Clonació molecular i caracterització bioquímica d'una nova glicosiltransferasa de cumarina CtUGT1 de Cistanche Tubulosa

per a més informació:ali.ma@wecistanche.com

Xiping Xu, et al

RESUM

Les UDP-glicosiltransferases (UGT) són una família important i funcionalment diversa d'enzims implicats en la biosíntesi de metabòlits secundaris. La cumarina és un dels esquelets més comuns de productes naturals amb activitats farmacològiques candidates. No obstant això, fins ara, molts GT informats de plantes reconeixen principalment els flavonoides com a acceptors de sucre. Només els GT limitats podrien catalitzar la glicosilació de cumarines. En aquest estudi, es va clonar una nova UGTCistanche tubulosa, una valuosa herba xinesa tònica tradicional, que és abundant amb diversos glucòsids com ara glicòsids feniletanoides, glicòsids de lignan i glicòsids iridoides. L'alineació de seqüències i l'anàlisi filogenètica ho van demostrarCtUGT1està filogenèticament distant de la majoria de les UGT flavonoides informades i adjacent a les UGT fenilpropanoides. Amplis assaigs enzimàtics in vitro van trobar que, tot i queCtUGT1no estaven implicats en la biosíntesi de glucòsids bioactius aCistanche tubulosa, podria catalitzar la glucosilació de les cumarines umbelliferona 1, esculetina 2 i himecromona 3 amb un rendiment considerable. Els productes glicosilats es van identificar mitjançant la comparació amb els estàndards de referència o l'espectroscòpia de RMN, i els resultats van indicar queCtUGT1pot catalitzar regioespecíficament la glucosilació de les hidroxil cumarines a la posició C7- OH. Els residus clau que van determinarCtUGT1L'activitat de 's es va discutir més a partir del modelatge d'homologia i les anàlisis d'acoblament molecular. Combinat amb els resultats de la mutagènesi dirigida al lloc, es va trobar que l'H19 tenia un paper insubstituïble com a base crucial de catàlisi.CtUGT1podria utilitzar-se en la preparació enzimàtica de glicòsids de cumarina bioactius.

Paraules clau:glicosiltransferases vegetals, glicòsids de cumarina,Cistanche tubulosa, Modelització d'homologies, mutagènesi dirigida al lloc

Feu clic per extreure els beneficis dels productes de cistanche

Introducció

La glicosilació és un dels tipus de modificació estructural més comuns dels productes naturals secundaris. La glicosilació podria canviar l'estabilitat i/o la solubilitat de l'aglicon, i contribuir molt a la diversitat de productes naturals/no naturals a causa dels múltiples tipus de conjugació. A les plantes, aquestes reaccions eren generalment realitzades per glicosiltransferases (UGT) dependents del difosfat d'uridina (UDP), una mena d'enzims que catalitzen la transferència de fragments de monosacàrids del sucre nucleòtid activat a una molècula acceptora de glicosil que pot ser un carbohidrat, glucòsid, oligosacàrid. , o un polisacàrid [1,2]

Fins ara, molts gens que codifiquen UGT s'han aïllat de diverses plantes [3]. La glicosilació es va produir principalment en grups hidroxil o grups carboxil d'una àmplia gamma de productes secundaris, com ara flavonoides [4], fenilpropanoides [5], terpenoides [6], esteroides [7], alcaloides [8], etc. Les cumarines són metabòlits de fenilpropanoides àmpliament distribuïts en moltes espècies vegetals. Sovint existeixen cumarines naturals com a glicoconjugats, i aquests derivats presentaven un ampli espectre d'activitats farmacològiques, incloent antioxidants [9], antivirals [10,11], hepatoprotectors [12], antiinflamatoris [13] i anticancerígens [14]. ], antimutagènics [15] i activitats inhibidores de la colinesterasa (ChE) i de la monoaminooxidasa (MAO) [14,15], etc. No obstant això, fins ara, en comparació amb les UGT de flavonoides més freqüentment informades i investigades amb més freqüència, només hi havia UGT limitades. S'ha informat que és capaç de transferir la part de sucre a cumarines [16-18].

Les plantes riques en diversos glucòsids podrien servir com a conjunt genètic ideal d'UGT amb noves activitats de catàlisi. A més, s'ha informat que nombroses UGT posseeixen una promiscuïtat acceptor considerable per catalitzar la glicosilació de múltiples substrats, alguns dels quals fins i tot no estaven separats a les plantes [19]. En aquest article, una nova glicosiltransferasaCtUGT1va ser identificat a partir deCistanche tubulosa, una herba medicinal tradicional que és abundant amb diversos glucòsids com ara glicòsids feniletanoides (PhGs), glicòsids de lignan i glicòsids iridoides. L'expressió heteròloga i la caracterització de la funció van demostrar que tot i que recombinantCtUGT1no va participar en la biosíntesi d'aquests glucòsidsCistanche tubulosa, pot catalitzar la glucosilació de les hidroxil cumarines, i la reacció es va produir regiospecíficament a la posició 7- OH de les cumarines umbel·liferona 1, escalant 2 i himecromona 3 per produir tres compostos farmacològicament actius desnatats (1a), cichoriin (2a) , i 4-metilumbel·liferil glucòsid (3a) amb un rendiment considerable, respectivament. A més, el substrat de benzofenona 4,4′-dihidroxi benzofenona (4), el substrat d'isoflavona genisteïna (5) i el substrat d'antraquinona àloe-emodina (6) també podrien ser acceptats perCtUGT1. Les propietats catalítiques i els residus clau que subratllen la capacitat de catàlisi deCtUGT1també es van avaluar basant-se en el modelatge d'homologia, l'anàlisi AutoDock i la mutagènesi dirigida al lloc.

2. Experimental

2.1. Material vegetal i productes químics

Cistanche tubulosautilitzat en aquest estudi es va recollir de zones desèrtiques a Hetian, regions autònomes de Xinjiang. La seva identitat botànica va ser confirmada pel professor Pengfei Tu de la Universitat de Pequín. Les cumarines provades i altres substrats d'aquest estudi es van comprar a Sigma-Aldrich (St. Louis, EUA), Chengdu Push Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, Xina) i Chengdu Biopurify Phytochemicals Co., Ltd. (Chengdu, Xina). ) llevat que s'indiqui el contrari. Els estàndards de referència de desnatació (1a) i cichoriin (2a) es van comprar a Wuhan Chem Faces Biochemical Co., Ltd. (Wuhan, Xina).

2.2. Clonació molecular de CtUGT1 de Cistanche tubulosa

L'ARN total deCistanche tubulosaes va extreure de la tija carnosa mitjançant un kit OMEGA Plant RNA (GA, EUA) i es va transcriure inversament a cDNA amb el kit de reactiu PrimeScript™ RT (TaKaRa, Japó) seguint les instruccions del fabricant. Es va dissenyar un cebador degenerat per a 3′RACE basat en les seqüències d'aminoàcids de la caixa conservada de PSPG (Plant Secondary Product Glycosyltransferases) de glicosiltransferases vegetals. Les amplificacions d'extrem 3' i 5' deCtUGT1es van dur a terme mitjançant el kit d'amplificació d'ADNc Smart RACE (Clontech, EUA) segons el protocol del fabricant mitjançant primers (taula S1). L'ADNc de longitud completa delCtUGT1es va amplificar mitjançant PCR mitjançant KOD-Plus Neo DNA Polymerase (TOYOBO, Japó) amb parells d'imprimadors específics de gens (taula S1) en les condicions següents: un pas de desnaturalització inicial a 94 ◦ C durant 2 min, seguit de 35 cicles de desnaturalització a 98 ◦C durant 15 s, recuit a 55 ◦C durant 30 s i extensió a 68 ◦C durant 55 s, amb un pas d'extensió final a 68 ◦C durant 7 min. Tots els fragments d'ADN obtinguts es van clonar en un vector pEASY-Blunt (TransGen Biotech, Xina) i es van seqüenciar.

2.3. Alineació de seqüències i anàlisi filogenètica

Alineació de seqüències deCtUGT1amb glicosiltransferases informades (taula S2) es va realitzar mitjançant el paquet de programari DNAMAN 4.0 (Lynnon Biosoft, Canadà). Els motius i els dominis es van analitzar mitjançant una eina de domini conservat (http://www.ncbi.nlm.nih.Gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi). L'arbre filogenètic es va construir arrancant el programari MEGA 7.0.14 mitjançant el mètode d'unió de veïns amb 1000 rèpliques d'arrencada [20]. La seqüència de proteïnes traduïdes deCtUGT1es va alinear amb les conegudes glicosiltransferases vegetals dipositades a la base de dades NCBI GenBank (taula S3) amb ClustalW.

2.4. Expressió heteròloga i purificació de proteïnes de CtUGT1 a Escherichia coli

La regió de codificació deCtUGT1es va amplificar amb BamH I i Not I com a llocs de restricció mitjançant primers que es mostren a la taula S1. Les reaccions de PCR es van realitzar mitjançant l'ADN polimerasa KOD-Plus-Neo (TOYOBO, Osaka, Japó). Les seqüències obtingudes es van verificar mitjançant la clonació al vector pEASY-Blunt (TransGen Biotech, Xina). El producte d'amplificació confirmat deCtUGT1Posteriorment es va digerir i subclonar en el vector d'expressió pET-28a(plus) (Novagen, EUA). A continuació, la construcció verificada es va transformar en E. coli Transetta (DE3) per obtenir la soca recombinant. El cultiu nocturn de soca recombinant es va inocular al medi Luria-Bertani (LB) que contenia 50 ug⋅mL− 1 kanamicina i 40 ug⋅mL− 1 cloromicetina en una proporció d'1:1{{ 19}}0. Els cultius es van cultivar a 37 ◦ C, 200 rpm fins que el valor OD600 va arribar a 0,4-0,6. Posteriorment, es va afegir isopropil- -D-tiogalactopiranòsid (IPTG) a una concentració final de 0, 5 mM i les cèl·lules es van cultivar durant 16 h a 18 ◦ C, 180 rpm. A continuació, es van recollir pellets cel·lulars per centrifugació (7600 × g, 10 min, 4 ◦ C) i es van tornar a suspendre en tampó de lisi refrigerat de 3 ml/g (Nota de dades suplementàries 1) i es van interrompre per sonicació sobre gel. Les restes cel·lulars es van eliminar mitjançant centrifugació a 7600 × g, 4 ◦ C durant uns 30 min. Es va utilitzar una columna Histrap preequilibrada (GE Healthcare, Uppsala, Suècia) per a la cromatografia d'afinitat segons les instruccions del fabricant. La proteïna recombinant es va eluir amb 10 volums de columna de tampó d'elució (Nota de dades suplementàries 1) que contenia imidazol 250 mM. La puresa de proteïnes es va analitzar amb un 10% de SDS-PAGE. La proteïna purificada es va concentrar mitjançant un tub d'ultrafiltració de 30 kDa (Sigma-Aldrich, EUA) i es va dessalar mitjançant una columna PD-10 (GE Healthcare, Uppsala, Suècia) amb tampó de dessalació (Nota de dades suplementàries 1). La concentració de proteïnes es va determinar pel mètode Bradford utilitzant BSA com a estàndard.

2.5. Assajos d'activitat enzimàtica i especificitat de substrat de CtUGT1

Investigar l'activitat de glicosilació deCtUGT1, els assajos enzimàtics es van realitzar en una barreja de reacció (150 μL) composta per 0,4 mM aglicona, 0,8 mM UDP-glucosa (UDPG) i 50 ug de purificatCtUGT1proteïnes al tampó dessalinitzador. Totes les reaccions es van incubar a 30 ◦C durant 12 h i es van acabar afegint 300 μL de metanol fred. Les mescles es van centrifugar a 15,000 × g durant 30 min per recollir el sobrenedant per a les anàlisis HPLC-UV/ESI-MS. Es van realitzar habitualment tres assajos paral·lels per a cada reacció. L'HPLC (Agilent 1260, EUA) estava equipat amb un detector de matriu de díodes i una columna CAPCELL PAK C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm; Shiseido, Japó) a un cabal d'1 mL⋅min−1 i la temperatura de la columna es va mantenir a 30 ◦C. La fase mòbil constava de A (és a dir, una solució aquosa d'àcid fòrmic al 0,1 per cent) i B (és a dir, acetonitril). Els programes de gradient es van enumerar a la taula S4. Les dades de HRESI-MS es van registrar en un sistema LCMS-IT-TOF, equipat amb una interfície ESI (Shimadzu, Kyoto, Japó) amb He d'alta puresa com a gas de col·lisió i N2 com a gas de nebulització. Els paràmetres de font ESI optimitzats van ser els següents: cabal de gas de la funda, 1,5 mL⋅min−1; cabal de gas auxiliar, 1,5 mL⋅min− 1; tensió de polvorització, 4,5 kV; temperatura capil·lar, 200 ◦C. Els espectres es van registrar en el rang 100-1500 m/z per a una anàlisi MS d'escaneig complet.

2.6. Efectes del temps de reacció, el valor del pH i la temperatura sobre l'activitat enzimàtica i estudis cinètics de CtUGT1

Efectes del temps de reacció, el valor del pH i la temperatura sobre l'activitat enzimàtica deCtUGT1es van provar utilitzant UDPG com a donant de sucre i 3 com a acceptor de sucre en les condicions de reacció descrites anteriorment. Per a la determinació del pH òptim, es va comparar l'activitat enzimàtica en un tampó d'100 mM (àcid cítric-citrat de sodi) amb valors de pH que oscil·laven entre 3.0 i 6.{{. 14}}, 10{{20}} mM tampó (KH2PO4-K2HPO4) amb valors de pH que oscil·len entre 6.0 i 8.{{29} }, 10tampó 0 mM (Tris-HCl) amb valors de pH entre 7,0 i 9,0, tampó 100 mM (Na2CO3-NaHCO3) amb valors de pH entre 9,0 i 11,0. Per analitzar la temperatura de reacció òptima, les reaccions es van incubar a diverses temperatures que van de 0 a 65 ◦C. Els cursos de temps de la reacció es van avaluar en 12 punts de temps diferents entre 0 i 24 h. Tots els experiments es van realitzar per triplicat. Les mescles de reacció es van analitzar per HPLC-MS tal com es descriu anteriorment. Per a estudis cinètics deCtUGT1, es van realitzar assajos enzimàtics en un volum final d'100 μL que contenia 100 mM de tampó KH2PO4-K2HPO4 (pH 8,0), 25 ug de purificatCtUGT1, 3 mM d'UDPG i concentracions variables (50-3000 μM) de 3. Les reaccions es van dur a terme a 37 ◦C durant 30 min i després es van acabar amb 100 μL de metanol gelat. Totes aquestes reaccions es van realitzar per triplicat i es va avaluar l'activitat enzimàtica mitjançant la quantificació dels derivats glucosilats corresponents. Els paràmetres cinètics, inclosa la constant de Michaelis-Menten (Km) i Vmax, es van calcular mitjançant anàlisi de regressió no lineal mitjançant el programari GraphPad Prism 5.

2.7. Selectivitat de substrat i donant de sucre de CtUGT1

Per explorar les preferències de substrat deCtUGT1, es van provar un total de 27 substrats pertanyents a diferents tipus estructurals utilitzant UDPG com a donant. La seva informació química es va enumerar a la taula S5 i les seves estructures es van mostrar a les Figs. S1 i S2. Investigar la selectivitat dels donants de sucreCtUGT1, els assajos es van realitzar utilitzant umbel·liferona (1), esculetina (2), himecromona (3), 4,4′-dihidroxibenzofenona (4), genisteïna (5) i aloe-emodina (6) com a substrats amb UDPG, UDP- N acetil galactosamina, UDP-galactosa, GDP-manosa, GDP-fucosa, àcid galacturònic UDP, UDP-ramnosa com a donants de sucre, respectivament. Tots els experiments es van realitzar per triplicat. Les mescles de reacció es van analitzar per HPLC-MS tal com es descriu anteriorment.

2.8. Preparació de 4-metilumbel·liferil glucòsid (compost 3a) per CtUGT1

La barreja de reacció preparativa constava de {{0}}, 0,034 mmol de compost de substrat 3, 0, 04 mmol de UDPG, 5 mg purificatCtUGT1en 50 ml de tampó de reacció. Les reaccions es van agitar suaument en les condicions òptimes (KH2PO4-K2HPO4 100 mM amb pH 8,0; 37 ◦C). Després de la incubació a 37 ◦ C durant 24 h, el sobrenedant de reacció es va separar mitjançant cromatografia en columna amb resina macroporosa (MCI GEL CHP) després de centrifugar a 12, 000 × g durant 30 min. La fase mòbil va ser una elució en gradient de 100 per cent d'aigua a 100 per cent de metanol. Cada fracció es va analitzar per HPLC-UV. Les fraccions que contenien només productes dirigits es van evaporar a sequedat a pressió reduïda i es van caracteritzar per espectroscòpia de ressonància magnètica nuclear (RMN) 1H i espectroscòpia de RMN 13C.

2.9. Acoblament molecular i mutagènesi dirigida al lloc de CtUGT1

El model proteic deCtUGT1es va establir mitjançant SWISS-MODEL [21–25]. L'estructura cristal·lina de la glicosil transferasa de Medicago truncatula UGT85H2 (PDB ID 2PQ6) es va escollir com a estructura de plantilla [26]. El model establert va ser avaluat per VERIFY-3D [27,28]. Auto-Dock Vina es va utilitzar per a estudis d'acoblament molecular [29]. L'estructura cristal·lina d'UGT74F2 [30], una glicosiltransferasa d'Arabidopsis thaliana, en complex amb el lligand UDP i l'àcid salicílic (PDB ID 5U6M) es va utilitzar com a estructura de control per a l'anàlisi de butxaca donant sucre i butxaca acceptor de sucre, respectivament . Es van utilitzar les eines Auto-Dock-Tools 1.5.6 de MGLTools (eines de laboratori de gràfics moleculars) per preparar l'UDPG donant de sucre i el substrat 1, 2 per a l'acoblament molecular. Les cadenes laterals de residus al voltant de la cavitat del lloc actiu es van flexibilitzar i els enllaços giratoris dels lligands es van deixar lliures per girar. La posició millor valorada segons el model d'acoblament Vina amb la més alta afinitat (kcat/mol) es va sotmetre a anàlisi visual mitjançant el programari PyMOL 2.0.

Per a investigacions de mutagènesi, la seqüència optimitzada del gen deCtUGT1(Nota de dades suplementàries 2) es va sintetitzar i provar com a tipus salvatge. Mutagènesi dirigida al lloc de laCtUGT1es va realitzar mitjançant el sistema de mutagènesi ràpida (TransGen Biotech). Els mutants es van amplificar a partir de la plantilla del gen optimitzat que s'ha construït al vector pET-28a través dels primers específics que es mostren a la taula S1. Els mutants construïts es van verificar per PCR i seqüenciació abans de ser transformats en E. coli (DE3) per a l'expressió heteròloga. La purificació de proteïnes i les reaccions enzimàtiques es van realitzar i analitzar tal com es descriu anteriorment.

3. Resultats i discussió

3.1. Clonació d'ADNc de longitud completa del gen CtUGT1 deCistanche tubulosa

Cistanche tubulosa(L.) (RouCongRong) és una herba medicinal tradicional xinesa que produeix una gran varietat de glucòsids naturals bioactius. Hi hauria d'haver un nombre considerable de nous gens de glicosiltransferases que hi hagués al seu genoma. Per buscar noves glicosiltransferases amb activitats de catàlisi interessants, es va dissenyar un imprimador degenerat per a 3′-RACE basat en el motiu PSPG conservat per clonar UGT permissius deCistanche tubulosa. La seqüència d'extrem 3' obtinguda es va analitzar encara més mitjançant una explosió NCBI i es va dissenyar l'encebador específic per a 5'-RACE a partir de la seqüència obtinguda. Els extrems d'ADNc de 5' amplificats i els extrems d'ADNc de 3' es van empalmar i la longitud completa delCtUGT1es va obtenir una seqüència, que inclou 1739 nucleòtids (Fig. S3) i es va enumerar a les dades suplementàries Nota 3. Posteriorment, un marc de lectura obert (ORF) deCtUGT1va ser trobat per les eines NCBI ORF Finder i la seqüència de codificació de 1482 pb es va clonar amb èxit mitjançant l'amplificació RT-PCR mitjançant primers específics a la taula S1. La seqüència d'ADNc de CtUGT1 s'ha enviat a NCBI (núm. d'accés MW629113).

3.2. Anàlisi de seqüències i expressió heteròloga de CtUGT1

ElCtUGT1S'esperava que el gen codificava una proteïna de 493 residus d'aminoàcids amb una massa molecular estimada de 55,78 kDa. L'explosió NCBI va revelar que la seqüència de proteïnes deduïda deCtUGT1comparteix la identitat més alta (76,39%) amb els enzims semblants a UGT86A1-. Les funcions bioquímiques d'aquest tipus d'enzims no s'han caracteritzat completament. Es preveu que puguin estar implicats en l'adaptació de les plantes a l'estrès abiòtic. L'alineació de les seqüències d'aminoàcids de CtUGT1 i altres glicosiltransferases vegetals es mostra a la figura S4.

Els 44 residus altament conservats del motiu PSPG es van trobar al C-terminal deCtUGT1. Dins de la caixa PSPG, es va localitzar una seqüència peptídica de HCGWNS a l'aminoàcid 373, que s'ha detectat en el 95 per cent de totes les glicosiltransferases [31]. El residu final del motiu PSPG va ser la glutamina, la qual cosa va indicar que aquest enzim tendeix a utilitzar UDPG com a donant de sucre [32] (Fig. S4). L'arbre filogenètic es va construir a partir de les seqüències polipeptídiques previstes deCtUGT1i diferents tipus de glicosiltransferases d'origen vegetal que van estar implicades en la biosíntesi de diversos metabòlits secundaris. Fins ara, la majoria de les glicosiltransferases informades de les plantes reconeixien els flavonoides com els seus substrats, com ara les flavones 7-O-glicosiltransferases, flavonoides 3-O-glucosiltransferases, isoflavones 7-O-glicosiltransferases i calcona glicosiltransferases. Els resultats de l'anàlisi filogenètica ho van demostrarCtUGT1no s'ha agrupat en el clade dels flavonoides GT. En canvi, es troba al costat de UGT74T1 i UGT74S1 (lignan glicosiltransferases de Linum usitatissimum) i NtGT2 (una cumarina glicosiltransferasa de Nicotiana tabacum), cosa que indicava queCtUGT1pot tenir algunes noves activitats de catàlisi cap a substrats fenilpropanoides (Fig. 1), sobretot tenint en compte que només s'han identificat funcionalment membres limitats que pertanyen a aquests clades.

Per revelar encara més la seva activitat de catàlisi, elCtUGT1La seqüència es va expressar sota el control del promotor T7 lac a les cèl·lules de E. coli Transetta (DE3) com a proteïna de fusió marcada amb His6-. El recombinant marcat amb HisCtUGT1es va purificar de manera eficient fins a l'homogeneïtat mitjançant cromatografia d'afinitat Ni-NTA. El pes molecular del CtUGT1 recombinant purificat era d'aproximadament 55 kDa (Fig. S5), que és coherent amb la massa molecular prevista.

3.3. Especificitat del substrat acceptor in vitro de CtUGT1

Per provar l'activitat de glicosilació deCtUGT1, es van realitzar assajos enzimàtics in vitro. UDPG es va utilitzar com a donant de sucre. Els acceptors de sucre es van seleccionar en funció de diferents preocupacions. En primer lloc, elCtUGT1es va clonar el genCistanche tubulosaels components químics principals dels quals són els PhG. Per comprovar siCtUGT1està implicat en la biosíntesi de PhG, les aglicones comunes dels PhGCistanche tubulosacom el tirosol (NP1, Fig. S2) i el salidroside (NP2, Fig. S2) es van seleccionar primer com a substrats. Malauradament, les anàlisis d'HPLC i HRESI-MS no van trobar cap producte glicosilat, cosa que va indicar queCtUGT1pot no estar implicat en la biosíntesi de PhG.

En segon lloc, basant-nos en l'alineació de la seqüència i els resultats de l'anàlisi filogenètica (Fig. 1),CtUGT1estava relacionat filogenèticament amb les glicosiltransferases lignanoides i cumarines, la qual cosa va suggerir queCtUGT1és probablement una glicosiltransferasa fenilpropanoide. Per verificar aquesta predicció, es van provar tres substrats de cumarina 1, 2 i 3 juntament amb un substrat lignanoide magnolol NP17 com a acceptors de sucre, respectivament. Es van utilitzar enzims inactivats per calor (100 ◦ C, 10 min) com a control negatiu. L'anàlisi HPLC-HRESI-MS de reaccions utilitzant NP17 com a substrat no va trobar cap producte. Per contra,CtUGT1va mostrar capacitats de glucosilació evidents contra els substrats de cumarina provats (1,2,3). Utilitzant el substrat 1 com a exemple, tal com es mostra a la figura 2A, es va produir un nou pic (1a) amb un temps de retenció reduït (11,46 min) en comparació amb el del substrat 1 (19,75 min).CtUGT1amb un rendiment del 37,78 per cent. El seu espectre d'absorció UV correspon a 1. L'espectre HRESI-MS va mostrar que el pic 1a mostrava un [M més H] més a m/z 325,1029, i un [M més Na] més a m/z 347,0710 (calc. 347,0737 per a C15H16O8Na). ) amb la fórmula prevista de C15H16O8, que era 162 amu més gran que la d'1 i coherent amb la fórmula teòrica d'un producte glucosilat (Fig. 2A). De la mateixa manera, el producte glucosilat del substrat 2 (14,21 min, Fig. 2B) i 3 (21,92 min, Fig. 2C) també es va trobar en el temps de retenció de 10,85 min i 13,80 min, amb la taxa de conversió del 22,03 per cent i 68,67 per cent. , respectivament. La massa molecular dels productes va coincidir exactament amb la massa calculada de productes glucosilats, cosa que ho va confirmarCtUGT1podria catalitzar la glucosilació dels compostos de cumarina 1-3 (taula 1).

Posteriorment, tenint en compte que la majoria dels enzims reportats recentment presentaven promiscuïtat de catàlisi in vitro, per explorar encara més l'espectre del substrat deCtUGT1, es van realitzar assaigs enzimàtics expansius cap a diversos compostos pertanyents a diferents tipus de productes naturals, com ara flavonoides, compostos fenòlics, cumarines, estilben, antraquinones, benzofenona, naftalè i iridoide (Figs. S1-S2), utilitzant UDPG com a el donant de sucre. Es va trobar que el substrat de la benzofenona 4,4′-dihidroxi benzofenona (4), el substrat d'isoflavona genisteïna (5) i el substrat d'antraquinona àloe-emodina (6) també podrien ser catalitzats perCtUGT1per formar el corresponent producte glucosilat 4a, 5a, 6a amb més polaritat (Fig. 3). L'anàlisi HRESI-MS va mostrar que els pics d'ions dels productes eren 162 amu més grans que els dels substrats, cosa que suggereix queCtUGT1podria catalitzar la glucosilació d'aquests compostos per formar el seu corresponent producte monoglucòsid. Les taxes de conversió de 4, 5 i 6 van ser del 4,12 per cent, 14,14 per cent i 23,33 per cent, respectivament (taula 1).

La selectivitat dels donants de sucreCtUGT1també es va explorar. A més de l'UDPG, es van provar sis donants més, incloent UDP-N-acetil galactosamina, UDP galactosa, GDP-manosa, GDP-fucosa, àcid UDP-galacturònic i UDP ramnosa, utilitzant substrats 1-6 com a acceptors. Els resultats ho van demostrarCtUGT1seleccionat exclusivament UDPG com a donant de sucre. No es va observar cap producte quan es van provar altres sucres activats (dades no mostrades).

3.4. Propietats bioquímiques i paràmetres cinètics de CtUGT1

Propietats bioquímiques deCtUGT1es van investigar utilitzant 3 com a acceptor de sucre i UDPG com a donant de sucre, tal com s'indica a la figura 4. Activitat de catàlisiCtUGT1es va provar en un rang de temperatura de 4-6 0 ◦C, l'activitat òptima es va detectar a 37 ◦C (Fig. 4A). L'anàlisi de l'activitat enzimàtica entre pH 3.0 i 9.0 va mostrar que el valor de pH òptim es va observar a pH 8,0 (tampó 100 mM KH2PO4-K2HPO4, Fig. 4C). El rendiment del producte de glucosilació 3a va augmentar linealment en 1 h i la taxa de creixement s'anivellava després de 5 h (Fig. 4B). El valor aparent Km deCtUGT1per a 3 era de 218,7 ± 7,176 μM, i el Vmàx era 0.{02255 ± 0,0001796 nmol⋅min− 1⋅ug− 1.

3.5. Preparació enzimàtica i identificació estructural de productes glucosilats

A partir dels resultats dels assaigs enzimàtics,CtUGT1tendeix a ser una glucosiltransferasa específica que podria catalitzar la glucosilació de diferents tipus de productes naturals. La informació HPLC-HR-MS dels productes es va resumir a la taula 1. Entre ells, els substrats de cumarines van mostrar una taxa de conversió considerable. Es va analitzar més a fons l'activitat enzimàtica contra les cumarines. Cal tenir en compte que els tres substrats de cumarina provats són acceptats perCtUGT1tenen un grup hidroxil a la posició C-7, mentre que l'esculetina (2) té un grup hidroxil addicional a la posició C-6. El perfil d'HPLC del producte glucosilat de l'esculetina es mostra a la figura 2. Només es va observar un sol producte, cosa que suggereix que la reacció de glucosilació es va produir regioespecíficament a la posició C-6 o C-7. Per confirmar el lloc de glicosilació, es va identificar el producte 2a en comparació amb els glucòsids autèntics mitjançant anàlisi HPLC-UV/HRESI-MS. Quan s'afegeix l'autèntic glucòsid cichoriin (glucosilat a la posició 7-OH de 2) al sistema de reacció, el pic es va solapar amb 2a, el perfil co-HPLC va confirmar encara més que el producte glicosilat de 2 catalitzat perCtUGT1és la cichoriina [33], que va demostrar que la part de glucosil es va transferir específicament a la posició C7-OH. El producte 1a també es va identificar en comparació amb l'estàndard de referència. Els espectres UV-HPLC juntament amb l'anàlisi co-HPLC (Fig. 2) van revelar que l'estructura química de 1a s'atribuïa com a desnatació [34], que és el producte glucosilat d'1 a la posició C7-OH.

El producte 3a es va preparar a partir d'una reacció a gran escala i es va caracteritzar estructuralment per espectroscòpia HRESA-MS, 1H RMN i 13C RMN (Figs. S13, S14 i Nota 4). En el senyal de RMN 1H, en comparació amb el substrat 3, un senyal d'hidroxil fenòlic a la posició C{{10}} va desaparèixer i el senyal de carboni de C-7 es va desplaçar δ 1.{{25} } ppm al camp alt, mentre que els senyals C{-6 i C{-8 es van desplaçar al camp baix en 13C RMN. Aquestes troballes van confirmar que el residu de glucopiranosil estava unit al grup hidroxil fenòlic a la posició C-7 de 3 [35]. A més, l'espectre de RMN 1H mostrava senyals de protons anomèrics a δH 5.00 (1H, d, J=7.0 Hz); es va indicar que el component del sucre era -D-glucopiranosa. Aquest resultat es va demostrarCtUGT1és una cumarina O-glucosiltransferasa que va catalitzar la glucosilació de la hidroxil cumarina a la posició 7-OH.

3.6. Modelatge d'homologia, acoblament molecular i mutagènesi dirigida al lloc de la proteïna CtUGT1

Les reaccions enzimàtiques extenses ho van revelarCtUGT1podria catalitzar la glucosilació de tres cumarines en el seu producte glucosilat corresponent, i la posició glucosilada es va produir específicament a la posició 7- OH. Identificar els residus clau que van determinar les activitats de catàlisi deCtUGT1, es van realitzar investigacions de modelatge d'homologia, acoblament molecular i mutagènesi dirigida al lloc de CtUGT1. El modelatge molecular homòleg per a CtUGT1 es va establir mitjançant SWISS-MODEL [21–25]. L'estructura cristal·lina de la glicosil transferasa de Medicago truncatula UGT85H2 (PDB ID 2PQ6), determinada a una resolució de 2, 1 Å, va mostrar la puntuació total més alta amb la màxima homologia de seqüència i un valor E baix, es va escollir com a estructura de plantilla [26]. L'avaluació de la racionalitat del model establert es va mostrar a la trama de Ramachandran (Fig. S6), el 88,5 per cent dels residus del model establert es troben a la regió més afavorida. El model d'homologia de CtUGT1 consta de dos plecs similars de tipus Rossmann motius a l'N i C-terminal, respectivament (Fig. 5A). El domini N-terminal té fulles paral·leles de set cadenes al voltant de deu hèlixs. El domini C-terminal conté fulles de sis cadenes flanquejades per nou hèlixs (Fig. 5A, S7).

Per aclarir encara més la butxaca activa deCtUGT1, es va realitzar un acoblament molecular. Com que UGT85H2 només té l'estructura de la forma apo, es va seleccionar un altre homòleg UGT74F2 amb UDP i àcid salicílic com a dos lligands com a plantilla de control. La UDPG es va preparar com a donant de sucre. Es van preparar dos substrats de cumarina 1 i 2 com a acceptors de sucre respectivament. Els llocs d'unió del donant i acceptor de glicosil es van calcular i acoblar per separat, tal com es mostra a la figura 5. Els resultats van indicar que ambdues butxaques d'unió es troben a l'interior de l'escletxa profunda a l'àrea d'interacció del domini N-terminal i C. -domini terminal deCtUGT1i espacialment a prop l'un de l'altre (Fig. 5A). El C-terminal deCtUGT1està implicat principalment en contacte amb el donant de glicosil tal com es descriu a les UGT d'altres plantes, i la majoria dels residus circumdants són hidròfils i molt conservats. Com la típica caixa PSPG, el residu W377 d'aquest motiu podria formar enllaços d'hidrogen amb el grup glucosa de l'UDPG (Fig. 5B); N378 i S379 en aquest motiu podrien formar enllaços d'hidrogen amb el grup difosfat de UDPG (Fig. 5B). A més, segons els resultats de l'acoblament, els residus de W356 i Q359 poden interactuar amb el grup uridina mitjançant la interacció d'enllaç d'hidrogen per estabilitzar el donant a la butxaca activa. Per verificar la funció d'aquests residus clau predits, es van seleccionar un total de 16 llocs i es van sotmetre a mutagènesi d'exploració d'alanina. Les activitats de catàlisi d'aquests mutants es van provar utilitzant els sis substrats positius esmentats anteriorment. Les anàlisis d'HPLC van mostrar que, quan els residus de G18, H19, S295, F296, W356, C357, Q359, H374, G376, W377, N378, S379, E382, Y397 i D398 es van mutar en alanina, l'activitat de la proteïna es va convertir en alanina. totalment perdut cap a tots els substrats provats. Aquests resultats suggereixen que els 16 residus anteriors són els residus clau que van determinar la unió del donant UDPG i l'activitat de glicosilació deCtUGT1.

To identify the crucial residues in the sugar acceptor binding pocket, molecular docking analyses were performed on 1 and 2, respectively. These two substrates have the same coumarin core. 2 have two hydroxyl groups at both C-6 and C-7 position while 1 only has one hydroxyl group at the C-7 position. The overlapped docking results of these two compounds were shown in Fig. 5C. They exhibited almost the same confirmation in the glycosyl acceptor binding pocket (1 in cyan color and 2 in green color). Two hydrogen bonds were observed between the NE2 atom of the imidazole ring of H19 and the OH group of coumarins at positions C-6 (~3.1 Å) and C-7(~3.0 Å) respectively (Fig. 5D). It was calculated that H19 is much closer to the 7-OH group which will make the hydroxyl group at the C-7 position easily to be deprotonated by H19 to form the nucleophilic oxyanion that could attack the C1′ carbon of UDPG to initiate the glycosylation reaction. This may explain why the glycosylation position was preferred to happen at the 7-OH position of coumarins substrates. Besides, it can be seen that H19 is located at the cleft of the two active pockets, and interacts with both the substrate and UDPG (Fig. 5B, C, D). Mutation of His19 to alanine will lead to the complete loss of enzyme activity, which confirmed the irreplaceable role of H19 that plays a role as the crucial catalysis basis, meanwhile, stabilizing the UDPG donor. Alanine scanning mutagenesis of some other sites in the acceptor binding pocket also resulted in no detectable enzyme activity, including Y16, L213, F296, or significantly decrease of the enzyme activity (>44 per cent) com ara V14, V132, E153, T212 i I209 (Fig. S8). Es preveu que aquests residus hidrofòbics que envolten l'anell aromàtic podrien formar interaccions de van der Waals amb el substrat de la butxaca d'unió.

4. Discussió

La glicosilació és un dels passos de modificació més importants en les vies de biosíntesi de molts metabòlits secundaris. La glicosilació podria augmentar la biodisponibilitat dels productes naturals millorant la seva solubilitat en aigua i reduint-ne la toxicitat. La cumarina es considera la forma més simple dins d'una gran classe de substàncies fenòliques d'origen natural construïdes a partir d'un anell de pirona fusionat amb un anell de benzè. Tant els compostos naturals com els sintètics a base de cumarina han cridat molta atenció dels químics medicinals i dels científics del disseny de fàrmacs com a conseqüència de les seves diverses propietats farmacològiques i biològiques [36]. Una modificació addicional glicosilada de les cumarines podria ajudar a enriquir la diversitat estructural d'aquests compostos i també millorar la seva solubilitat i biodisponibilitat. A les plantes, aquest procés de glicosilació és catalitzat per la UDP-glicosiltransferasa. Tot i que s'han identificat múltiples UGT de diferents plantes, fins ara, la majoria de les UGT informades estaven implicades en la modificació glicosilada dels flavonoides. Només es va informar que les UGT limitades podien acceptar cumarines com a substrats. En aquest estudi, un nou gen de la glicosiltransferasaCtUGT1va ser clonat a partir de l'herba tradicional xinesaCistanche tubulosa. Els resultats de l'alineació de seqüències i de l'anàlisi filogenètica ho van mostrarCtUGT1està filogenèticament llunyà de la majoria de les UGT flavonoides informades i molt a prop dels UGT fenilpropanoides. Extensos assaigs enzimàtics van revelar que CtUGT1 no podia catalitzar la glicosilació de compostos de feniletanol per formar PhG, que és el component químic principal deCistanche tubulosa. En canvi, podria reconèixer les cumarines com els seus substrats i conduir la reacció de glicosilació. L'elucidació de l'estructura dels productes va mostrar que el lloc de glicosilació catalitzat perCtUGT1regioespecíficament va passar a la posició C7-OH de les cumarines. Mitjançant CtUGT1, es van sintetitzar i identificar estructuralment amb èxit tres glicòsids de cumarina, inclòs la desnatació (1a), la cichoriina (2a) i el 4- glucòsid de metilumbel·liferil (3a). Tots aquests tres compostos es van informar com a molècules farmacèuticament actives. Per exemple, s'ha considerat que 1a posseeix diverses activitats farmacològiques, inclosa l'activitat renoprotectora, propietats antiinflamatòries, anticancerígenes i antiamebianes [37]. 2a va mostrar una alta activitat antibacteriana contra alguns bacteris Gram-positius com Bacillus cereus i Staphylococcus aureus [38]. 3a pot ajudar les plantes a millorar les seves capacitats de resposta a substàncies químiques i toxines [39].

A més de les cumarines, amplis assaigs enzimàtics ho van trobarCtUGT1també va mostrar una activitat de glucosilació observable cap al substrat de benzofenona 4, el substrat d'isoflavona 5 i el substrat d'antraquinona 6, cosa que va indicar que CtUGT1 té certa tolerància al substrat. No obstant,CtUGT1no podria catalitzar la biosíntesi dels components dels glucòsidsCistanche tubulosacom ara glicòsids feniletanoides (PhG), glicòsids lignanoides i glicòsids iridoides. A més, segons les investigacions anteriors, no es va aïllar cap glicòsid de cumarinaCistanche tubulosa. Així doncs, la funció in vivo deCtUGT1encara s'ha d'explorar més. L'activitat de glucosilació de CtUGT1 cap a substrats de cumarina fa que aquest enzim sigui una eina útil per a la modificació de la glicosilació enzimàtica de les cumarines i també va indicar que els enzims metabòlics secundaris de les plantes podrien realitzar activitats de catàlisi inestimables que van molt més enllà de les seves funcions natives.

Declaració d'Interès Concurrent

Els autors declaren que no hi ha conflictes d'interessos.

Reconeixement

Aquest treball va comptar amb el suport econòmic de Beijing Natural Science Foundation (subvenció núm. 7192112); Programa de patrocini de joves científics d'elit per CAST (subvenció núm. CACM− 2018− QNRC1− 02); Fundació Nacional de Ciències Naturals de la Xina (subvenció núm. 81402809); Fons de beques estatals del Consell de beques de la Xina (subvenció núm. 201906555010) i Fundació científica per a joves becats d'elit de la Universitat de Medicina Xinesa de Beijing (subvenció núm. 2018-JYB-XJQ006).

Annex A. Dades complementàries

Podeu trobar dades addicionals a aquest article en línia a https://doi. org/10.1016/j.fitote.2021.104995.

De: ' Clonació molecular i caracterització bioquímica d'una nova glicosiltransferasa cumarinaCtUGT1des deCistanche tubulosa'perXiping Xu, et al

---Fitoterapia 153 (2021) 104995 https://doi.org/10.1016/j.fitote.2021.104995

Referències

[1] Y. Li, S. Baldauf, EK Lim, DJ Bowles, Phylogenetic analysis of the UDPglycosyltransferase multigene family of Arabidopsis thaliana, J. Biol. Chem. 276 (2001) 4338–4343, https://doi.org/10.1074/jbc.M007447200.
[2] LF Mackenzie, Q. Wang, RAJ Warren, SG Withers, Glycosynthases: mutant glycosidases for oligosacharide synthesis, J. Am. Chem. Soc. 120 (1998) 5583–5584, https://doi.org/10.1021/ja980833d.
[3] CJ Thibodeaux, CE Melancon, HW Liu, Biosíntesi de sucre inusual i glicodiversificació de productes naturals, Nature 446 (2007) 1008–1016, https://doi.org/ 10.1038/nature05814.
[4] Y. Ji, B. Li, M. Qiao, J. Li, H. Xu, L. Zhang, X. Zhang, Advances on the in vivo and in vitro glycosylations of flavonoids, Appl. Microbiol. Biotecnologia. 104 (2020) 6587–6600, https://doi.org/10.1007/s00253-020-10667-z.
[5] T. Koeduka, Y. Ueyama, S. Kitajima, T. Ohnishi, K. Matsui, Molecular cloning and characterization of UDP-glucose: volatile benzenoid/phenylpropanoid glucosyltransferase in petunia flowers, J. Plant Physiol. 252 (2020) 153245, https://doi.org/10.1016/j.jplph.2020.153245.
[6] S. Rahimi, J. Kim, I. Mijakovic, KH Jung, G. Choi, SC Kim, YJ Kim, Triterpenoid-biosynthetic UDP-glycosyltransferases from plants, Biotechnol. Adv. 37 (2019) 107394, https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2019.04.016.
[7] G. Singh, YV Dhar, MH Asif, P. Misra, Exploring the functional signification of sterol glycosyltransferase enzimes, Prog. Lipid Res. 69 (2018) 1–10, https://doi. org/10.1016/j.plipres.2017.11.001.
[8] KF McCue, PV Allen, LV Shepherd, A. Blake, J. Whitworth, MM Maccree, DR Rockhold, D. Stewart, HV Davies, WR Belknap, The primary in vivo steroidal alcaloid glucosyltransferase from potato, Phytochemistry. 67 (2006) 1590–1597, https://doi.org/10.1016/j.phytochem.
[9] J. Yu, L. Wang, RL Walzem, EG Miller, LM Pike, BS Patil, Activitat antioxidant de limonoides cítrics, flavonoides i cumarines, J. Agric. Química dels Aliments. 53 (2005) 2009–2014, https://doi.org/10.1021/jf0484632.
[10] HJ Cho, SG Jeong, JE Park, JA Han, HR Kang, D. Lee, MJ Song, Activitat antiviral de l'angelicina contra els virus gammaherpes, Antivir. Res. 100 (2013) 75–83, https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2013.07.009.
[11] Z. Xu, Q. Chen, Y. Zhang, C. Liang, Derivats a base de cumarina amb una potent activitat anti-VIH, Fitoterapia. 150 (2021) 104863, https://doi.org/10.1016/j. fitote.2021.104863.
[12] AT Mossa, TM Heikal, M. Belaiba, EG Raoelison, H. Ferhout, J. Bouajila, Activitat antioxidant i potencial hepatoprotector de Cedrelopsis grevei sobre estrès oxidatiu induït per cipermetrina i dany hepàtic en ratolins mascles, complement BMC. Altern. Med. 15 (2015) 251, https://doi.org/10.1186/s12906-015-0740-2.
[13] Y. Bansal, P. Sethi, G. Bansal, Coumarin: a potential nucleus for anti-inflammatory molecules, Med. Chem. Res. 22 (2013) 3049–3060, https://doi.org/10.1007/s00044-012-0321-6.
[14] M. Kumar, R. Singla, J. Dandriyal, V. Jaitak, Derivats de la cumarina com a agents anticancerígens per a la teràpia del càncer de pulmó: una revisió, Anti Cancer Agents Med. Chem. 18 (2018) 964–984, https://doi.org/10.2174/1871520618666171229185926.
[15] A. Stefanachi, F. Leonetti, L. Pisani, M. Catto, A. Carotti, Coumarin: a natural, privileged and versatile scaffold for bioactive compounds, Molecules 23 (2018) 250, https://doi.org /10.3390/molecules23020250.
[16] T. Taguchi, N. Ubukata, H. Hayashida, M. Yamamoto, Okazaki, clonació i caracterització d'una glucosiltransferasa que reacciona sobre el 7-grup hidroxil del flavonol i el 3-grup hidroxil de la cumarina de cèl·lules de tabac, Arch. Bioquímica. Biofísica. 420 (2003) 95–102, https://doi.org/10.1016/j.abb.2003.09.027.
[17] L. Zhou, T. Tian, ​​B. Xue, L. Song, L. Liu, R. Yu, Biosynthesis of cumarin glycosides by transgenic hair arrels de Polygonum multiflorum, Biosci. Biotecnologia. Bioquímica. 76 (2012) 1008–1010, https://doi.org/10.1271/bbb.110347.
[18] H. Kanoh, M. Kawauchi, M. Kuroyanagi, T. Arima, Clonació molecular i caracterització de la cumarina glucosiltransferasa en arrels peludes de Pharbitis nil (Ipomoea nil), Cult de teixits vegetals. Lett. 31 (2014) 21–28, https://doi.org/10.5511/plantbiotechnology.13.1203a.
[19] JB He, P. Zhao, ZM Hu, S. Liu, Y. Kuang, M. Zhang, B. Li, CH Yun, X. Qiao, M. Ye, Caracterització molecular i estructural d'una Cglicosiltransferasa promiscua de Trollius Chinensis, Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 58 (2019) 11513–11520, https://doi.org/10.1002/anie.201905505.
[20] S. Kumar, G. Stecher, K. Tamura, MEGA7: anàlisi de genètica evolutiva molecular versió 7.0 per a conjunts de dades més grans, Mol. Biol. Evol. 33 (2016) 1870–1874, https://doi. org/10.1093/molbev/msw054.
[21] A. Waterhouse, M. Bertoni, S. Bienert, G. Studer, G. Tauriello, R. Gumienny, FT Heer, TAP de Beer, C. Rempfer, L. Bordoli, R. Lepore, T. Schwede, SWISS-MODEL: modelització d'homologia d'estructures i complexos proteics, Nucleic Acids Res. 46 (2018) W296–W303, https://doi.org/10.1093/nar/gky427.
[22] N. Guex, MC Peitsch, T. Schwede, Modelatge automatitzat d'estructura de proteïnes comparada amb SWISS-MODEL i Swiss-Pdb viewer: a historical perspective, Electrophoresis 30 (2009) S162–S173, https://doi.org/ 10.1002/elps.200900140.
[23] S. Bienert, A. Waterhouse, TAP de Beer, G. Tauriello, G. Studer, L. Bordoli, T. Schwede, The SWISS-MODEL repository-new features and functionality, Nucleic Acids Res. 45 (2017) D313–D319, https://doi.org/10.1093/nar/gkw1132.
[24] G. Studer, C. Rempfer, AM Waterhouse, G. Gumienny, J. Haas, T. Schwede, QMEANDisCo-distance constraints apply on model quality estimation, Bioinformàtica. 36 (2020) 1765–1771, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btz828.
[25] M. Bertoni, F. Kiefer, M. Biasini, L. Bordoli, T. Schwede, Modeling protein quaternary structure of homo- and hetero-oligomers beyond binary interactions by homology, Sci. Rep. 7 (2017) 10480, https://doi.org/10.1038/s41598-017-09654-8.
[26] L. Li, LV Modolo, LL Escamilla-Trevino, L. Achnine, RA Dixon, X. Wang, l'estructura cristal·lina de Medicago truncatula UGT85H2-informació sobre la base estructural d'un (iso)flavonoide multifuncional glicosiltransferasa, J. Mol. Biol. 370 (2007) 951–963, https://doi.org/10.1016/j.jmb.2007.05.036.
[27] R. Lüthy, JU Bowie, D. Eisenberg, Assessment of protein models with three-dimensional profiles, Nature 356 (1992) 83–85, https://doi.org/10.1038/ 356083a0.
[28] RA Laskowski, MW MacArthur, DS Moss, JM Thornton, PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures, J. Appl. Crystallogr. 26 (1993) 283–291, https://doi.org/10.1107/S0907444998006684.
[29] O. Trott, AJ Olson, AutoDock Vina: millora de la velocitat i la precisió de l'acoblament amb una nova funció de puntuació, optimització eficient i multiprocés, J. Comput. Chem. 31 (2010) 455–461, https://doi.org/10.1002/jcc.21334.
[30] AM George Thompson, CV Iancu, KE Neet, JV Dean, JY Choe, Differences in salicylic acid glucose conjugations by UGT74F1 and UGT74F2 from Arabidopsis thaliana, Sci. Rep. 7 (2017) 46629, https://doi.org/10.1038/srep46629.
[31] T. Vogt, P. Jones, Glycosyltransferases in plant natural product synthesis: characterization of a supergene family, Trends Plant Sci. 5 (2000) 380–386, https://doi.org/10.1016/s1360-1385(00)01720-9.
[32] A. Kubo, Y. Arai, S. Nagashima, T. Yoshikawa, Alteració de les especificitats dels donants de sucre de les glicosiltransferases vegetals per una mutació puntual, Arch. Bioquímica. Biofísica. 429 (2004) 198–203, https://doi.org/10.1016/j. abb.2004.06.021.
[33] H. Kanho, S. Yaoya, T. Itani, T. Nakane, N. Kawahara, Y. Takase, K. Masuda, M. Kuroyanagi, Glucosylation of phenolic compounds by Pharbitis nil hairy roots: I. Glucosylation of coumarin i derivats de flavones, Biosci. Biotecnologia. Bioquímica. 68 (2004) 2032–2039, https://doi.org/10.1271/bbb.68.2032.
[34] J. Bjerre, EH Nielsen, M. Bols, Hydrolysis of toxic natural glucosides catalized by cyclodextrine dicyanohydrins, Eur. J. Org. Chem. 2008 (2010) 745–752, HTTPS:// doi.org/10.1002/ejoc.200700954.
[35] B. Xue, LB Zhou, JW Liu, RM Yu, Biotransformation of hydroxycoumarin derivats by cultivated suspension cells of Catharanthus roseus, Pharmazie 67 (2012) 467–471, https://doi.org/10.1691/ph.2012.1741 .
[36] T. Al-Warhi, A. Sabt, EB Elkaeed, WM Eldehna, Recent advancements of cumarin-based anticancer agents: an up-to-date review, Bioorg. Chem. 103 (2020) 104163, https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2020.104163.
[37] X. Li, MY Gruber, DD Hegedus, DJ Lydiate, MJ Gao, Efectes d'un derivat de la cumarina, 4-metilumbel·liferona, sobre la germinació de llavors i l'establiment de plàntules a Arabidopsis, J. Chem. Ecol. 37 (2011) 880–890, https://doi.org/10.1007/s10886-011-9987-3.
[38] K. Xu, ZM Feng, YN Yang, JS Jiang, PC Zhang, vuit nous sesquiterpenoides de tipus eudesman i eremophilane d'Atractylodes lancea, Fitoterapia. 114 (2016) 115–121, https://doi.org/10.1016/j.fitote.2016.08.017.
[39] Y. Lou, H. Wu, J. Zheng, X. He, Z. Wu, X. Lu, Y. Qiu, Determinació i estudi farmacocinètic de la desnatació per UHPLC-MS/MS en plasma de rata, J. Pharm . Biomed. Anal. 179 (2020) 112969, https://doi.org/10.1016/j.jpba.2019.112969.