeadChip i la matriu Illumina HumanMethylation450 BeadChip, que es van utilitzar per mesurar tots els estudis menys un (Dades suplementàries 3). Tots els estudis van realitzar una neteja de dades de matriu i van aplicar scripts desenvolupats de manera centralitzada per a la preparació de la matriuronyóvalors de trets, que es van relacionar posteriorment amb la metilació de l'ADN mitjançant models de regressió lineal ajustats per covariables amb valors de metilació com a variable dependent seguint protocols d'estudi preespecificats (vegeu Mètodes). Vam observar poca o nul·la inflació a l'EWAS específic de l'estudi (inflació mitjana d'eGFR=1.00, inflació mitjana UACR=1.00, dades suplementàries 1 i 2). En un EWAS transètnic ajustat per múltiples variables, 69 CpG es van associar significativament amb eGFR i es van replicar (Fig. 1A, Dades suplementàries 4, vegeu Mètodes), inclosos els reportats anteriorment14. Els llocs replicats van mostrar un patró clar de metilació més baixa (60 CpG, Pbinom=2.2E-10; Fig. 1A).

Fig. 1 Resultats de l'EWAS d'eGFR i UACR. Els diagrames de Chicago dels resultats de l'estudi d'associació a tot l'epigenoma (EWAS) per a la taxa de filtració glomerular estimada (eGFR) (A) i la relació albúmina-creatinina urinària (UACR) (B) utilitzant la mostra combinada de descobriment i replicació. Els llocs estan ordenats per la seva posició cromosòmica a l'eix x, amb el seu valor P -log10 de la prova de Wald d'associació proporcionat a l'eix y. Els CpG correlacionats positivament amb el tret es representen a la part superior, els llocs amb correlació negativa a la part inferior. Les línies horitzontals de punts representen el nivell de significació (valor P < 1,1e−7).="" els="" nous="" llocs="" de="" rèpliques="" estan="" acolorits="" de="" taronja,="" els="" llocs="" replicats="" coneguts="" estan="" acolorits="" de="" turquesa="" i="" els="" llocs="" que="" també="" estaven="" associats="" amb="" el="" tret="" binari="" respectiu="">malaltia de ronyó[CKD]/ microalbuminúria [MA]) estan marcats amb una creu.

A la metaanàlisi, es van observar els valors P més baixos per a associacions d'eGFR conegudes, incloent cg17944885 (ZNF788,=-1,75E-04, valor P=8.7E-41), cg23597162 (JAZF1). ,=−1,48E−04, valor P=3.2E−24) i cg06158227 (ZSCAN29,=−1,08E−04, valor P=8 .7E−20)14, seguit d'una nova troballa a cg20777437 (CDCP2,=-8.28E−05, valor P=1.1E−17). Només els 69 CpG replicats associats a eGFR van explicar el 15, 7 per cent de la variació d'eGFR en una mostra d'estudi independent de 1888 participants (vegeu Mètodes). Quan s'afegeixen totes les covariables (sexe, edat, diabetis, hipertensió, IMC, tabaquisme i proporcions de glòbuls blancs) al model d'associació, la proporció total de la variància explicada de l'eGFR va augmentar fins al 36,3 per cent, amb una variació del 2,4 per cent atribuïda als 69 CpG. independentment de les altres covariables.

En l'anàlisi transètnica de la UACR, set CpG es van associar i replicar significativament (Fig. 1B, Dades suplementàries 5, vegeu Mètodes). De les troballes, cg18181703 (SOCS3,=-2,58E−03, valor P=2,6E−13) i cg02711608 (SLC1A5,=-1,63 E−03, valor P=9.9E−13) tenia els valors P d'associació de metaanàlisi més petits. A sis dels set CpG, una metilació més baixa es va associar amb una UACR més alta. A causa del nombre de llocs replicats, la potència de la prova binomial era limitada (6 CpG, pbinom=0.13; Fig. 1B). Els CpG replicats van explicar el 3,9% i el model complet el 14,6% de la variació dels nivells de UACR, amb un 0,07% atribuït als CpG independentment de les altres covariables.

Hi va haver una baixa superposició entre l'EWAS replicat i els loci GWAS reportats anteriorment tant per a eGFR (superposició=10 de 69; dades suplementàries 4) com UACR (superposició=1 de 7; dades suplementàries 5). No hi va haver cap superposició de CpG replicats entre eGFR i UACR, cosa que indica perfils de metilació de l'ADN específics de trets a la sang. Fins i tot entre les 967 i 270 associacions suggeridores (valor P <1e-05) d'una="" metaanàlisi="" combinada="" de="" mostres="" de="" descobriment="" i="" replicació="" per="" a="" egfr="" i="" uacr,="" respectivament,="" només="" 10="" llocs="" es="" van="" solapar="" entre="" ambdós="" trets.="" els="" resultats="" detallats="" d'aquestes="" metaanàlisis="" per="" a="" totes="" les="" associacions="" suggeridores="" es="" proporcionen="" a="" les="" dades="" suplementàries="" 6="" (egfr)="" i="" 7="">Heterogeneïtat de l'ascendència i robustesa de les troballes. Per avaluar si els resultats de l'associació sobre eGFR i UACR podrien estar impulsats per una ascendència específica, vam realitzar una metaanàlisi EWAS estratificada per ascendència de mostres d'ascendència europea (EA) i afroamericana (AA) amb resultats de múltiples estudis que contribueixen a aquests dos. ètnies. Comparació dels resultats d'associació dels CpG replicats en mostres d'EA (Negar=23, 671; nUACR=9806) amb les mostres d'AA (neGFR =

5019; nUACR = 1921) showed similar effect sizes (reGFR = 0.87, rUACR = 0.74). The effect directions of almost all replicated CpGs were concordant between the ancestries (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The only exception was the UACR association cg22304262 in SLC1A5 which, however, was not significant in AA (P-value = 0.39, Supplementary Fig. 2). This association, as well as the CpGs at JAZF1 and RPS10P7 for eGFR, showed significant heterogeneity (eGFR: P-value < 0.05/69, UACR: P-value < 0.05/7) between EA and AA association results (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The presence of common SNPs (minor allele frequency >Es va avaluar {{0}}.05) dins o dins de 50 pb dels 69 CpG replicats per avaluar si la presència de SNP podria afectar la unió de la sonda. Quatre sondes es van localitzar a prop d'un SNP comú (dades suplementàries 4; cg10960375-rs113564504; cg{11544657-rs2083577; cg01817897-rs142643977; cg{06930757-rs112223111), que, tanmateix, no es van associar amb cap tret de GWAS segons el recurs PhenoScanner V2 (accedit el 02/12/2021, pGWAS < 5e-8,="" inclosos="" els="" snp="" proxy="" amb="" eur="" r²=""> 0,8)23. Això indica que és poc probable que els resultats de l'EWAS es confonguin per un tret comú conegut per relacionar-se ambfunció renalper variació propera de la seqüència d'ADN. Els SNP interns de la sonda que eren més de cinc bases de l'extrem 3' de la sonda generalment es va trobar que tenien una conseqüència insignificant24.

Relació amb la ERC i la microalbuminúria.Dels 69 CpG associats amb eGFR, 53 també es van associar amb ERC prevalent en una metaanàlisi de 25,609 individus, inclosos 2376 casos amb una direcció d'efecte consistent (valor P <0. 05/69;="" dades="" suplementàries="" 4,="" figura="" suplementària="" 3a).="" la="" correlació="" entre="" els="" efectes="" d'egfr="" i="" ckd="" va="" ser="" alta="" (r="-0," 93;="" fig.="" 3a).="" en="" una="" cohort="" independent="" de="" 551="" pacients="" amb="" erc,="" 65="" cpg="" eren="" direccionalment="" coherents="" amb="" la="" metaanàlisi="" d'egfr="" i="" cinc="" replicats="" (valor="" p=""><0, 05/69,="" r="0.77;" figura="" suplementària="" 4,="" dades="" suplementàries="" 4,="" vegeu="" mètodes).="" a="" la="" mateixa="" cohort,="" els="" cpg="" associats="" amb="" egfr="" cg18194850="" (valor="" p="1.6E−5)" i="" cg07242931="" (valor="" p="2.3E−5)" també="" es="" van="" associar="" amb="" el="" temps="">insuficiència renalo agutlesió renal(Dades complementàries 8, vegeu Mètodes). Els set CpG associats amb UACR també es van associar significativament amb la microalbuminúria en una mostra de 7279 individus, inclosos 1186 casos amb la mateixa direcció d'efecte que per a UACR (valor P <0.05 ,="" r="" {{7}="" },98;="" fig.="" 3b,="" dades="" suplementàries="" 5,="" fig.="" 3b="">

Correlació amb l'expressió gènica. Per obtenir informació sobre els possibles mecanismes funcionals dels CpG associats a eGFR i UACR, vam provar la correlació dels seus nivells de metilació de l'ADN amb els nivells d'ARNm de gens codificats en cis en sang sencera així com en monòcits de sang (vegeu Mètodes, Dades suplementàries 9). ). El conegut cg17944885 associat a eGFR al cromosoma 19 a prop de ZNF788 es va associar amb la transcripció codificada per la proteïna 439 del dit de zinc distant de 240 kb (ZNF439, taula 2). A més, la metilació de cg04864179 al factor regulador de l'interferó 5 (IRF5) es va associar tant amb les transcripcions d'ARNm codificades per IRF5 com amb la transportina 3 propera (TNPO3) (figura suplementària 5A). De les associacions UACR, els dos CpG replicats cg02711608 i cg22304262 al membre 5 de la família de transportadors de soluts 1 (SLC1A5) van revelar associacions significatives amb els nivells d'ARNm de SLC1A5 i cg23570810 a la proteïna transmembrana induïda per interferó a la seva proteïna transmembrana IFITM 1 (IFITM1 ci) 2). Tots els resultats de l'anàlisi de l'expressió gènica es proporcionen a les dades complementàries 9.

Efectes en el teixit renal.Per avaluar si els efectes de metilació observats a la sang es tradueixen ateixit renal,vam aplicar un model de regressió per provar les associacions dels CpG replicats per a una associació significativa (taxa de descobriment fals (FDR) < 0.05) i coherent amb la direcció amb eGFR ironyófibrosi, respectivament, en 506 microdissecatsteixit renalmostres. En aquestes mostres,ronyóLa metilació de l'ADN basada en teixits de CpG replicats associats a eGFR cg23597162 a JAZF1, cg26099045 a prop de PELI1 i cg12644285 a CHD2 es van associar significativament amb eGFR amb la mateixa direcció d'efecte que a la sang (Figura suplementària 2, 6A, dades complementàries de la taula) . A més, el mateix CpG a PELI1 i sis addicionals

llocs (cg20146909 a LRRC8D, cg25767870 a prop de FAM46C, cg16618493 a ZBTB7B, cg10632966 a prop de RPEL1, cg01068906 a NOD2 i cg03297731 a la fibrosiPD3)ronyómostres de teixit amb direccions d'efecte consistents (és a dir, inverses) (figura suplementària 6B, taula 2). Dels llocs UACR replicats, els nivells de metilació de l'ADNronyóel teixit de cg00008629 a PTBP3 i cg24859433 a prop d'IER3 es va associar amb fibrosi i va mostrar la mateixa direcció d'efecte (figura suplementària 6D, taula 2). D'acord amb les troballes de l'EWAS, no es va trobar cap associació significativa dels CpG associats a UACR amb eGFR en els donants de mostres de ronyó (figura suplementària 6C, dades suplementàries 10).

Efectes causals entre la metilació de l'ADN ifunció renaltrets. Per avaluar si elfunció renalEls trets afecten causalment la metilació de l'ADN o viceversa, vam realitzar una anàlisi bidireccional d'aleatorització mendeliana (MR) de dues mostres dels CpGs significativament associats. L'anàlisi de la RM de direcció cap endavant va suggerir que els CpGs cg02304370 (PHRF1), cg04460609 (LDB2), cg00501876 (CSRNP1) i cg04864179 (IRF5) influeixen causalment en els nivells d'eGFR (taula 3). Les estimacions d'heretabilitat d'aquests quatre CpG van variar entre els tres conjunts de dades de poblacions d'ascendència europea, però van ser constantment superiors a l'heretabilitat mitjana de tots els CpG avaluats en cadascun dels tres estudis: 0,34 (eGFR CpG causals) vs. 0,16 (matriu HM450K) basat en Hannon et al.25, 0,55 vs. 0,19 per a Dongen et al.26, i 0,51 vs. 0,19 per McRae et al.27. No es van identificar associacions causals significatives per a cap CpG associat a UACR. Per a la RM inversa, l'únic efecte significatiu va ser el de l'eGFR a cg23597162 (JAZF1) quan s'utilitzava el mètode primari de variància inversa. No obstant això, no es van identificar/observar efectes significatius en les múltiples anàlisis de sensibilitat de la RM inversa. Les anàlisis d'exclusió no van mostrar cap indici que els resultats de la RM poguessin estar impulsats per un únic SNP. A més, l'exclusió dels SNP que estaven associats amb la diabetis mellitus tipus 2 era un factor de risc importantmalaltia de ronyóno va donar lloc a troballes diferents. Els resultats de totes les anàlisis de resonància magnètica primària i de sensibilitat es mostren a les dades suplementàries 11 i 12 i a la figura 7 suplementària. Les anàlisis de sensibilitat donen suport a les conclusions principals dels resultats significatius de RM endavant (FDR < 0.05,="" vegeu="" mètodes)="" amb="" estimacions="" d'efectes="" consistents="" en="" la="" direcció,="" que="" indiquen="" relacions="" potencialment="" causals="" des="" de="" la="" metilació="" de="" l'adn="" fins="" a="" egfr,="" però="" no="" a="">

Anàlisis d'unió del factor de transcripció, marca d'histona i enriquiment de la via. Hem realitzat anàlisis del lloc d'unió del factor de transcripció, la marca d'histona i l'enriquiment de les vies basades en els 967 CpG que mostraven una associació suggeridora amb eGFR (valor P <1e−05; dades="" suplementàries="" 6)="" i="" els="" 270="" cpg="" que="" mostraven="" associacions="" suggeridores="" amb="" uacr="" (valor="" p=""><). 1e-5;="" dades="" suplementàries="" 7)="" a="" la="" metaanàlisi="" per="" maximitzar="" el="" poder="" estadístic="" de="" les="" anàlisis="" d'enriquiment="" (vegeu="" mètodes)="" 14="" primer,="" vam="" avaluar="" si="" els="" cpg="" associats="" a="" egfr="" es="" van="" mapejar="" preferentment="" als="" llocs="" d'unió="" de="" 169="" factors="" de="" transcripció="" (tf)="" basats="" en="" la="" cromatina="" dades="" de="" seqüenciació="" d'adn="" d'immunoprecipitació="" (chip-seq)="" del="" projecte="" encode="" que="" es="" van="" agregar="" mitjançant="" una="" convocatòria="" de="" consens="" a="" 91="" tipus="" de="" cèl·lules="" humanes="" (161="" pistes="" tf)="" i="" es="" van="" complementar="" amb="">ronyópistes basades en teixits (vegeu Mètodes). Després de la correcció de proves múltiples per a 169 TF, vuit TF van mostrar un enriquiment significatiu per als CpG associats a eGFR (FDR <0.05; fig.="" 4a,="" dades="" suplementàries="" 13),="" inclòs="" cebpb="" (valor="" p="1)." 75e−06,="" via="" de="" teixit="" creuat)="" i="" ep300="" (valor="" p="7.49E−09," via="" de="" teixit="" creuat).="" això="" és="" coherent="" amb="" la="" troballa="" de="" chu="" et="" al.14="" en="" un="" subconjunt="" més="" petit="" de="" 4859="" participants="" dels="" 33.605="" participants="" analitzats="" aquí.="" els="" cpg="" associats="" a="" uacr="" es="" van="" enriquir="" en="" llocs="" d'unió="" de="" 56="" tf="" (fig.="" 4b,="" dades="" suplementàries="" 14)="" amb="" l'associació="" més="" forta="" per="" a="" polr2a="" (valor="" p="6.93E-19)," fos="" (valor="" p="" {{32}="" }}.28e−12)="" i="" ep300="" (valor="" p="">

RonyóEls CpG associats a la funció es van enriquir àmpliament per a diverses marques d'histona, amb 82 de 195 combinacions de tipus cel·lular de marca d'histona significatives (FDR q <0.05) per="" a="" egfr="" (fig.="" 4c,="" dades="" suplementàries="" 15)="" i="" 79="" de="" 195="" per="" a="" uacr="" (fig.="" 4d,="" dades="" suplementàries="" 16).="" la="" modificació="" d'histona="" h3k4me1,="" una="" marca="" concentrada="" en="" potenciadors="" actius="" i="" primers,="" es="" va="" enriquir="" per="" a="" tots="" els="" tipus="" de="" cèl·lules="" per="" a="" cpg="" associats="" a="" uacr="" i="" gairebé="" tots="" els="" tipus="" de="" cèl·lules="" per="" a="" cpg="" associats="" amb="" egfr.="" mentre="" que="" els="" cpg="" associats="" a="" uacr="" van="" mostrar="" un="" enriquiment="" per="" a="" la="" marca="" promotora="" h3k4me3="" en="" 34="" tipus="" de="" cèl·lules,="" només="" quatre="">

Els tipus van mostrar un enriquiment per als llocs associats a eGFR. Per contra, la marca associada al cos del gen H3K36me3 va mostrar un enriquiment molt més ampli per als CpG associats a eGFR (30 tipus de cèl·lules) que els CpG associats a UACR (cinc tipus de cèl·lules). A diferència de H3K3me1/3 i H3K36me3, que s'han relacionat tots amb gens actius (potenciadors, promotors actius, transcripció activa), H3K9me3 i H3K27me3, que generalment s'associen amb heterocromatina constitutiva i facultativa28-31, no es van enriquir significativament per a UACR- CpG associats a qualsevol tipus de cèl·lula provat (Fig. 4D, dades suplementàries 16). Enriquiment de gens implicats perfunció renalEls CpG associats es van avaluar a la Gene Ontology (GO), a la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) i a les bases de dades Reactome (vegeu Mètodes)32–35. Es va observar un enriquiment significatiu de 27 termes (25 GO, un KEGG, un Reactome; Dades suplementàries 17, Fig. 5A) per a eGFR i 91 termes (87 GO, quatre Reactome; Dades suplementàries 18, Fig. 5B) per a UACR (Fig. .5B). Les vies relacionades amb la migració específica del tipus de glòbuls blancs, la traducció de l'ARNm, l'hemostàsia i la coagulació, així com la resposta a la insulina, van mostrar un enriquiment significatiu per als CpG associats a eGFR (FDR <0.05; fig.="" 5a).="" les="" vies="" amb="" els="" valors="" p="" d'enriquiment="" més="" baixos="" per="" als="" llocs="" associats="" a="" uacr="" estaven="" dominades="" per="" l'activació="" i="" la="" resposta="" de="" les="" cèl·lules="" immunitàries="" i="" les="" vies="" relacionades="" amb="" l'interferó="" (fig.="" 5b).="" les="" vies="" addicionals="" que="" es="" van="" enriquir="" van="" incloure="" la="" migració="" de="" glòbuls="" blancs,="" com="" per="" als="" resultats="" d'egfr="" (dades="" suplementàries="">

Relació amb associacions EWAS conegudes amb altres trets. Tenint en compte l'enriquiment observat de les vies relacionades amb la resposta immune, els resultats de la metilació de l'ADN, inclosos els CpG prop dels gens de la via de l'interferó, i el fet que l'estat de metilació de l'ADN es va avaluar principalment en els leucòcits, vam avaluar si les nostres troballes poden estar motivades per efectes confusos de la resposta immune o l'estat d'inflamació. Així, vam realitzar una cerca dels CpG replicats en un gran EWAS en nivells de proteïna C reactiva sèrica (CRP) d'alta sensibilitat36. Només dos CpG, que també estaven associats amb la metilació de l'ADN i l'eGFRteixit renal,cg09610644 a BDH1 i cg12644285 a CHD2, es trobaven entre els llocs associats a CRP. Per tant, sembla poc probable una confusió general dels nostres resultats a través de l'estat inflamatori estimat per CRP.

Alguns delsfunció renalEls CpG associats identificats en aquest estudi estan associats amb altres trets basats en EWAS publicats. Vint-i-un llocs d'eGFR es van associar amb la pressió arterial, el consum d'alcohol, l'IMC, el sexe, el receptor del factor de necrosi tumoral soluble 2 i/o l'estat de tabaquisme, i cinc llocs UACR es van associar prèviament amb el consum d'alcohol, l'estat del tabaquisme, l'IMC, el nivell educatiu, -glutamil transferasa, receptor soluble del factor de necrosi tumoral 2, diabetis mellitus tipus 2 i/o diversos metabòlits sèrics (taula 2, dades suplementàries 19). Tres d'aquests CpG (tots els llocs UACR) es van associar amb més de dos trets, és a dir, cg02711608 a SLC1A5 (amb -glutamil transferasa, -glutamiltreonina, IMC, consum d'alcohol), cg18181703 a SOCS3 (amb estat de diabetis mellitus tipus 2, BMI, tabaquisme). , receptor soluble del factor de necrosi tumoral 2) i cg24859433 a prop de IER3 (amb estat de fumador, nivell educatiu, sulfat de 4-vinilfenol_). La figura 5B addicional exemplifica un CpG, cg26099045, que es va correlacionar amb eGFR i fibrosi enteixit renalen la nostra anàlisi i, a més, associat amb el sexe i el tabaquisme en EWAS anteriors. Finalment, cg17944885 a ZNF788 també es va associar amb eGFR en una mostra de pacients amb DKD22.

Discussió

En aquest EWAS defunció renal, vam identificar i replicar els nivells de metilació de l'ADN en sang de 69 CpGs associats amb eGFR. D'aquests, 60 llocs no es van informar anteriorment, com els set CpG identificats en associació amb UACR. La majoria dels CpG associats a eGFR i UACR també es van associar significativament amb els seus resultats clínics, és a dir, CKD i microalbuminúria, i per tant poden tenir el potencial d'estratificació d'individus en risc. La variància d'eGFR atribuïda a aquests 69 CpG va ser del 2,4 per cent, el doble de la d'un EWAS14 anterior, i és comparable a la variància explicada per 29 SNP descoberts per GWAS que incloïen una mida de mostra tres vegades més gran per al descobriment de locus37,38. Això suggereix que la metilació diferencial de l'ADN en els CpG individuals quantificats a partir de la sang explica més la variància d'eGFR que els SNP comuns individuals a una mida de mostra determinada. Per a UACR, sembla que es requereixen mides de mostra més grans en comparació amb eGFR per revelar un nombre similar de CpG associats a trets. Atès que l'albúmina i la creatinina per al càlcul de la UACR es mesuren a l'orina en lloc de la quantificació de la creatinina del sèrum per a l'estimació de la GFR, aquesta diferència no és inesperada i està en línia amb les observacions de GWAS d'aquests trets10,13. A més, la variació genètica sembla afectarfunció renaltrets per vies diferents que els canvis en la metilació de l'ADN. Això està recolzat per la baixa superposició entre els llocs replicats EWAS i GWAS tant per a eGFR com per a UACR.

Aquesta metaanàlisi de l'EWAS va incloure mostres de diferents poblacions i ètnies. Vam observar una alta correlació de les estimacions d'efectes obtingudes de la gran submostra d'individus EA amb els efectes estimats en els individus AA (Fig. 2). Malgrat la inclusió de dades d'un nombre substancial d'individus d'ascendència no EA, els resultats generals de l'EWAS transètnic podrien estar impulsats per dades d'individus d'ascendència EA, que representaven el 70 per cent (eGFR) / 65 per cent (UACR) del nostre estudi (dades complementàries 3 i 4). Per abordar aquesta limitació, es necessiten anàlisis futures amb una proporció més gran de mostres que no són EA per a una avaluació fiable i detallada de l'heterogeneïtat entre els ascendents. El potencial de traduir els coneixements d'EWAS de trets quantitatius en estudis majoritàriament basats en la població a persones amb la malaltia s'il·lustra pel fet que es van observar estimacions d'efectes a 65 de 69 CpG associats a eGFR en la mateixa direcció en una cohort de 551 pacients amb CKD. apuntant cap a mecanismes aplicables a una àmplia gamma de nivells d'eGFR (Fig. 3). A més,

cg07242931 a MAN1C1 i cg18194850 a SUCLG2 no només es va associar amb eGFR, sinó que va predir el temps perinsuficiència renalo agutlesió renal(Dades complementàries 8). Un GWAS va suggerir més proves per a la implicació de SUCLG2, que codifica la subunitat de succinil-CoA sintetasa, en la malaltia renal.malaltia de ronyóals indis americans (SNP=rs4453858, valor P=2E−6)39. La variació genètica d'aquest gen també es va associar amb els nivells urinaris de succinil-carnitina (C4DC, SNP=rs115560420, valor P=7E-15)40. C4DC és un producte metabòlic del cicle de l'àcid tricarboxílic, que es catalitza sota la implicació de la succinil-CoA sintetasa i nivells més elevats de C4DC a la sang associats a un menor eGFR41. No obstant això, una cerca en els resultats dels loci de trets quantitatius de metilació (meQTL) de GoDMC (http://www.godmc.org.uk)42 no va revelar una associació significativa d'aquests dos SNP amb cg18194850, cosa que suggereix cap enllaç directe entre aquests SNP. i el lloc CpG.

Com que la metilació de l'ADN és un regulador important de l'expressió gènica, vam avaluar la correlació dels llocs de metilació de l'ADN associats als trets amb els nivells d'ARNm dels gens en cis. Gens els nivells d'ARNm dels quals es correlacionaven significativament ambfunció renalEls llocs de metilació de l'ADN associats estaven relacionats amb les vies de l'interferó (tant per a eGFR com per a UACR). Tot i que aquestes troballes coincideixen amb els resultats d'enriquiment de la via per a UACR (Fig. 5B, dades suplementàries 18), el nombre de correlacions significatives entre els CpG associats a UACR i els nivells de transcripció és força baix. Això no és sorprenent tenint en compte la mida relativament petita de la mostra de 1915 individus disponibles per a aquesta anàlisi i la cobertura limitada del recurs de transcriptòmica. Curiosament, entre les troballes significatives per a UACR, dos CpG del membre 5 de la família de portadors de soluts 1 (SLC1A5) es van associar amb l'expressió gènica diferencial i també amb la pressió arterial. Per tant, la metilació de l'ADN a SLC1A5, que codifica un transportador d'aminoàcids neutres dependent del sodi, podria ser un element addicional que contribueixi a la correlació coneguda entre UACR i pressió arterial.

Les transcripcions expressades de manera diferent no sempre estaven codificades pel gen més proper (cg17944885 a prop de ZNF788), o un lloc CpG es va correlacionar amb múltiples gens en cis (cg04864179 a IRF5). En particular, és notable la correlació de la metilació de l'ADN a cg04864179 amb els nivells de transcripció IRF5. Tenint en compte el resultat significatiu de la RM d'aquest CpG amb eGFR, la metilació de l'ADN a IRF5 podria influir causalment en eGFR mediada per la seva expressió gènica. Tenint en compte la transformació de trets de les associacions genètiques subjacents (vegeu Mètodes), vam observar que un augment de la metilació de l'ADN de deu desviacions estàndard va donar lloc a un 3,2 per cent més d'eGFR. Tot i que aquest efecte estimat és molt petit, una influència causal dels patrons de metilació de les cèl·lules sanguínies en la CKD també va ser recolzada per la RM basada en resums amb un conjunt de dades meQTL diferent en un estudi recent, on l'efecte causal era direccionalment coherent amb els nostres resultats22. Mitjançant l'aplicació de la colocalització de múltiples trets, també van demostrar que els efectes genètics d'aquest locus sobre eGFR estaven mediats per la metilació IRF5 i l'expressió gènica a la sang. A més, es va mostrar la colocalització de l'expressió del gen IRF5 amb eGFR tant als compartiments tubulars com glomerulars deronyóteixit43. Quan s'interpreta l'efecte causal observat al nostre estudi, cal tenir en compte, però, que les anàlisis de RM per a CpG cg04864179 van mostrar una heterogeneïtat significativa (p <0, 05)="" entre="" els="" instruments="" (dades="" suplementàries="" 11="" i="" figura="" suplementària="" 7).="">

IRF5 codifica un membre de la família del factor regulador de l'interferó (IRF). El grup de membres de la família IRF conté factors de transcripció amb diferents rols, com ara la modulació de l'activitat del sistema immunitari, el creixement i la diferenciació, així com el control de l'expressió gènica de la resposta d'interferó a les infeccions víriques. IRF5 pot influir en la resposta de les cèl·lules immunitàries. Diversos estudis donen suport que els canvis en la metilació de l'IRF5 poden afectarfunció renalmitjançant vies immunitàries: els SNP a IRF5 estan associats a LES mitjançant canvis en l'expressió d'IRF5 en monòcits sanguinis44–46. El LES és una malaltia autoimmune caracteritzada per una activació de la via de l'IFN que pot afectar laronyonscom la nefritis lúpica47. Inhibició de la hiperactivació de l'IRF5 en un model de ratolí de LES protegit de l'inici i la gravetat de la nefritis lúpica i millorafunció renali patologia48,49. Tot i que el nostre EWAS no es va centrar en l'estudi de pacients amb LES, es podrien detectar petits efectes de la metilació d'IRF5 sobre els resultats relacionats amb els ronyons, mediats almenys parcialment per la seva expressió i les subsegüents vies d'IFN, com a efectes sobre eGFR a la població general.

CISTANCHE MILLORARÀ EL DOLOR RENAL/RENAL

Diversos dels CpG associats a eGFR per als quals es va quantificar la metilació de l'ADN a partir de cèl·lules sanguínies també es van associar amb eGFR ironyófibrosi quan es va quantificar la metilació de l'ADNronyóteixit, tot i que la mida de la mostra era substancialment més petita en comparació amb el conjunt de dades EWAS. Això suggereix que almenys algunes de les troballes obtingudes de la sang es poden traduir a un teixit objectiu addicional específic per a un tret. Aquí, sang ironyósón els dos principals teixits diana específics de trets, des de l'funciódelronyóés la filtració de la sang per eliminar els residus. Anàlisis d'enriquiment de lafunció renalels CpG associats van indicar un paper central en la regulació transcripcional. Hem trobat un enriquiment generalitzat de H3K4me1/3 i H3K36me3. H3K4me1/3 està vinculat a potenciadors primers i actius, així com a promotors actius i H3K36me3 està estretament correlacionat amb regions transcrites del genoma50. El paper de la regulació transcripcional es recolza encara més pel senyal d'enriquiment del factor de transcripció més fort dels CpG associats a UACR, que és POLR2A, la subunitat més gran de l'enzim principal que sintetitza l'ARNm en eucariotes.

Les limitacions potencials relacionades amb les anàlisis de MR inclouen que no hi havia instruments vàlids disponibles per a tots els CpG per a l'MR endavant. Atès que tots els instruments d'un CpG es van seleccionar de les regions cis, és a dir, de la mateixa regió genètica, és probable que tots els instruments d'un CpG siguin vàlids o no vàlids, limitant així el nombre de mètodes de RM diferents que es poden aplicar per provar el robustesa dels resultats51. La RM inversa estava limitada en potència a causa de la petita mida de mostra disponible per a l'estimació de les associacions de metilació SNP-ADN. Els estudis meQTL més grans, com ara el GoDMC, no van poder emmagatzemar els resultats d'associació per a tots els SNP (és a dir, per sobre d'un determinat tall de valor P d'associació) per raons tècniques i, per tant, no es van poder utilitzar per a la RM inversa de dues mostres. Per tant, les troballes no significatives s'han d'interpretar amb cura. A més, és difícil interpretar la mida de l'efecte causal, ja que les associacions genètiques subjacents es calculen a l'escala de desviació estàndard dels nivells de metilació de l'ADN. Una altra limitació potencial de l'estudi és que eGFR, CKD i UACR són fenotips estimats a partir de diferents paràmetres subjacents i tenen influències multifactorials. Així, vam realitzar diverses anàlisis per assegurar-nos que els nostres resultats de l'EWAS no estaven motivats per factors de confusió coneguts, inclosa la diabetis tipus 2, un possible factor de confusió de la relació entre DNAm ifunció renal. En primer lloc, les associacions EWAS de cada cohort es van ajustar per confondre per eliminar els seus efectes dins d'una cohort. En segon lloc, els EWAS es van realitzar a cada cohort per separat i després es van meta-analitzar, que correspon a un ajust, per exemple, per a la prevalença de diabetis entre les cohorts. Finalment, vam comprovar les associacions dels nostres CpG replicats dins dels estudis EWAS de diabetis publicats. De totes les nostres associacions de CpG replicades, només el CpG cg18181703 associat a UACR a SOCS3 va mostrar una associació amb diabetis tipus 2. Aquest CpG també es va associar amb l'estat de tabaquisme, l'IMC i els nivells sanguinis del receptor 2 del factor de necrosi tumoral soluble. Tenint en compte que el nostre EWAS també es va ajustar per a l'estat de tabaquisme i l'IMC, suposem que els efectes de cg18181703 sobre la UACR són de almenys parcialment independent de la diabetis tipus 2, l'IMC i l'estat de tabaquisme. Tot i que vam controlar diversos d'aquests factors coneguts, altres factors, com ara les covariables no mesurades, no es van poder ajustar explícitament a les anàlisis i poden influir en les troballes.

Es necessiten més estudis EWAS amb mida de mostra més gran i amb metilació de l'ADN quantificada a partir de teixits addicionals, així com anàlisis funcionals per ampliar el nostre coneixement sobre els mecanismes reguladors defunció renali, finalment, millorar la predicció i el tractamentronyómalaltia. Això és cert específicament per a UACR, donat el menor nombre d'associacions de CpG significatives observades. En resum, aquesta metaanàlisi EWAS a gran escala va ampliar substancialment el nombre de CpG associats de manera reproducible amb eGFR i CKD i va revelar set associacions per a UACR i microalbuminúria. La metilació de l'ADN en aquests llocs va explicar una gran proporció de la variància d'eGFR, i la metilació diferencial a quatre CpG va mostrar evidències d'una possible relació causal amb eGFR. Caracterització integral dels CpG replicats entre pacients amb ERC, ateixit renal,per a l'expressió gènica diferencial, i per a vies enriquides i marques epigenètiques proporcionen informació sobrefunció renal-regulació transcripcional associada.

Mètodes

Visió general.Hem establert una metaanàlisi col·laborativa basada en un model distributiu de dades i procediments de control de qualitat. Per maximitzar l'estandardització del fenotip entre els estudis, es va crear un pla d'anàlisi i un script de línia d'ordres (https://github.com/generac-Freiburg/Skagen-pheno/tree/ckdgen-ewas-pheno) i es va proporcionar a tots els estudis participants ( estudis predominantment basats en la població; Dades suplementàries 1 i 2). Els fitxers de resum generats automàticament es van comprovar de manera centralitzada. Després de l'aprovació del fenotip, els estudis van executar el seu EWAS i van carregar els resultats i van agregar la informació de metilació de l'ADN a un servidor central. El control de qualitat EWAS es va realitzar amb scripts personalitzats per avaluar la inflació, els controls positius, la distribució de les sondes CpG i comparar entre estudis les distribucions generals de mides d'efecte, errors estàndard i valors P. Tots els protocols d'estudi van ser aprovats pels respectius comitès d'ètica locals. Tots els participants en tots els estudis van proporcionar un consentiment informat per escrit.

CISTANCHE MILLORARÀ LA DIÀLISI RENAL/RENAL

Definició del fenotip.Els valors de creatinina obtinguts amb l'assaig Jaffé abans del 2009 es van calibrar multiplicant per 0,9552. Els estudis van estimar la TFG amb la CrònicaMalaltia de ronyóEquació de col·laboració en epidemiologia (CKD-EPI)53. eGFR es va winsoritzar a 15 i 200 ml min-1 per 1,73 m2. La CKD es va definir com un eGFR per sota de 60 ml min-1 per 1, 73 m2. Els valors UACR mesurats en mg/g es van transformar en log natural abans de totes les anàlisis. La microalbuminúria es va definir com 1 per a UACR > 30 mg/g i com 0 per a valors UACR < 10="">

Quantificació i control de qualitat de la metilació de l'ADN.Per a la quantificació de la metilació de l'ADN, es va extreure ADN genòmic de sang perifèrica. Els nivells de metilació de l'ADN es van quantificar mitjançant la matriu Infinium MethylationEPIC BeadChip (EPIC), la matriu Illumina Infinium HumanMethylation450K BeadChip (HM450K) o la matriu Illumina Infinium HumanMethylation27 BeadChip (HM27K). El preprocessament de les dades de metilació de l'ADN es va realitzar d'acord amb protocols d'estudi individuals, inclosos la correcció de fons, la normalització de quantils, el filtratge de la sonda, el filtrat de mostres, la concordança de SNP amb les ubicacions de la sonda de control SNP, el filtratge atípic i la correcció del tipus d'assaig (dades suplementàries 3). El nivell de metilació a cada lloc es va representar i analitzar com a valor. Es van anotar les sondes CpG que es superposaven amb els SNP. Cada estudi va calcular la mitjana i la desviació estàndard de cada lloc de CpG i es van comparar aquestes estadístiques de resum entre estudis per obtenir diferències sistemàtiques entre els CpG i es van fer un seguiment amb analistes d'estudi individuals.

Valoració de covariables.La metilació i les covariables de l'ADN es van mesurar a la mateixa visita/punt de temps. La diabetis prevalent es va definir com a glucosa plasmàtica en dejú superior o igual a 126 mg/dl, glucosa plasmàtica no en dejú superior o igual a 200 mg/dl, tractament per a la diabetis o autoinforme d'un diagnòstic de diabetis. La hipertensió prevalent es va definir com a pressió arterial sistòlica superior o igual a 140 mm Hg, pressió arterial diastòlica superior o igual a 90 mm Hg o tractament per a la hipertensió. Si la pressió arterial mesurada no estava disponible, la hipertensió es va definir mitjançant l'autoinforme. L'estat actual del tabaquisme es va definir mitjançant la informació autoinformada. L'IMC (kg/m2) es va calcular mitjançant mesures de pes i alçada tal com es van avaluar en cada estudi. L'edat es va incloure com a valor continu en els models d'associació. L'estructura de la població en estudis no familiars es va ajustar per components genètics principals (PC). Les proporcions de tipus de glòbuls blancs es van estimar a partir de la metilació de l'ADN54. Les covariables tècniques addicionals incloïen els ordinadors de la sonda de control55, el centre d'estudis, el lot de processament, l'identificador de la matriu de sentrix i la posició de la sentrix.

Mètodes estadístics i metaanàlisi. Per garantir una potència comparable entre els llocs analitzats, només es van incloure a les anàlisis els CpG autosòmics mesurats per tots dos, EPIC i HM450K. Cada estudi va realitzar anàlisis de regressió lineal separades per grups d'ascendència. Per avaluar la robustesa dels resultats de l'EWAS, les anàlisis es van limitar a estudis i submostres d'individus d'ascendència europea. Els valors de metilació de l'ADN es van modelar com a variables dependents amb el tret que eren valors continus d'eGFR o UACR o variables binàries de CKD o microalbuminúria: metilació de l'ADN ~ tret més sexe més edat més PC genètics més proporcions de glòbuls blancs més covariables tècniques més diabetis més hipertensió més IMC més el tabaquisme actual Els participants necessitaven informació completa per a totes les variables i les estadístiques de resum de l'estudi i només es van incloure si hi havia un mínim de 50 participants per a eGFR/UACR i 50 casos/controls per a CKD/microalbuminúria, respectivament. Cada EWAS específic de l'estudi es va ajustar a la inflació abans de la metaanàlisi mitjançant l'enfocament BACON si l'estimació d'inflació era major o igual a un (figura suplementària 8)56. Els estudis es van dividir en descobriment i replicació per ordre cronològic de contribució a la metaanàlisi del Consorci CKDGen (dades suplementàries 1 i 2). Es va realitzar una metaanàlisi ponderada amb variància inversa d'efectes fixos tal com s'implementa al paquet R "metafor" (versió 2.1-0) per a estudis de descobriment, estudis de rèplica i per a les estimacions d'efectes resultants de descobriment i replicació. Els CpG es van excloure si es disposava de menys de la meitat de la mida de la mostra respectiva tant en el descobriment com en la replicació o si l'estimació d'heterogeneïtat d'I2 era superior al 95 per cent. La replicació reeixida d'un CpG associat es va definir com la direcció coherent de les estimacions de l'efecte entre el descobriment (disc neGFR=22, 347, disc nUACR=11, 458) i la replicació (neGFR repl=11, 258). , nUACR repl=3610) metaanàlisi, una importància ajustada de Bonferroni del valor P del descobriment (pdisc)<1.1e−7 (#cpgs="" egfr="441,870," #cpgs="" uacr="441,854)," nominal="" significance="" of="" the="" replication="" p-value="" (prepl)=""><0.05, and="" a="" combined="" discovery="" and="" replication="" p-value="" (pcomb)=""><>

Anàlisi de l'expressió gènica.Els efectes de lafunció renalEls CpG associats a trets es van provar per associacions amb l'expressió gènica a la sang mitjançant dos conjunts de dades: (1) nivells d'ARNm de monòcits de 1202 participants de l'estudi MESA i (2) ARNm de sang sencera de 713 individus del Estudi KORA F4 57,58. Com a pas inicial, es va realitzar una cerca dels nivells de metilació de CpG amb els nivells d'ARNm disponibles als resultats de l'associació de l'estudi MESA. Per a aquesta cerca, estaven disponibles resultats d'associació amb un valor P < 1e{{10}}.="" l'anàlisi="" es="" va="" descriure="" amb="" detall="" a="" kennedy="" et="" al.59.="" breument,="" l'expressió="" gènica="" es="" va="" avaluar="" mitjançant="" l'expression="" beadchips="" illumina="" humanht-12="" v3.0="" i="" v4.0="" i="" la="" metilació="" de="" l'adn="" mitjançant="" la="" matriu="" illumina="" hm450k.="" els="" valors="" d'expressió="" es="" van="" normalitzar="" mitjançant="" la="" transformació="" estabilitzadora="" de="" la="" variància.="" 13.933="" transcripcions="" de="" les="" matrius="" v3.0="" i="" v4.0,="" que="" es="" van="" expressar="" significativament="" per="" sobre="" dels="" nivells="" de="" fons="" (valor="" p="" de="" detecció=""><0,01) en="" almenys="" el="" 5%="" dels="" subjectes.="" les="" anàlisis="" d'associació="" a="" mesa="" es="" van="" realitzar="" com="" a="" model="" mixt="" lineal="" utilitzant="" valors="" d'expressió="" gènica="" transformada="" en="" log="" com="" a="" variable="" dependent,="" valors="" beta="" de="" metilació="" de="" l'adn="" com="" a="" variable="" independent="" amb="" edat,="" sexe,="" ètnia="" i="" centre="" d'estudi="" afegits="" com="" a="" covariables="" al="" model.="" es="" va="" realitzar="" una="" segona="" prova="" d'associació="" al="" conjunt="" de="" dades="" kora="" f4.="" l'associació="" del="" nivell="" de="" metilació="" als="" cpg="" replicats="" amb="" els="" nivells="" d'expressió="" gènica="" de="" gens="" a="" ±="" 500="" kb="" de="" proximitat="" es="" va="" calcular="" mitjançant="" els="" nivells="" d'arnm="" transformat="" log2-obtinguts="" de="" la="" matriu="" d'expressió="" gènica="" illumina="" human="" ht-12v3.="" els="" valors="" d'expressió="" gènica="" es="" van="" retrocedir="" en="" els="" valors="" beta="" de="" metilació="" de="" l'adn="" ajustats="" per="" sexe="" i="" edat.="" abans="" de="" l'anàlisi,="" els="" factors="" tècnics,="" així="" com="" les="" proporcions="" del="" tipus="" de="" cèl·lules="" sanguínies,="" es="" van="" retrocedir="" dels="" nivells="" de="" metilació="" de="" l'arnm="" i="" l'adn,="" i="" els="" seus="" residus="" es="" van="" incloure="" en="" el="" model="" d'associació="" final.="" les="" comprovacions="" d'anotació="" i="" control="" de="" qualitat="" de="" les="" sondes="" d'expressió="" gènica="" es="" van="" basar="" en="" la="" taula="" proporcionada="" a="" schurmann="" et="" al.60.="" associacions="" d'expressió="" del="" gen="" cpg="" a="" la="" sang="" que="" estaven="" disponibles="" als="" resultats="" de="" mesa="" i="" tenien="" un="" valor="" p=""><0.05 in="" kora="" f4="" with="" consistent="" effect="" direction="" were="" considered="" as="" significant.="" all="" gene="" expression="" probes="" passed="" the="" annotation-based="" quality="" control="">

Metilació de l'ADN al teixit renal.Les anàlisis utilitzant la metilació de l'ADNteixit renalamb eGFR i fibrosi es van realitzar utilitzant dades de 506 microdissecatsteixit renalmostres utilitzant l'Illumina EPIC BeadChip. Les mostres de teixit renal es van recollir per separat i són diferents de les mostres de sang que es van analitzar a la metaanàlisi EWAS. Aquestes mostres es van recollir de parts no afectades de nefrectomies tumorals i es van preparar tal com es va descriure abans 61. En resum, es va utilitzar el programari SeSAMe62 per dur a terme el preprocessament i el control de qualitat, inclosa la detecció basada en baixa intensitat, la correcció de sagnat en la resta de fons, la correcció de biaix de colorant no lineal, control de la conversió de bisulfits, càlcul de valors beta i estimació de la fracció de leucòcits. Es van extreure valors beta de CpG associats amb eGFR i UACR i informació clínica per a l'anàlisi d'associació. Es va aplicar un model de regressió per provar les associacions de beta de metilació de l'ADN dels CpG finals com a variables dependents amb eGFR i nivells de fibrosi, respectivament, com a variables independents ajustades per sexe, edat, PC genètics (1-5), estat de diabetis, estat d'hipertensió. , IMC, matriu d'identificació sentrix, posició sentrix i control de conversió de bisulfits i fracció de leucòcits estimada.

Investigacions dirigides de sondes eGFR en pacients amb ERC. L'associació dels 69 CpG validats i associats a eGFR de la població general amb eGFR a la crònica alemanyaMalaltia de ronyó (GCKD) study was evaluated after correcting for the number of evaluated sites, and statistical significance was defined as Pvalue < 7.2E−4 (0.05/69). The GCKD study is a prospective observational study of patients with CKD63. Briefly, 5217 adult patients under nephrological care provided written informed consent and were enrolled from 2010 to 2012. Inclusion criteria were eGFR between 30 and 60 ml min−1 per 1.73 m2 or an eGFR of >60 ml min−1 per 1.73 m2 with UACR > 300 mg g−1 (or a urinary protein–creatinine ratio of >500 mg g−1). El seguiment dels pacients per determinar els efectes clínics encara està en curs. Els punts finals de l'estudi es registren contínuament de manera estandarditzada basant-se en cartes d'alta hospitalària i certificats de defunció i inclouen esdeveniments relacionats amb els ronyons i la mort. El disseny de l'estudi i la població d'estudi reclutada es descriuen amb més detall en publicacions anteriors63,64. L'estudi GCKD va ser aprovat pels comitès d'ètica locals i registrat al registre nacional d'estudis clínics (DRKS 00003971). Un subconjunt de 559 pacients amb ERC atribuït a lupus eritematós sistèmic, nefropatia membranosa, glomeruloesclerosi segmentària focal o poliquística autosòmica dominant.malaltia de ronyóes va seleccionar per a la quantificació de la metilació de l'ADN i es va mesurar mitjançant la matriu Infinium MethylationEPIC BeadChip (EPIC). L'associació amb eGFR es va avaluar de manera anàloga a l'anàlisi principal (vegeu Mètodes estadístics i metaanàlisi), a part de l'ajust per al tabaquisme que es va codificar 0/1/2 per als fumadors mai/ex-/actuals. Avaluar l'associació de la metilació de l'ADN amb el tempsinsuficiència renala partir de l'entrada de l'estudi, es van ajustar models de regressió de Cox per a cada CpG, i de manera anàloga per a un punt final combinat deinsuficiència renali agutlesió renal.A més del predictor de metilació de l'ADN, els models es van ajustar per edat, sexe i subtipus d'ERC. El model de regressió de Cox proporciona estimacions de la relació de risc per causa específica (HR) en presència dels esdeveniments competitius, és a dir, qualsevol altra mort excepte la mort relacionada amb el ronyó. També es van realitzar anàlisis de perill de subdistribució per avaluar els efectes indirectes potencials a través de l'esdeveniment competitiu. La hipòtesi dels riscos proporcionals es va avaluar a partir dels residus de Schoenfeld escalats. L'avaluació gràfica dels dos CpG associats no va revelar cap evidència de violacions importants (figura suplementària 9).

Trama d'associació regional i anotació. Les trames de la figura suplementària 5 es van crear mitjançant els paquets 'Gviz' 65 i 'rtracklayer' 66 R. Es van incloure a la trama un màxim de 40 llocs dins de 50,000 bp aigües amunt o aigües avall del lloc d'interès CpG. Si l'interval contenia més dels 40 llocs, la regió representada es va reduir a la distància del lloc més llunyà més 10,000 bp. La secció RefSeq Genes es basa en la pista UCSC NCBI RefSeq amb símbols de gens del paquet R 'org.Hs.eg.db', la secció CpG Islands es basa en la pista UCSC CpG Islands, la secció Roadmap chromHMM es basava en el Els fulls de ruta 15- indiquen el model chromHMM del fetalronyóepigenoma (Roadmap Epigenome ID: E086)67 i la secció Common SNPs es basa en la pista UCSC Common SNPs(151)68. Finalment, el gràfic de correlació CpG a la part inferior de la figura es basa en les dades de les mostres de metilació d'ADN de l'estudi KORA F4 mitjançant la matriu Illumina HumanMethylation450 BeadChip, amb els llocs que falten de color gris clar.

La variància s'explica per la metilació de l'ADN.El percentatge de variància fenotípica explicat pels 69 CpG replicats associats amb eGFR es va estimar mitjançant dades de 1.888 participants de l'estudi KORA FF4, el seguiment de set anys de l'estudi KORA F457,58. El KORA FF4 no formava part de la metaanàlisi EWAS. Tanmateix, 988 individus inclosos en l'anàlisi de la variància explicada es van solapar amb els participants de KORA F4 de l'EWAS. En aquest conjunt de dades, la variància explicada per tots els CpG independentment de les covariables es va estimar com la diferència en l'R2 del model base incloent els CpG i el que no. El model base es va definir comronyótret ~ sexe més edat més proporcions de glòbuls blancs més diabetis més hipertensió més IMC més el tabaquisme actualronyótret que representa eGFR i UACR. Per a dos CpG associats a eGFR (cg06008406, cg20004659), no hi havia dades disponibles al conjunt de dades KORA FF4.

Anàlisi d'aleatorització mendeliana bidireccional.A la RM avançada, utilitzant el paquet R "TwoSampleMR"69, vam investigar els possibles efectes causals de la metilació de l'ADN als CpG replicats en eGFR i UACR. La RM utilitza instruments genètics per minimitzar el biaix a causa de la causalitat confusa i inversa70. Els instruments genètics per a la metilació de l'ADN (meQTL) estaven disponibles per a 47 i cinc CpG per a eGFR i UACR, respectivament, tal com va identificar anteriorment GoDMC en fins a 27,750 individus42. Les dades GWAS del resum d'ascendència europea sobre eGFR10 i UACR13 es van utilitzar com a dades de resultats respectives. Es van aplicar filtres per a la inclusió de meQTL (pSNP < 1e-5="" amb="" metilació="" de="" l'adn="" en="" una="" regió="" cis="" de="" ±="" 500="" kb,="" desequilibri="" d'enllaç="" r2="">< 0,="" 2="" dins="" d'una="" regió="" d'1="" mb,="" filtratge="" steiger,="" maf=""> 0, 05). Hem realitzat MR ponderada amb variància inversa, així com anàlisis de sensibilitat a la RM (mode simple, mode ponderat, mediana ponderada i MR Egger) o triangulació estimant la relació de Wald en cas que només hi hagués un instrument per lloc de CpG disponible71–73. Les estimacions d'efectes obtingudes de MR depenen de les unitats dels conjunts de dades subjacents i, en aquest cas, corresponen a un canvi per unitat en una desviació estàndard dels nivells de metilació en l'eGFR transformat en logaritme natural i la desviació estàndard de la UACR transformada en logaritme natural, respectivament. A la RM inversa, vam examinar els possibles efectes causals defunció renaltrets sobre la metilació de l'ADN, utilitzant els SNP significatius a tot el genoma de GWAS transètnic en eGFR10 i UACR13 com a instruments genètics per a eGFR i UACR, respectivament. Per maximitzar la potència de les dades de resultats, vam realitzar una metaanàlisi de puntuació z de les associacions SNP-CpG dels estudis KORA F4 (n=1662) ​​i FHS (n=3868). Les estimacions de l'efecte combinat i els seus errors estàndard del meQTL inclòs a l'MR es van estimar a partir de la mida de la mostra, la freqüència d'al·lel i la puntuació z74. Es van aplicar filtres per a la inclusió de SNP (valor P <5e-8>ronyótret, valor P unilateral <0.05 amb="" nitrogen="" ureic="" en="" sang="" per="" a="" instruments="" d'egfr,="" heterogeneïtat="" d'ascendència="" valor="" p="" superior="" o="" igual="" a="" 0.0="" 1,="" filtratge="" steiger,="" maf=""> 0.05). Hem realitzat una RM ponderada per variància inversa amb efectes aleatoris multiplicatius (perquè hi havia un nombre suficientment elevat d'instruments de diferents loci disponible per tret)51 i anàlisis de sensibilitat de la RM (mode simple, mode ponderat, mediana ponderada i MR Egger)71–73. Com a anàlisi de sensibilitat addicional que abordava variants pleiotròpiques, vam excloure en total 35 instruments associats amb diabetis mellitus tipus 2 en un GWAS75 recent que inclou 898.130 individus: onze SNP que tenien una associació de valor P < 5e-8="" amb="" diabetis="" i="" 24="" addicionals.="" instruments="" que="" estaven="" en="" desequilibri="" d'enllaç="" (r2=""> 0,2 dins d'1 Mb, panell de referència de 1000 G EUR) amb un SNP associat a la diabetis. El desequilibri d'enllaç es va avaluar mitjançant LDlink76. Per a la RM inversa, les estimacions de l'efecte proporcionen el canvi per unitat en l'eGFR transformat en logaritme natural i la desviació estàndard de l'UACR transformat en logaritme natural, respectivament, en una desviació estàndard dels nivells de metilació de l'ADN. Es va aplicar un ajust de prova múltiple del valor P segons Benjamini-Hochberg FDR <0, 05="" per="" tret="" renal="" i="" per="" a="" la="" rm="" directa="" i="" inversa="" per="" separat77.="" els="" valors="" p="" d'heterogeneïtat="" es="" van="" obtenir="" a="" partir="" de="" les="" estadístiques="">

Anàlisis d'enriquiment.Per informar dels efectes funcionals potencials dels CpG associats, es va avaluar l'enriquiment d'aquests CpG en llocs de DNasa I o modificació d'histones (H3K4me1, H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3), conjunts de gens basats en termes i vies GO a les bases de dades KEGG i Reactome32. –35. Les anàlisis d'enriquiment de TFBS es van realitzar tal com es va descriure anteriorment en detall14. Breument, es van avaluar les proves d'enriquiment mitjançant eForge78 mitjançant permutació amb coincidència per a la localització de la regió insular de gens i CpG durant el mostreig. Les dades es van obtenir dels projectes ENCODE (125 mostres) o Roadmap Epigenomics (299 mostres) generats pel mètode Hotspot67,79,80. Els CpG que estaven associats amb eGFR i UACR, respectivament, amb un valor P <1e-{43}}5 a="" la="" metaanàlisi="" es="" van="" utilitzar="" com="" a="" entrada="" (dades="" suplementàries="" 6="" i="" 7)="" i="" 10,000="" execucions="" de="" remuestreig,="" un="" filtre="" de="" proximitat="" actiu="" i="" es="" va="" considerar="" que="" fdr=""><0,05 era="" significatiu="" (dades="" complementàries="" 13="" i="" 14).="" les="" anàlisis="" d'enriquiment="" de="" la="" marca="" d'histona="" es="" van="" realitzar="" de="" manera="" anàloga="" (dades="" complementàries="" 15="" i="" 16).="" l'enriquiment="" en="" conjunts="" o="" vies="" de="" gens="" es="" va="" avaluar="" mitjançant="" el="" paquet="" methylgsa="" i="" la="" versió="" r="" 3.6.181.="" el="" mètode="" de="" prova="" d'enriquiment="" va="" ser="" el="" metilglm="" que="" implementava="" una="" regressió="" logística="" ajustant-se="" al="" nombre="" de="" sondes="" per="" gen="" i="" al="" fons="" autosòmic="" que="" se="" solapa="" amb="" matrius="" 450k="" i="" epic.="" es="" van="" provar="" conjunts="" de="" gens="" o="" vies="" amb="" 100-500="" gens="" (configuració="" per="" defecte).="" vam="" considerar="" que="" un="" conjunt="" de="" gens="" o="" una="" via="" s'enriquia="" significativament="" a="" fdr="">< 0,05="" corregint="" per="" a="" proves="" múltiples="" dins="" de="" cada="" base="" de="" dades="" mitjançant="" el="" mètode="" benjamini="" i="" hochberg="" (dades="" suplementàries="" 17="" i="">