Els règims de vacunació multicomponent de Chlamydia Trachomatis indueixen respostes d'anticossos i cèl·lules T i acceleren l'eliminació de la infecció en un model de primats no humans Ⅱ

Materials i mètodes

Antígens i adjuvants de la vacuna

En aquest estudi es van utilitzar diferents antígens i adjuvants de la vacuna: l'antigen de la vacuna CTH522, basat en MOMP (11) es va administrar per via intramuscular (IM) amb adjuvant CAF01 (42) o adjuvant d'hidròxid d'alumini (AlOH), o per via intranasal ( IN) sense adjuvant. La vacuna d'ADN plasmidi, pcDNA3.1-MOMP, es va fer mitjançant la clonació de MOMP de consens al vector plasmidi pcDNA3.1 (14) i es va administrar per via intradèrmica (ID) amb electroporació (EP) a la part posterior. La vacuna recombinant del serotip 5 de l'adenovirus humà (rHuAd5) que expressava MOMP (HuAd5-MOMP) es va fer mitjançant la recombinació homòloga de MOMP de consens (AAC45154.1) en un vector plasmidi HuAd5 pAL1112 eliminat amb E1 i E2 i administrada per via intramuscular (14) . Vacuna modificada de la vacuna Ankara-MOMP feta perrecombinant consens MOMP(AAC45154.1) al plasmidi p3186 i al vector MVA atenuat (14), i s'administra a través delvia intramuscular.

Feu clic aquí per obtenir Cistanche per a antiinflamatoris

C. trachomatis serovar D

Chlamydia trachomatis serovar D (Ct SvD; UW{{0}}/Cx, ATCC® VR{-885™) es va obtenir de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) i es va propagar a HeLa{ {2}} cèl·lules, collides i purificades tal com descriuen Caldwell et al. (43). L'estoc de C. trachomatis SvD es va emmagatzemar a -80 grau en sacarosa 0,2 M, fosfat sòdic 20 mM (pH 7,4) i àcid glutàmic (SPG) 5 mM i es va determinar la concentració d'unitats formadores d'inclusions (IFU) en Cèl·lules HeLa-229 i cèl·lules McCoy.

Primats no humans

Trenta macacs cynomolgus (Macaca fascicularis) amb un pes de 3 a 5 kg es van incloure a l'estudi realitzat a les instal·lacions NHP de nivell de bioseguretat 3 (ABSL3) de l'IDMIT ("Models de malalties infeccioses i teràpies innovadores" al CEA "Commissariat à l'Energie Atomique". Fontenay-aux-Roses, França; acreditació núm. #D92- 032-02). Els protocols van ser aprovats pel comitè d'ètica institucional "Comité d'Ethique en Experimentation Animale du Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives" (CEtEA #44) amb el número de declaració A14-026. L'estudi va ser autoritzat pel "Ministeri d'Investigació, Innovació i Educació" amb el número de registre APAFIS#720-201505281237660. Tots els animals van ser negatius per a SIV, SHIV, STLV (virus limfotròpic simià), virus de l'herpes B, filovirus, SRV-1, SRV-2 abans de l'estudi i es va confirmar que eren seronegatius per a la infecció per Chlamydia. Tots els procediments experimentals es van dur a terme segons les directrius europees per a la cura dels animals ("Journal Officiel de l'Union Européenne", directiva 2010/63/UE, 22 de setembre de 2010).

Protocols de vacunació

Els 30 macacs es van dividir aleatòriament en 6 grups amb 5 animals cadascun. Els diferents règims d'impuls de vacunació per als 6 grups s'il·lustren amb detall a la figura 1. Durant totes les vacunacions, els macacs van ser sedats amb clorhidrat de ketamina (10 mg/kg de pes corporal per via intramuscular). CTH522 (85 µg per animal) es va administrar per via intramuscular (IM) amb adjuvant CAF{{20}}1 (625 µg/125 µg) o adjuvant AlOH (0,425 mg). ), tal com es mostra a la figura 1. Les immunitzacions IM es van realitzar en un volum de 0,6 ml a la cuixa dreta (M. quadriceps) de l'animal. Les immunitzacions intranasals (IN) CTH522 (30 µg per animal) es van realitzar amb un dispositiu Vaxinator connectat a una xeringa d'1 ml amb dues administracions successives de 0,25 ml, una a cada fossa nasal. La vacuna DNA-MOMP es va administrar per via intradèrmica (ID) amb electroporació (EP) a la pell de l'esquena. Es van injectar 6 volums repetits de 0,1 ml ID (en total 1 mg) seguits d'EP mitjançant el sistema Nepagen™ (configuració: 6 polsos quadrats de 10 ms amb intervals de 90 ms a 110 V, (300- 700mA)) . La vacuna hAd5-MOMP es va administrar IM amb una dosi de 1011 partícules virals en 1 ml per animal. La vacuna MVA-MOMP es va administrar IM amb una dosi de 4*108 PFU per animal en 0,5 ml de volum**. El grup naïf no va rebre cap vacuna i es va considerar que era el grup control.

Recollida de mostres

Durant tots els procediments de mostreig, els macacos van ser sedats amb clorhidrat de ketamina (10 mg/kg de pes corporal IM). La sang es va recollir mitjançant venopunció femoral a les setmanes 0, 2, 4, 6, 8, 10, 16, 18, 20, 22, 24. El líquid cervicovaginal per a la detecció d'anticossos es va recollir amb Weck-Cel®spears (Medtronic Ophthalmics, Jacksonville, FL. , EUA) a la setmana 4, 8, 16, 18, 20, 22 i 24. Les mostres cervicovaginals per a la detecció de càrrega de clamídia es van recollir amb hisops regulars flatlock (Mast Diagnostic - ref.: 552C/ 10). Després del contacte amb la mucosa vagino-cervical, el hisop es va col·locar en un vial que contenia medi UTM-RT (Mast Diagnostic – ref.: 330C/6) i es va mantenir en gel.

Infecció per desafiament vaginal amb 5*107 IFU de C. trachomatis SvD

Els animals van ser sedats amb clorhidrat de ketamina (10 mg/kg IM), col·locats en decúbit ventral amb els malucs elevats i 1 ml d'inòcul es va aplicar traumàticament directament a la mucosa vaginal a la transició vagino-cervical amb una xeringa d'1 ml. Es va donar una dosi de 5 * 107 IFU a cada animal. L'animal es va permetre romandre en decúbit ventral amb els malucs elevats durant un curt temps després de la inoculació.

Assaig immunoabsorbent lligat a enzims

CTH522anticossos específicses van detectar mostres de sèrum i hisop amb un ELISA indirecte. Les plaques Maxisorp® (NUNC A/S, Roskilde, Dinamarca) es van recobrir amb CTH522 (0,5 µg/ml) durant la nit a 4 graus. Els isotips IgG i IgA es van detectar amb anticossos conjugats amb HRP específics contra IgG de primats no humans (43R-IG02{0HRP, Fitzgerald, Acton, MA, EUA, 1:75).{{10} }}) i IgA (43C-CB1631, Fitzgerald, EUA, 1:50.000). Les reaccions es van visualitzar amb substrat TMB PLUS (KemEnTec, Taastrup, Dinamarca) i es van aturar amb àcid sulfúric 0,5 M. Les plaques es van llegir en un lector ELISA a 450 nm amb correcció a 650 nm. Es va utilitzar un control positiu (sèrum d'un estudi anterior) com a estàndard intern per corregir la variació de placa a placa. Es van executar dos pous sense substrat com a control negatiu a cada placa. Els títols d'anticossos es van calcular com el recíproc de la dilució més alta amb un valor de densitat òptica (OD) superior al tall. El tall es va determinar a partir de la mitjana de la mostra del dia 0 més 2 * SD.

Anàlisi i matriu de pèptids

La matriu de pèptids CTH522 es va dissenyar amb triplicats de pèptids 15mer immobilitzats superposats per 14 aminoàcids que es van imprimir en portaobjectes de vidre funcionalitzats i incubats amb mostres de sèrum per JPT Peptide Technologies, Berlín. Breument, la matriu es va incubar amb mostres de sèrum recollides a la setmana 24 i es van visualitzar complexos de pèptids IgG mitjançant IgG anti-mono de cabra biotinilada i Alexa Fluor® 647 Streptavidin. Les diapositives es van escanejar amb un escàner d'alta resolució a 635 nm i les dades es van informar com a unitats de fluorescència arbitràries. Es va determinar la mitjana dels valors per triplicat, si el coeficient de variació era més gran que 0,5, només es van utilitzar els 2 valors més propers. El 10 per cent del senyal d'intensitat màxima (65.535) es va utilitzar com a tall per aresposta positiva, i als senyals mitjans per sota d'aquest llindar se'ls va assignar un valor corresponent a la meitat del valor del llindar (3277).

Assaig de neutralització in vitro

L'assaig de neutralització in vitro es va realitzar per provar la capacitat dels anticossos sèrics induïts per la vacuna per neutralitzar la infecció per clamídia de cèl·lules HaK in vitro. L'assaig va seguir principalment el protocol descrit anteriorment (44). Primer, es van incubar mostres de sèrum d'animals individuals a 56 graus durant 30 minuts per inactivar el complement. L'estoc de clamídia (SvD, SvE i SvF) es va barrejar i incubar amb dilucions en sèrie de sèrum inactivat de cadascun dels animals vacunats durant 30 minuts i després es va inocular en una monocapa de cèl·lules HaK en plaques de fons pla 96- duplicats. Després de 30 hores d'incubació, es van fixar i visualitzar cèl·lules i inclusions amb sèrum policlonal de conill anti-Ct043 i anticossos secundaris marcats amb fluorescència (Alexa Flour 488, IgG de cabra-anti-conill, A11008, Life Technologies) a la dilució 1:500. . El recompte de les inclusions es va realitzar manualment en 20 camps de visió amb un augment de 40x (microscopi de fluorescència invertida Olympus IX71). La neutralització es va calcular com el percentatge de reducció del nombre mitjà d'IFU en comparació amb un grup de sèrums d'animals del grup control (naïf).

Tinció intracel·lular de citocines PBMC i citometria companya

Les PBMC es van aïllar i ({{0}} x 106) es van tornar a suspendre en 150 µl de medi complet que contenia 0, 2 µg de cada anticòs coestimulador CD28 i CD49b. L'estimulació es va realitzar en 96 pous/plaques utilitzant 2 µM de cada grup de pèptids o SEB (com a control positiu) o medi sol (com a control negatiu). Es va afegir brefeldina A a cada pou a una concentració final de 10 µg/ml i la placa es va incubar a 37 graus C, un 5% de CO2 durant la nit. A continuació, es van rentar les cèl·lules, es van tacar amb un colorant de viabilitat (violeta, colorant reactiu fluorescent, Invitrogen), es van fixar i es van permeabilitzar amb el reactiu BD Cytofifix/Cytoperm. Les mostres de cèl·lules permeabilitzades es van emmagatzemar a -80 grau abans del procediment de tinció. La tinció d'anticossos es va realitzar en un sol pas després de la permeabilització. Tots els usatsanticossoses mostren a la taula 1. Després de 30 minuts d'incubació en gel a la foscor, les cèl·lules es van rentar en tampó BD Perm/Wash. Les cèl·lules es van comptar amb un LSR II (BD) immediatament després del procediment de tinció i es va utilitzar el programari FlowJo per a l'anàlisi de dades.

TAULA 1 Anticossos utilitzats per a la tinció de marcadors de cèl·lules immunitàries i citocines intracel·lulars

Detecció d'ADN de clamídia vaginal per PCR qualitativa

L'assaig Abbott RealTime CT/NG (ABBOTT, Rungis, França) és un assaig in vitro de reacció en cadena de la polimerasa (PCR) per a la detecció directa i qualitativa de l'ADN plasmidi per als genomes CT (C.trachomatis) i NG (N. gonorrhoeae). . L'àcid nucleic es va extreure de mostres d'UTM (medi de transport universal) a M2000SP i es va realitzar l'amplificació a M2000SP, segons les instruccions del fabricant. Els resultats es van expressar com a llindar de cicle (Ct).

Anàlisi estadística

Totes les estadístiques es van realitzar amb el programari GraphPad Prism (versió 8.1.2). Les dades no distribuïdes normalment es van analitzar amb proves no paramètriques; Test de Kruskal-Wallis i proves de comparació múltiple de Dunn per determinar la importància de la diferència entre grups. Les corbes que mostraven el percentatge d'animals negatius per PCR es van comparar amb una prova estadística de Log-Rang (Mantel-Cox). Les comparacions es van considerar estadísticament significatives si el valor de P era < 0.05 (P <0.05). Altres nivells de significació s'indiquen amb asteriscs *P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.

Declaració de disponibilitat de dades

Les contribucions originals presentades a l'estudi s'inclouen a l'article/Material suplementari. Més consultes es poden dirigir a l'autor corresponent.

Declaració ètica

L'estudi animal va ser revisat i aprovat pel "Comité d'Ethique en Expérimentation Animale du Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives" (CEtEA #44) amb el número de declaració A14-026. L'estudi va ser autoritzat pel "Ministeri d'Investigació, Innovació i Educació" amb el número de registre APAFIS#720-201505281237660.

Aportacions dels autors

Experiments ideats i dissenyats: JD, FF, EL, PA, RG, RS. Experiments realitzats: VC, DD, BD, SL, CD, CJ, ND-B, CB, BB, AT. Vacunes produïdes i construccions d'antigen: IR, PM, AO. S'han analitzat les dades: JD, EL, FF, IR, HJ. Redacció i edició de la ponència: JD, EL, FF. Cadascun dels coautors enumerats va fer contribucions substancials al treball mitjançant el disseny i la concepció, i/o l'adquisició, l'anàlisi i la interpretació de les dades. Tots els autors van contribuir a l'article i van aprovar la versió enviada.

Agraïments

Agraïm a la Fondation Dormeur, Vaduz la donació a la Unitat d'Evolució i Transmissió Viral d'instruments de laboratori rellevants per a aquest projecte.

Conflicte d'interessos FF, IR, PA i AWO són ​​coinventors d'una sol·licitud de patent sobre vacunes contra la clamídia [WO2014146663A1]. Tots els drets s'han cedit a Statens Serum Institut, un institut governamental danès sense ànim de lucre. La resta d'autors declaren que la investigació es va dur a terme en absència de cap relació comercial o financera que es pugui interpretar com un potencial conflicte d'interessos.

Nota de l'editor Totes les afirmacions expressades en aquest article són únicament les dels autors i no representen necessàriament les de les seves organitzacions afiliades, ni les de l'editor, els editors i els revisors. Qualsevol producte que pugui ser avaluat en aquest article, o reclamació que pugui fer el seu fabricant, no està garantit ni avalat per l'editor.

Referències

1. Newman L, Rowley J, Vander Hoorn S, Wijesooriya NS, Unemo M, Low N, et al. Estimacions globals de la prevalença i incidència de quatre infeccions de transmissió sexual curables el 2012 basades en una revisió sistemàtica i informes globals. PLoS One (2015) 10(12):e0143304. doi: 10.1371/journal.pone.0143304

2. Longbottom D, Coulter LJ. Clamidiosis animals i implicacions zoonòtiques. J Comp Pathol (2003) 128(4):217–44. doi: 10.1053/jcpa.2002.0629

3. Haggerty CL, Gottlieb SL, Taylor BD, Low N, Xu F, Ness RB. Risc de seqüeles després de la infecció genital per Chlamydia trachomatis en dones. J Infect Dis (2010) 201 Suppl 2:S134–55. doi: 10.1086/652395

4. Dodet B. Barreres, reptes i oportunitats actuals per al desenvolupament de vacunes efectives contra les ITS: punt de vista dels productors de vacunes, empreses biotecnològiques i agències de finançament. Vaccine (2014) 32(14):1624–9. doi: 10.1016/ j.vaccine.2013.08.032

5. Brunham RC, Kuo CC, Cles L, Holmes KK. Correlació de la resposta immune de l'hoste amb la recuperació quantitativa de Chlamydia trachomatis de l'endocèrvix humà. Infect Immun (1983) 39(3):1491–4. doi: 10.1128/iai.39.3.1491- 1494.1983

6. Cotter TW, Meng Q, Shen ZL, Zhang YX, Su H, Caldwell HD. Eficàcia protectora dels principals anticossos monoclonals d'immunoglobulina a (IgA) i IgG específiques de proteïnes de la membrana externa en un model murí d'infecció del tracte genital per Chlamydia trachomatis. Infect Immun (1995) 63(12):4704–14. doi: 10.1128/iai.63.12.4704-4714.1995

7. Johansson M, Schon K, Ward M, Lycke N. Els estudis en ratolins eliminatoris revelen que la protecció contra la clamídia requereix que les cèl·lules TH1 produeixin IFN-gamma: és cert per als humans? Scand J Immunol (1997) 46(6):546–52. doi: 10.1046/j.1365- 3083.1997.d{01-167.x

8. Gondek DC, Olive AJ, Stary G, Starnbach MN. Les cèl·lules T CD4 més són necessàries i suficients per conferir protecció contra la infecció per Chlamydia trachomatis al tracte genital superior murí. J Immunol (2012) 189(5):2441–9. doi: 10.4049/ jimmunol.1103032

9. Armitage CW, O'Meara CP, Harvie MC, Timms P, Wijburg OL, Beagley KW. Avaluació de la IgA secretora intra i extraepitelial en infeccions per clamídia. Immunologia (2014) 143(4):520–30. doi: 10.1111/imm.12317

10. Armitage CW, O'Meara CP, Harvie MC, Timms P, Blumberg RS, Beagley KW. Resultats divergents després de la transcitosi d'IgG dirigida a antígens de clamídia intracel·lulars i extracel·lulars. Immunol Cell Biol (2014) 92(5):417–26. doi: 10.1038/icb.2013.110

11. Olsen AW, Follmann F, Erneholm K, Rosenkrands I, Andersen P. Protecció contra la infecció per Chlamydia trachomatis i els canvis patològics del tracte genital superior per anticossos neutralitzants promoguts per vacuna dirigits a la VD4 de la proteïna principal de la membrana externa. J Infect Dis (2015) 212(6):978–89. doi: 10.1093/infdis/jiv137

12. Nguyen N, Guleed S, Olsen AW, Follmann F, Christensen JP, Dietrich J. Th1/Th17 La immunitat resident en teixits de cèl·lules T augmenta la protecció, però no és necessària en una estratègia de vacuna contra la infecció genital per clamídia trachomatis. Front Immunol (2021) 12:790463. doi: 10.3389/fifimmu.2021.790463

Demana més:

Correu electrònic:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: més 86 15292862950

Afegeix un suplement de cistanche al carretó:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop