Hidrogel de nanozims per a la generació millorada de radicals alquils i una potent teràpia antitumoral†

Radicals alquil (Rc), que no depenen de la generació d'oxigen per provocarestrès cel·lular, s'han aplicat entractament del tumor, però una gran quantitat de glutatió (GSH) a les cèl·lules tumorals reacciona amb els radicals alquil, de manera quereduint el seu efecte antitumoral. En aquest estudi, un sistema millorat de generació de radicals alquil respon allum infraroja properava ser dissenyat. El radical alquil desencadena 2,20 -azobis[2-(2-imidazolin-2-il)propà]-diclorhidrat (AIPH) i l'enzim pirita (FeS2) es van encapsular en hidrogel d'agarosa per preparar l'AIPH–FeS2–sistema d'hidrogel (AFH). FeS2 es pot utilitzar com a agent fototèrmic per convertir l'energia de la llum infraroja propera en energia tèrmica, donant lloc a la dissolució de l'hidrogel. L'AIPH s'indueix simultàniament a produir radicals alquil. FeS2 també es pot utilitzar com aamplificador d'estrès oxidatiuper reduir el contingut intracel·lular de GSH, augmentant així l'efecte terapèutic dels radicals alquil. Finalment, els radicals lliures independents de l'oxigen generats pel sistema AFH sota irradiació làser d'infraroig proper i tractament fototèrmic podenmatar les cèl·lules cancerosesa través de la sinèrgiaoxidació/efecte fototèrmic. El sistema AFH desenvolupat aquí proporciona nous coneixements sobre la millora de l'efecte terapèutic dels radicals alquil.

FEU CLIC AQUÍ PER SABER COM CISTANCHE PER ANTICÀNCER

Introducció

En els darrers anys, els tractaments basats en radicals lliures com la teràpia fotodinàmica, per tant la teràpia no dinàmica, i la teràpia electrodinàmica s'han convertit en opcions populars per al tractament del càncer de mama.1–3 Els estímuls externs (làser, ultrasons, camps elèctrics) afavoreixen la producció. d'espècies reactives d'oxigen (ROS) que indueixen la mort cel·lular causant danys oxidatius greus o disfunció del metabolisme cel·lular.4–6 Malauradament, l'entorn del tumor hipòxic i la ràpida proliferació de cèl·lules tumorals redueixen els resultats terapèutics d'aquests tractaments que depenen de la producció de ROS, especialment en el tractament de tumors sòlids.7–10 Els radicals alquil són un nou tipus de radicals lliures que no depenen de la generació d'oxigen per matar cèl·lules i s'ha demostrat que són efectius en el tractament de tumors en entorns normoxics i hipòxics.11 L'alquil alliberat els radicals poden induir l'apoptosi de les cèl·lules canceroses augmentant l'estrès oxidatiu, donant lloc a danys en els lípids i l'ADN cel·lular. Com a iniciador de radicals lliures típic, el 2,20 -azobis[2-({2-imidazolin{-2-il)propà]-diclorhidrat (AIPH) pot generar radicals alquil a altes temperatures. 12 Ho fa fins i tot en absència d'oxigen. Els radicals lliures generats són tòxics per a les cèl·lules i oxidaran immediatament els elements cel·lulars o interactuaran amb l'oxigen per produir substàncies tòxiques secundàries.13 Fins i tot en un microentorn tumoral hipòxic, l'AIPH pot produir radicals alquil per augmentar l'hidroperòxid lipídic intracel·lular i desencadenar encara més l'apoptosi de les cèl·lules tumorals.14 Tot això indique que Rc és un medicament prometedor per al tractament del càncer.

La llum o la calor s'utilitzen com a estímul extern en la teràpia fototèrmica.15–17 La teràpia fototèrmica (PTT) basada en la irradiació làser d'infrarojos propers (NIR) s'ha utilitzat per prevenir l'agregació de cèl·lules tumorals; es basa en efectes tèrmics locals per eliminar els tumors.18–20 Diversos agents fototèrmics (PTA) com nanocristalls d'or i disulfur de molibdè s'utilitzen en combinació amb AIPH per alliberar radicals alquils en resposta a la irradiació làser infraroja.19,21–23. , el microambient tumoral (TME) sol tenir un alt nivell d'expressió de glutatió (GSH) en tumors sòlids perquè el GSH té un paper important en la resistència a la radioteràpia mitjançant una reacció espontània o una reacció catalitzada per GSH S transferasa amb xenogènic.24,25 A més, com a agent reductor, el GSH pot eliminar directament els radicals alquil.21,26 Això redueix l'eficàcia de les teràpies basades en radicals alquil. El nanoenzim de pirita (FeS2), com a nou nanomaterial fototèrmic, no només té un bon efecte fototèrmic sota la llum NIR, sinó que també té una activitat nanoenzima.27 La nanasa FeS2 ha demostrat una activitat similar a la glutatió oxidasa (GSH OXD), oxidant-se. GSH a glutatió oxidat (GSSG).28 En el TME, es va trobar que l'esgotament de GSH altera l'equilibri REDOX de les cèl·lules i provoca estrès oxidatiu.29 Per tant, s'espera que FeS2 aconsegueixi un bon efecte sinèrgic amb l'AIPH.

Els hidrogels fotoresponsius mínimament invasius s'han popularitzat recentment com a plataforma d'alliberament controlat de fàrmacs.30–32. Els hidrogels es coagulen a mesura que s'injecten al teixit tumoral i serveixen com a dipòsit a llarg termini.33 Aquesta forma tòpica d'administració es pot repetir després d'una sola vegada. injecció. A més, es poden modificar paràmetres com la potència del làser i el temps d'irradiació per canviar la velocitat d'alliberament del fàrmac, ampliant així l'aplicabilitat d'aquest mètode de tractament34,35. Tenint en compte aquests avantatges, es va plantejar la hipòtesi que l'ús d'hidrogels per lliurar FeS2 i AIPH al TME millorarien l'eficàcia de les teràpies basades en radicals lliures.

En aquest estudi, es va dissenyar un mètode que utilitza el lliurament intratumoral d'un hidrogel injectable que conté l'enzim FeS2 i l'iniciador de radicals lliures AIPH. Primer, es va preparar un sistema híbrid d'hidrogel AIPH-FeS2-(AFH) carregant nanopartícules de FeS2 i AIPH en hidrogel d'agarosa. L'hidrogel és sòlid a temperatura ambient i FeS2 i AIPH estan encapsulats dins de la seva matriu. Un cop irradiat per la llum d'infrarojos propers (NIR), FeS2 converteix l'energia lluminosa NIR en energia tèrmica, la qual cosa fa que el sistema AFH s'escalfi, i després l'hidrogel es fon i allibera FeS2 i AIPH. A altes temperatures, l'AIPH es descompon per produir radicals alquil. Posteriorment, l'enzim FeS2, que imita l'activitat de GSH-OXD, redueix el contingut intracel·lular de GSH. La destrucció de GSH promourà l'efecte de destrucció dels radicals alquil. Com que l'AFH pot residir al lloc del tumor durant molt de temps, el sistema AFH pot permetre un control precís sobre l'alliberament de radicals alquil canviant la intensitat del làser i el temps de radiació. Finalment, els radicals lliures independents de l'oxigen generats pel sistema AFH sota irradiació NIR i tractament fototèrmic poden matar de manera sinèrgica les cèl·lules canceroses mitjançant l'oxidació sinèrgica / efecte fototèrmic, i el creixement del tumor durant el cicle de tractament està ben habitat. En resum, el sistema AFH dissenyat aquí amplifica encara més l'efecte terapèutic de l'AIPH canviant l'homeòstasi redox (esquema 1).

Resultats i discussió

Es va utilitzar un hidrogel d'agarosa de baix punt de fusió per preparar un hidrogel compost que contenia FeS2 i AIPH. FeS2 es va barrejar amb una solució aquosa d'agarosa a 60 C i després es va carregar amb l'activador del radical alquil AIPH, seguit d'un refredament ràpid a temperatura ambient. Així, es va formar la matriu d'hidrogel AFH. La microscòpia electrònica de transmissió es va utilitzar per caracteritzar la morfologia de FeS2 (Fig. 1A). El nanoenzim FeS2 va mostrar una morfologia semblant a l'esfera amb una mida mitjana de partícules d'uns 148 nm (Fig. S1†). Els espectres d'absorció UV-vis de FeS2 (Fig. 1B) van mostrar que FeS2 s'absorbia fortament en el rang NIR a 808 nm. Aquesta propietat fa que FeS2 sigui un bon PTA. El rendiment fototèrmic de l'enzim FeS2 a diferents concentracions (0, 25, 50 i 100 mg mL 1 ) es va estudiar irradiant la solució amb un sistema làser de 0, 5 W cm 2 808 nm (Fig. 1C). L'efecte d'escalfament de la solució era directament proporcional a la concentració de FeS2. La temperatura d'una solució de FeS2 de 100 mg mL 1 va augmentar uns 17,5 C en només 5 minuts d'irradiació làser, demostrant el bon rendiment fototèrmic de FeS2. La microscòpia electrònica d'escaneig també va demostrar que l'hidrogel AFH té una xarxa complexa d'estructura de porus i distribució de la mida dels porus (Fig. 1D), cosa que fa que l'hidrogel sigui adequat per a la càrrega de fàrmacs per al lliurament. L'estabilitat fototèrmica també és un criteri important per avaluar la qualitat d'un PTA.36 Es va escalfar una solució de FeS2 de 200 mg mL 1 amb un làser NIR de 808 nm durant 5 minuts, després es va apagar el làser i es va deixar refredar la solució de FeS2. naturalment a temperatura ambient. Aquest procés es va repetir diverses vegades per avaluar l'estabilitat fototèrmica de FeS2 (Fig. 1E). No hi va haver cap canvi evident en la corba d'escalfament de cada cicle fototèrmic, i només es va observar una lleugera diferència en la temperatura màxima aconseguida després de 5 min d'irradiació, verificant l'estabilitat fototèrmica de FeS2. L'anàlisi reològica també va revelar un alt mòdul d'emmagatzematge de l'hidrogel preparat en estat sòlid a temperatura ambient (Fig. 1F). A mesura que augmentava la temperatura, l'hidrogel es va dissoldre i es va dissoldre gradualment i el mòdul d'emmagatzematge va disminuir gradualment. A continuació, es va realitzar un experiment de dissolució fototèrmica a l'hidrogel FeS2. L'AFH solidificat (FeS2 contingut a l'hidrogel) es va col·locar en un plat de vidre que contenia aigua desionitzada. A temperatura ambient, l'hidrogel AFH preparat va mantenir la seva forma solidificada, però després de 10 minuts d'irradiació amb un làser de 808 nm, l'hidrogel es va dissoldre gairebé completament i el nanomaterial FeS2 es va alliberar i es va dissoldre a l'aigua del plat de vidre (Fig. .1G). Una imatge infraroja tèrmica també va confirmar l'augment significatiu de la temperatura de l'AFH durant la irradiació (Fig. 1H). L'espectroscòpia de fotoelectrons de raigs X (XPS) de FeS2 després de la reacció amb hidrogel va mostrar que FeS2 contenia elements Fe i S (Fig. S2†). Com es mostra a la figura S3,† el contingut de GSH va disminuir significativament després de la co-incubació de FeS2 i GSH, té una corba de correlació positiva amb el temps i la concentració. A més, l'activitat semblant a la POD del FeS2 depenia de la mida. Els nanozims amb una mida de 150 nm van mostrar una activitat més gran que els de 280 i 687 nm (Fig. S4†).

A partir de les característiques d'alt rendiment de l'AFH, es van avaluar els seus efectes antitumorals. Inicialment, es va utilitzar el kit de tinció de cèl·lules vives/morts de diacetat de fluoresceïna/iodur de propidi per explorar l'efecte mata de l'hidrogel AFH preparat combinat amb la irradiació NIR. El grup PBS més NIR i el grup només AFH van mostrar una forta fluorescència verda, mentre que l'AIPH gairebé no va mostrar cap efecte mortal (Fig. 2A). Hem preparat hidrogel que només contenia FeS2 (FH) per verificar els resultats relatius dels experiments. L'hidrogel preparat que només contenia FeS2 (FH) combinat amb NIR va tenir un efecte de matança moderat. En particular, el tractament amb AFH més NIR va tenir el millor efecte citotòxic.

La sonda de diacetat de diclorofluoresceïna es va utilitzar per detectar la capacitat de l'AIPH per produir ROS. AIPH va mostrar una capacitat més feble per induir ROS en absència d'irradiació làser, mentre que FH carregat amb FeS2 va mostrar un grau moderat de producció de ROS després de la irradiació NIR (Fig. 2B). La fluorescència verda brillant observada en el grup de tractament AFH més NIR es podria atribuir a l'alliberament de FeS2 i AIPH després de la irradiació làser (Fig. 2C). A més, els grups d'AIPH i AIPH més NIR van mostrar molt poca fluorescència verda (Fig. S5†). L'assaig CCK-8 també va mostrar els mateixos resultats. La viabilitat cel·lular del grup AFH més NIR era d'un 8, 5 per cent, que era significativament diferent de la dels altres grups (Fig. 2D). La temperatura alta promourà la descomposició d'AIPH per produir radicals alquil. Al mateix temps, FeS2 pot exercir activitat GSH-OXD per reduir el GSH intracel·lular. El GSH, com a tripèptid omnipresent que conté tiol, es sintetitza a partir dels seus aminoàcids constituents (àcid glutàmic, cisteïna i glicina) en moltes cèl·lules. El GSH es produeix abundantment en diversos tipus de cèl·lules canceroses. El GSH a les cèl·lules generalment existeix en forma reduïda, que pot reaccionar amb substàncies oxidants com els grups alquil mentre s'oxida a la seva forma oxidada disulde de glutatió (GSSG), reduint així l'efecte antitumoral basat en els radicals lliures.37 L'esgotament del GSH. alterarà l'equilibri redox de les cèl·lules, provocarà estrès oxidatiu i, finalment, conduirà a l'apoptosi cel·lular.38 El reactiu d'Ellman es va utilitzar per provar la capacitat de cada grup d'esgotar GSH. El grup NIR combinat AFH va mostrar la millor capacitat d'esgotament de GSH (Fig. 2E).

Esquema 1 Hidrogel de nanozims per millorar la generació de radicals alquils i una potent teràpia antitumoral

Fig. 1 (A) Imatge TEM de FeS2. (B) Espectre d'absorbància UV-Vis-NIR d'una solució de FeS2. ( C ) Corbes d'escalfament per a les diferents concentracions de solucions de nanopartícules de FeS2 després de la irradiació làser a 808 nm (0.5 W cm 2 ) durant 5 min. (D) Imatge SEM de l'hidrogel. (E) Variació de temperatura d'una solució de FeS2 sota irradiació làser cíclica. (F) Corbes reològiques i de temperatura (vermell i negre, respectivament) per a l'AFH preparat en resposta a la irradiació làser de 0,5 W cm 2 808 nm. (G) La morfologia de l'AFH preparat abans i després d'una irradiació làser de 0, 5 W cm 2 808 nm durant 10 min i (H) imatges tèrmiques d'infrarojos de l'AFH preparat després de la irradiació.

Tenint en compte el seu bon rendiment in vitro com a enzim imitador de PTA i GSH OXD, es va estudiar in vivo l'efecte de l'AFH sobre la conversió NIR de llum a calor. Els ratolins BALB/c es van injectar per via subcutània amb cèl·lules 4T1 per formar tumors. La figura 3A mostra la corba de canvi de temperatura del grup PBS i del grup AFH després d'una irradiació làser NIR de 808 nm 0,5 W cm 2 durant 10 min. La temperatura del grup AFH va augmentar uns 17, 6 C després de la irradiació, mentre que la temperatura del grup PBS gairebé no va augmentar. La temperatura alta pot canviar la humitat de la membrana cel·lular tumoral, augmentant així la permeabilitat de la membrana cel·lular, que al seu torn provoca danys tèrmics a les proteïnes.39,40 Finalment, les cèl·lules canceroses perden la capacitat de proliferar. A continuació, es va avaluar l'activitat antitumoral mediada per AFH en ratolins portadors de tumors 4T1. Els ratolins portadors de tumors es van dividir aleatòriament en cinc grups. El volum del tumor dels ratolins al grup PBS més NIR i al grup AIPH va augmentar ràpidament durant el període de tractament de dues setmanes, i el grup AFH va mostrar un lleuger efecte supressor del tumor (Fig. 3C). Això va ser perquè l'agarosa es va metabolitzar lentament i alguns fàrmacs es van alliberar lentament. El grup AFH més NIR va tenir l'efecte més fort sobre el creixement del tumor. Durant el tractament, el volum del tumor dels ratolins es va suprimir significativament. Després del període de tractament, es van sacrificar els ratolins i es van aïllar i pesar els tumors. Els resultats del pes del tumor eren coherents amb els resultats del volum del tumor (Fig. 3D).

És important destacar que durant tot l'estudi no es van observar canvis en el pes corporal en el grup de tractament, la qual cosa indica que el tractament no va causar cap toxicitat sistèmica significativa als ratolins (Fig. S6†). Aquest resultat és molt encoratjador perquè, tot i que molts materials han mostrat bons resultats experimentals, també van provocar efectes secundaris greus, que dificulten seriosament les seves perspectives clíniques.41,42 20 ,70 - El diacetat de dicloroorescina es va utilitzar per mesurar la intra -generació de ROS tumorals en els ratolins tractats. La tinció es va millorar significativament en els tumors sotmesos a la teràpia combinada d'AFH més NIR (Fig. 3E). La producció millorada de radicals lliures va conduir a un efecte terapèutic millorat en el model animal. Les anàlisis de tinció de TUNEL i Ki-67 es van utilitzar per verificar l'apoptosi i la proliferació cel·lular (Fig. 3E). Els teixits tumorals del grup AFH més NIR eren massivament necròtics sense proliferació significativa.

Fig. 3 (A) Imatges tèrmiques d'infrarojos de tumors després de la irradiació amb làser de 808 nm (0,5 W cm 2 ) durant 10 min en els grups de tractament indicats. (B) Augment de temperatura en ratolins implantats amb tumors 4T1 després d'una irradiació làser de 808 nm (0,5 W cm 2 ) durant 10 min en els grups de tractament indicats. (C) El volum del tumor canvia amb el temps en els grups tractats com s'indica. (D) Valors mitjans de pes tumoral associats als tractaments indicats. (E) Seccions de tumor tenyides de ROS, Ki-67 i TUNEL dels grups de tractament indicats. **P <0,01, ***P <0,005; Prova t de l'estudiant.

Després del tractament, els òrgans vitals (cor, fetge, melsa, pulmó i ronyó) no tenien cap inflamació ni dany. Els índexs hepàtics i renals eren normals (Fig. 4A-D i S7†). Les dades experimentals in vivo completes mostren que la teràpia sinèrgica d'AFH i PTT té bons efectes terapèutics i biocompatibilitat. Té bones perspectives per a aplicacions mèdiques clíniques en el futur.

Fig. 4 Resultat d'experiments de seguretat in vivo. Dades de bioquímica de la sang incloent marcadors de funció renal: (A) marcadors de funció hepàtica: CRE, (B) BUN i (C) ALT després de diversos tractaments. (D) Resultats de l'anàlisi histopatològic (imatges tacades de H&E) dels òrgans principals, cor, pulmó, fetge, ronyons i melsa, de ratolins que van ser exposats a diferents tractaments 16 dies després de la injecció. Barres d'escala: 100 mm.

Conclusió

Hem dissenyat un hidrogel foto-responsiu injectable que pot aconseguir simultàniament teràpia de radicals lliures i PTT encapsulant l'enzim FeS2 i la font de radicals alquil AIPH en hidrogel d'agarosa. Sota la irradiació làser de 808 nm, el PTA FeS2 promou l'escalfament del sistema AFH i condueix a l'alliberament d'AIPH i la seva descomposició per produir radicals alquils. Al mateix temps, FeS2 pot reduir el contingut intracel·lular de GSH, destruint així encara més l'homeòstasi redox. La velocitat de dissolució de l'hidrogel es pot canviar mitjançant paràmetres com ara la densitat de potència del làser i la mida del punt. Tant els estudis in vivo com els in vitro han demostrat que la combinació d'AFH amb irradiació NIR pot aconseguir potents efectes de destrucció del tumor amb efectes adversos insignificants. El sistema d'hidrogel dissenyat en aquest estudi proporciona una estratègia per millorar els sistemes terapèutics basats en radicals alquil.

Referències

1 D. Zhu, J. Zhang, G. Luo, Y. Duo i BZ Tang,Adv. Ciència., 2021, e2004769.

2 C. Huang, S. Ding, W. Jiang i F.-B. Wang,Nanoescala, 2021, 13, 4512–4518.

3 J. Wu, Y. Qu, K. Shi, B. Chu, Y. Jia, X. Xiao, Q. He i Z. Qian,Barbeta. Chem. Lett., 2018, 29, 1819–1823.

4 S. Ning, Y. Zheng, K. Qiao, G. Li, Q. Bai i S. Xu,J. Nanobiotecnologia., 2021, 19, 344. 

5 D. Zhu, T. Zhang, Y. Li, C. Huang, M. Suo, L. Xia, Y. Xu, G. Li i BZ Tang,Biomaterials, 2022, 283, 121462. 

6 D. Zhu, R. Ling, H. Chen, M. Lyu, H. Qian, K. Wu, G. Li i X. Wang,Nano Res., 2022, DOI:10.1007/s12274-022-4359-6. 

7 D. Zhu, M. Lyu, W. Jiang, M. Suo, Q. Huang i K. Li,J. Mater. Chem. B, 2020, 

8, 5312–5319. 8 H. Ranji-Burachaloo, PA Gurr, DE Dunstan i GG Qiao,ACS Nano, 2018, 12, 11819–11837. 

9 D. Zhu, Z. Liu, Y. Li, Q. Huang, L. Xia i K. Li,Biomaterials, 2021, 274, 120894. 

10 X. Li, R. Luo, X. Liang, Q. Wu i C. Gong,Barbeta. Chem. Lett., 2021, DOI:10.1016/j.cclet.2021.11.048.