El silenciament MiR-103a-3p millora la dipòsit d'oxalat de calci al ronyó de rata activant l'eix UMOD/TRPV5

Mantenint l'equilibri demetabolisme del calci (Ca2+).al ronyó és crucial enprevenir la formació de càlculs renals. Funcionalment, cal donar a conèixer el microARN (miRNA) que participa en aquest procés. Hem induït una lesió de cèl·lules NRK-52E pertractament amb oxalat. El paper de la subfamília V membre 5 del canal catiònic potencial del receptor transitori (TRPV5) a les cèl·lules induïdes per oxalat es va estudiar mitjançant la transfecció de sobreexpressió TRPV5, qRT-PCR, Western blot, MTT i detecció d'adhesió de cristalls. Després d'identificar l'expressió d'uromodulina (UMOD) a les cèl·lules lesionades, vam confirmar la interacció entre TRPV5 i UMOD mitjançant assajos de coimmunoprecipitació (CoIP) i biotinilació de la superfície cel·lular. Es va realitzar la validació de TRPV5 que regula l'UMOD en la viabilitat, l'adhesió de cristalls i la concentració de Ca2+ de cèl·lules induïdes per oxalat. Es van utilitzar anàlisis bioinformàtiques i assaig de luciferasa per identificar l'UMOD orientat a miRNA. El paper de l'eix UMOD/TRPV5 que regula miR-103a-3p es va detectar mitjançant experiments de rescat. Hem construït un model de rata amb tractament d'etilenglicol (EG) per investigar l'eix miR-103a-3p/UMOD/TRPV5 in vivo mitjançant tinció d'hematoxilina-eosina (H&E), Western blot i immunohistoquímica (IHC). La regulació positiva de TRPV5 va protegir les cèl·lules NRK-52E de lesions induïdes per oxalat millorant la viabilitat cel·lular i inhibint l'adhesió de CaOx. UMOD es va esgotar a les cèl·lules induïdes per oxalat i va interaccionar positivament amb TRPV5. El silenciament UMOD va revertir l'efecte de la sobreexpressió de TRPV sobre les cèl·lules induïdes per oxalat. miR-103a-3p va dirigir UMOD i va ser mediat per la regulació de l'eix UMOD/TRPV5 a les cèl·lules induïdes per oxalat. La regulació a la baixa de miR-103a-3p va mitigar el CaOx induït per EGdeposició als teixits renalsin vivo activant l'eix UMOD/TRPV5. miR-103a-3p silenciant la deposició de CaOx millorada al ronyó de rata mitjançant l'activació de l'eix UMOD/TRPV5.

FORMULACIÓ D'HERBES PERDEPOSICIÓ EN ELS TEIXITS RENOLÓS

1. Introducció

Càlculs urinaris, un dels mésmalalties comunes en urologia, són causats per la precipitació de cristalls sobresaturats de l'orina al ronyó [1]. Encara que no són tan agressius com els tumors malignes, els càlculs urinaris han tingut durant molt de temps un impacte greu en la salut humana a causa de la seva alta incidència i taxa de recurrència [2]. Els estudis han confirmat que l'aparició de càlculs urinaris és multifactorial i implica genètica, metabolisme, clima ambiental i hàbits de vida [3, 4]. Els càlculs d'oxalat de calci (CaOx) representen la majoria dels casos d'aquesta malaltia, i la majoria dels pacients amb càlculs que contenen Ca2+- tenen una combinació d'hipercalciuria [5]. Els estudis fisicoquímics han verificat que la saturació de CaOx a l'orina està relacionada amb la concentració de Ca2+ i que l'augment del calci urinari predisposa o promou la formació de nefrolitiasi que conté Ca2+-[6]. Els càlculs renals poden provocar hipertensió, malaltia renal crònica i malaltia renal en fase terminal. Els estudis han informat que les mesures preventives, incloses intervencions farmacològiques específiques i recomanacions per a l'estil de vida i els canvis nutricionals, es poden dur a terme després d'una avaluació metabòlica completa [7, 8]. Diversos estudis humans han suggerit que les dietes amb una ingesta més alta de verdures i fruites tenen un paper en la prevenció de càlculs renals [9-11]. Actualment, s'hauria de fer un estudi en profunditat sobre el mecanisme molecular de la hipercalciuria induïda per un metabolisme anormal del calci en la formació de càlculs renals.

TRPV5 és una proteïna important que regula el transport de Ca2+ a través de les membranes cel·lulars [12]. Als teixits renals, TRPV5 es troba principalment al túbul contornejat distal (DCT) i al túbul col·lector (CNT), que és responsable de regular la reabsorció urinària de Ca2+ i mantenir l'homeòstasi de Ca{2+ al cos [13] . L'evidència disponible suggereix que l'expressió de TRPV5 regulada a la baixa pot ser un factor patogènic vital en la formació d'hipercalciuria i nefrolitiasi que conté Ca 2+- [14].

Taula 1: Les seqüències d'imprimació utilitzades per a qRT-PCR.

La uromodulina (UMOD), també coneguda com a proteïna Tamm-Horsfall, és la glicoproteïna més abundant a l'orina [15], que s'expressa principalment en cèl·lules epitelials tubulars renals amb una varietat de funcions fisiològiques com ara equilibrar el metabolisme aigua-electròlit, regular la immunitat. , prevenir els càlculs renals i protegir contra les infeccions del tracte urinari [16–18]. Actualment, hi ha pocs informes sobre el mecanisme molecular específic de l'UMOD en la formació de càlculs renals.

Els microARN (miRNAs) són una classe de molècules d'ARN monocatenaris, petites, no codificants, amb una longitud d'uns 20 a 22 nucleòtids, àmpliament existents en mamífers [19]. Els miRNA madurs poden regular l'expressió post-transcripcional dels gens objectiu unint-se totalment o parcialment de manera complementària al 3′-UTR de l'ARNm objectiu, donant lloc a la degradació o inhibició de la síntesi translacional de proteïnes [20]. Com que els miRNA afecten de manera espectacular les activitats fisiològiques humanes com el creixement i el desenvolupament, l'apoptosi cel·lular i el metabolisme, es considera que són una gran promesa per a la prevenció i el tractament de malalties [21]. En els darrers anys, la investigació sobre el paper dels miRNAs en l'aparició i desenvolupament de càlculs renals s'ha convertit en un tema candent [22, 23].

Per tant, aquest estudi va investigar la relació entre UMOD i TRPV5 en la prevenció de la formació de càlculs renals i va dilucidar el paper de miR-103a-3p en l'orientació i regulació de l'UMOD, contribuint a una comprensió més profunda de la patogènesi dels càlculs renals i aportant noves idees per a la prevenció i el maneig de la malaltia.

2. Material i Mètodes

2.1. Cultiu cel·lular i tractament amb oxalat.

La línia cel·lular de ronyó de rata epitelioide NRK{{0}}E (GNR 8) es va obtenir del Centre de Col·lecció de Cultura de Tipus de la Xina (CCTCC) (Xangai, Xina). Es va preparar DMEM (12800017, Gibco, EUA) barrejat amb aigua destil·lada, solució de NaHCO3 al 7,5% (25080094, Gibco, EUA) i sèrum boví fetal al 5% (FBS) (BC-SE-FBS02, Bio channel, Xina) cèl·lules en una incubadora (37 graus C i 5% CO2). Després del subcultiu, les cèl·lules es van induir amb oxalat diluït (0, 75 mmol/L, 135623, Sigma Aldrich, EUA) durant 48 hores (h), tal com es va descriure anteriorment [24]. 2.2. Transfecció cel·lular. Per a l'estudi del mecanisme molecular, plasmidi sobreexpressant TRPV5-(Bes-mR-001007572, Ber sinBio, Guangzhou, Xina), plasmidi sobreexpressant UMOD (Bes-mR{-001278605, BersinBio, Guangzhou, Xina), petit ARN interferent contra UMOD (siUMOD) (5′-CTCTTT TATCACACTTGATATGA-3′, GenePharma, Xangai, Xina), inhibidor de miR{-103a-3p (GenePharma, Xangai, Xina) i miR-103a-3p (BersinBio, Guangzhou, Xina) es van sotmetre a diferents transfeccions en cèl·lules NRK- 52E, amb els controls corresponents configurats. Abans de la transfecció, les cèl·lules NRK-52E es van cultivar en una placa 6-pou (2 × 106 cèl·lules/pou). Fins a arribar al voltant del 80% de confluència cel·lular, el plasmidi sobreexpressant TRPV5-, plasmidi sobreexpressant UMOD, siUMOD, inhibidor de miR{-103a-3p o imitació es va transfectar a NRK-52E cèl·lules que utilitzen el temps lipoic 2000 (11668019, Invitrogen, EUA) segons el protocol del fabricant. Després d'això, les cèl·lules NRK- 52E transfectades van rebre una reacció quantitativa en cadena de la polimerasa en temps real (qRT-PCR) i Western blot per a l'avaluació de la qualitat i després es van tractar amb oxalat.

2.3. Extracció d'ARN i qRT-PCR.

L'ARN total i el miRNA de les cèl·lules NRK-52E es van extreure mitjançant el kit d'ARN de cèl·lules (19231ES50, Yeasen, Xina) i el kit de miRNA de cèl·lules/tessuts MolPure® (19331ES50, Yeasen, Xina). A continuació, es va utilitzar el kit RT-PCR HiScript II One-Step (P612-01, Vazyme, Xina) per reaccionar amb l'extracte seguint les instruccions d'operació. La condició d'amplificació es va establir de la següent manera: 50 graus C durant 30 min, 94 graus C durant 3 min, seguits de 30 cicles (94 graus C durant 30 s, 60 graus C durant 30 s i 72 graus C durant 40 s), i 72 graus C durant 5 min. La qRT-PCR es va realitzar al sistema ABI 7500 (Applied Biosystems, EUA). Les expressions relatives d'ARNm es van analitzar pel mètode 2−ΔΔCt [25], amb -actina o U6 utilitzat per a la normalització. Totes les seqüències d'imprimació es mostren a la taula 1.

2.4. Western Blot.

La proteïna total de les mostres (cèl·lules NRK-52E i teixits de ronyó de rata) es va lisar mitjançant el tampó de lisi RIPA (R0010, Solarbio, Xina) i es va quantificar amb el kit d'assaig de proteïnes BCA (BI-WB005, Sbjbio, Xina). Es van separar quantitats iguals de proteïnes mitjançant electroforesi en gel de dodecilsulfat de sodi-poliacrilamida al 10% (P0690, Beyotime, Xina) i es van transferir a membranes de PVDF (AR0136- 02, Boster, Xina). Després de ser tractades amb tampó de bloqueig (P0252, Beyotime, Xina), les membranes es van incubar amb anti-TRPV5 (ab137028, 83 kDa, 1/10000), anti-UMOD (ab207170, 110 kDa, 1/1000) i anti{ {20}}Anticossos d'actina (ab8226, 42 kDa, 1/1000) a 4 graus C durant la nit. Els anticossos secundaris que inclouen IgG anti-conill (ab97051, 1/2000) i IgG anti-ratolí (ab205719, 1/2000) es van utilitzar per incubar les membranes durant 2 h a temperatura ambient. La detecció de taca de proteïna relativa es va executar al sistema d'imatge iBright (CL750, Invitrogen, EUA) mitjançant l'ús de tampó ECL (WBKlS0100, Millipore, EUA) per a la visualització. - L'actina va servir de control intern.

2.5. Assaig de viabilitat cel·lular.

Les suspensions cel·lulars es van preparar tal com es descriu en aquest estudi [24]. Les cèl·lules NRK-52E es van sembrar en plaques de cultiu de 96-pous a una densitat de 5000 cèl·lules/pou, i 10 μL de metil tiazolil difenil- Es va utilitzar una solució de bromur de tetrazoli (MTT) (40201ES72, Yeasen, Xina) per tractar les cèl·lules de cada pou a 37 graus C durant 4 h, seguit del tractament SDS-HCL. Per a l'avaluació de la viabilitat cel·lular, el valor de la densitat òptica (OD) a una longitud d'ona de 570 nm es va mesurar mitjançant un lector de microplaques (VL0L00D0, Thermo Fisher, EUA).