Natalenamides A–C, tripèptids cíclics de l'Actinomadura associada a tèrmites Sp. RB99

Resum:

En els darrers anys, les investigacions sobre la bioquímica dels bacteris associats als insectes han augmentat. Quan es combinen amb processos de dereplicació analítiques, aquests estudis proporcionen una estratègia potent per identificar compostos nous estructuralment i/o biològicament. Els pèptids cíclics sintetitzats no ribosòmicament tenen un ampli espectre de bioactivitat amb un alt potencial medicinal.

Aquí, informem del descobriment de tres nous tripèptids cíclics: natalenamides A–C (compostos 1–3). Aquests compostos es van identificar a partir del brou de cultiu de l'Actinomadura sp. RB99 mitjançant un mètode de dereplicació basat en cromatografia líquida (LC)/ultraviolada (UV)/espectrometria de masses (MS). Les estructures químiques dels nous compostos (1-3) es van establir mitjançant l'anàlisi de mètodes espectroscòpics complets, inclosos els magnètics nuclears unidimensionals (1H i 13C) i bidimensionals (1H-1H-COSY, HSQC, HMBC). espectroscòpia de ressonància (RMN), juntament amb dades d'espectrometria de masses d'ionització amb electrospray d'alta resolució (HR-ESIMS). Les configuracions absolutes dels nous compostos es van dilucidar mitjançant l'anàlisi de Marfey. Mitjançant diverses proves de bioactivitat dels tripèptids, vam trobar que el compost 3 presentava efectes inhibidors significatius sobre la producció de melanina induïda per 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX). L'efecte del compost 3 era similar al de l'àcid cògic, un compost utilitzat àmpliament com a material cosmètic amb un efecte blanquejador de la pell.

La pell clara, llisa i delicada ha estat sempre l'objectiu perseguit per les dones orientals. La investigació i el desenvolupament d'agents blanquejants per a productes per a la cura de la pell es basen principalment en la inhibició de l'activitat de la tirosinasa.

Els compostos que contenen anells de benzè o estructures d'hidroxil fenòlic tenen efectes blanquejants potencials, com ara l'agent blanquejador que s'utilitza habitualment l'arbutina, que pot exercir efectes blanquejadors inhibint l'activitat de la tirosinasa.

I vam descobrir que Cistanche deserticola té un efecte blanquejador. El principal ingredient actiu de Cistanche deserticola, glicòsids feniletanoides, és una mena de compost de glicòsid natural. Els estudis han trobat que els glicòsids feniletanoides poden inhibir l'activitat de la tirosinasa i la producció de melanina en melanòcits epidèrmics humans i tenen un efecte blanquejador. eficàcia de l'agent.

Feu clic en pols d'extracte de cistanche tubulosa

Paraules clau:

tèrmits que creixen fongs; Actinomadura sp.; tripèptids; natalenamides A–C; efectes per blanquejar la pell.

1. Introducció

L'anàlisi química dels simbionts bacterians protectors d'insectes de conreu ha cridat molta atenció entre els químics de productes naturals en els darrers anys [1–5]. Utilitzant processos de dereplicació basats en ressonància magnètica nuclear (RMN)/espectrometria de masses (MS) d'última generació i bioassaigs ecològicament rellevants, s'ha descobert una quantitat impressionant de productes naturals estructuralment intrigants, inclosos diversos pèptids cíclics sintetitzats no ribosòmicament. de simbionts microbians [6]. Els exemples més destacats inclouen la dentigerumicina antifúngica, un depsipèptid cíclic aïllat d'una Pseudonocardia sp associada a formigues que creixen fongs. [7], i les gerumicines A–C, depsipèptids cíclics que porten àcid piperàzic identificats a Pseudonocardia sp. [8].

S'ha demostrat que els pèptids cíclics mostren una àmplia gamma d'activitats biològiques, fomentant diversos enfocaments sintètics cap a aquestes estructures farmacològicament prometedores [9-12]. Actualment, es comercialitzen i s'utilitzen àmpliament més de 40 fàrmacs de pèptids cíclics en entorns clínics, i aproximadament un nou fàrmac de pèptids cíclics entra al mercat cada any, de mitjana [13].

Com a part del nostre esforç continuat per identificar metabòlits secundaris estructuralment nous i/o bioactius de microbis associats a tèrmits [14–17], ens vam centrar en l'Actinomadura sp. RB99, aïllat del tèrmit que creix fong, Macrotermes natalensis. La nostra estratègia de dereplicació basada en cromatografia líquida (LC)/ultraviolada (UV)/espectrometria de masses (MS) va produir productes naturals bioactius potencialment nous. En aquest estudi, informem de l'aïllament i la identificació química de tres nous tripèptids cíclics, natalenamida A-C (compostos 1-3, figura 1), mitjançant un mètode de dereplicació basat en LC/UV/MS, així com les seves avaluacions biològiques per a citotòxics. , activitats antiinflamatòries i per blanquejar la pell.

2. Resultats i discussió

2.1. Aïllament dels compostos 1–3 basat en cromatografia líquida (LC)/ultraviolada (UV)/espectrometria de masses (MS)

Actinomadura sp. RB99 es va aïllar de la superfície d'un treballador de tèrmits (M. natalensis). L'anàlisi filogenètica d'una seqüència d'àcid ribonucleic (rRNA) ribosomal 16S gairebé completa suggereix que la soca RB99 pertany al gènere Actinomadura, amb el veí més proper Actinomadura nitritigenes NBRC 15918T. L'anàlisi posterior basat en LC/UV/MS d'extractes de cultiu enriquit va revelar un conjunt d'absorcions UV característiques amb pics d'ions moleculars únics que contenien àtoms de nitrogen.

Per identificar els metabòlits respectius i investigar la seva activitat, es va fer una fermentació a gran escala utilitzant condicions de creixement optimitzades (100 plaques d'agar d'agar ISP2 de 2 L, pH 6, 10 dies a 30 ◦ C) i un procediment establert de treball i pre-purificació. aplicat [17]. El fraccionament posterior guiat per LC-UV/MS i la cromatografia líquida d'alt rendiment semipreparativa repetitiva (HPLC) van donar lloc a l'aïllament de tres metabòlits amb un patró únic de RMN/MS. Hem realitzat estudis de creixement i mitjans utilitzant diferents composicions de sal (NaCl, KBr 1-3 per cent) i medis (mitjans ISP1-6) per imitar l'entorn natural i estimular la producció de metabòlits, cosa que també va provocar la presència dels tres nous metabòlits (vegeu la figura suplementària S19).

2.2. Elucidació estructural dels compostos

Natalenamida A (1) es va adquirir com una pols amorfa. Es va determinar que la fórmula molecular d'1 era C19H25N3O5 a partir de l'ió molecular adduït amb sodi a m/z 398,1691 [M més Na] més (calculat per a C19H25N3O5Na, 398,1692) mitjançant espectrometria de masses d'ionització d'electroespray d'alta resolució en mode d'ions positius (HR). dades ESIMS). L'espectre infrarojo (IR) va mostrar una forta banda d'absorció a 1670 cm−1, cosa que suggereix la presència de grups amida a la molècula. L'anàlisi detallada de les dades de RMN 1H d'1 (taula 1) va indicar els senyals típics d'un esquelet peptídic, mostrant dos senyals de metil (δH 0,91 (3H, d, J=7.{{29). }} Hz, H-3) i 0,92 (3H, d, J=7.{0 Hz, H{-4)), tres senyals de metilè (δH 1,95 (1H, m, H-7a), 2,27 (1H, m, H{-8a), 2,36 (1H, m, H{-8b), 2,48 (1H) , m, H{{50}}b), 2,97 (1H, dd, J=14.{0, 8.0 Hz, H{{58} }a), i 3,20 (1H, dd, J=14.{0, 5,0 Hz, H{-12b)), quatre senyals de metina (δH 2,02 (1H) , m, H-2), 4,16 (1H, d, J=7,5 Hz, H{-1), 4,20 (1H, dd, J=8,5, 4,5 Hz, H-6) i 4,63 (1H, dd, J=8,0, 5,0 Hz, H{-11)) i cinc protons aromàtics superposats (δH 7,18 (1H, m, H-16), 7,23 (2H, m, H{-14/18) i 7,24 (2H, m, H{-15/17)).

L'espectre de RMN 13C (taula 1), amb l'ajuda dels espectres HSQC i HMBC, va mostrar un total de 19 ressonàncies de carboni responsables de dos senyals de metil (δC 18,9 i 19,9), tres senyals de metilè (δC 27.0, 30.6 i 38,8), nou senyals de metina (δC 32,1, 55,6, 58,0, 60,4, 127,8, 129,5 (×2) i 130,6 (×2)), inclosos cinc carbonis aromàtics, un carboni olefínic senyal (δC 138,8) i quatre senyals de carboni carbonílic (δC 173,2, 173,3, 174,8 i 181,3). Combinada amb les dades espectroscòpiques anteriors, la inspecció detallada de la RMN bidimensional (2D) (experiments 1H-1H COSY, HSQC i HMBC) va revelar la presència de tres aminoàcids en 1: glutamat (Glu), fenilalanina ( Phe) i valina (Val) (figura 2). La connectivitat d'aquests aminoàcids va ser determinada per les correlacions HMBC de H-1/C{-5 i C-19, H{-11/C{-10 i C{ {50}} i H-6/C-5 i C-10 (figura 2).

Per identificar la configuració absoluta d'1, es va aplicar el mètode de Marfey per determinar l'estereoquímica dels múltiples -H (C-1, C-6 i C-11). Els hidrolitzats àcids d'1 i els aminoàcids estàndard (L/D-Glu, Phe i Val) es van derivatitzar amb 1-fluoro-2,4-dinitrofenil-5-L-alanina amida (L-FDAA). Successivament, la barreja derivatitzada d'1 i els aminoàcids estàndard es van analitzar per LC/MS per examinar el seu temps de retenció. Es va determinar que les configuracions absolutes dels fragments Glu, Phe i Val eren formes L, basant-se en els temps de retenció dels derivats L-FDAA d'1 en comparació amb els dels aminoàcids estàndard. Així, l'estructura d'1 es va dilucidar com el tripèptid cíclic que es mostra a la figura 1.

La Natalenamida B (2) es va aïllar com una pols amorfa. La seva fórmula molecular (C20H27N3O5) es va deduir a partir dels pics d'ions moleculars adduïts d'hidrogen i sodi a 390,2032 [M més H] més (calculat per a C20H28N3O5, 390,2029) i 412,1849 [M més Na] més (calculat respectivament per a C20H28. En comparació amb la fórmula molecular i les dades espectrals de RMN d'1, el compost 2 semblava tenir un grup CH2 addicional a l'esquelet del pèptid. Un escrutini exhaustiu dels espectres unidimensionals (1D) (1H i 13C RMN) i 2D RMN (1H-1H COSY, TOCSY, HSQC i HMBC) de 2 va revelar l'existència de tres residus d'aminoàcids: Glu, Phe i Leu (leucina). La seqüència d'aquests aminoàcids es va construir a partir de les correlacions HMBC de H-1/C-6 i C-20, H-12/C{-11 i C -20 i H-7/C{-6 i C-11 (figura 2). Per determinar la configuració absoluta de 2, es va realitzar la derivatització dels residus Glu, Phe i Leu amb L-FDAA i després es va analitzar per LC/MS. A les dades LC/MS, es van detectar L-Glu, L-Phe i L-Leu comparant els temps de retenció dels derivats de L-FDAA de 2 amb els dels aminoàcids estàndard. Així, l'estructura química de 2 es va establir com el tripèptid cíclic que es mostra a la figura 1.

Les dades d'HR-ESIMS en mode positiu de la natalenamida C (3) mostraven ions moleculars adduïts d'hidrogen i sodi a 424,1870 [M més H] més (calculat per a C23H26N3O5, 424,1872) i 446,1694 [M més Na] més (calculat per a C3O3H25N, 424,1872) 424.1692). Això va suggerir que la seva fórmula molecular era C23H25N3O5. Una anàlisi detallada dels espectres de RMN 1D i 2D de 3 va indicar que la seva estructura química era similar a la de 2, excepte que Leu es va substituir per Phe en 3. La connectivitat dels tres aminoàcids identificats en 3 es va verificar mitjançant les correlacions HMBC de H-1/C-9 i C-23, H{-15/C{-14 i C{-23 i H{-10/ C-9 i C-14 (figura 2). En aplicar el mètode de Marfey al compost 3, es va dilucidar que les configuracions absolutes dels múltiples -H (C-1, C-10 i C-15) eren un L-Glu i dos L. -Phe fragments. En conseqüència, es va determinar l'estructura completa de 3 tal com es mostra a la figura 1.

Les Natalenamides A–C són pèptids tricíclics, presumiblement d'origen no ribosòmic. Actualment, diversos tripèptids cíclics bioactius s'han caracteritzat com a productes naturals: tripèptids cíclics citotòxics 17-membrats (per exemple, OF4949 I–IV) aïllats de Penicillium rugulosa [18]; esclerotomies antifúngiques A−K, identificades a partir del brou de fermentació de bacteris halotolerants [10]; i E psicrofílica antiproliferativa, aïllada d'un cultiu mixt de dues soques de fongs del gènere Aspergillus derivades d'algues marines [19].

2.3. Activitats biològiques dels compostos 1-3

Com que s'ha informat que els pèptids cíclics presenten una àmplia gamma d'activitats biològiques, els efectes biològics dels tripèptids cíclics aïllats ({{0}}) es van avaluar mitjançant tres bioactivitats. La citotoxicitat dels compostos 1-3 es va investigar contra quatre línies de cèl·lules canceroses (cèl·lules MCE7 de càncer de mama, cèl·lules de càncer de coll uterí HeLa, cèl·lules de càncer de pulmó humà A549 i cèl·lules de càncer de fetge HepG2) a diferents concentracions (0, 6,25). , 12,5, 25, 50 i 100 uM). El compost 1 no va afectar la viabilitat cel·lular de les cèl·lules MCF-7, HeLa o A549. Tanmateix, el tractament de cèl·lules HepG2 amb 100 M de compost 1 va reduir la viabilitat cel·lular fins al 78,5 més el 3,2 per cent (figura 3). El compost 2 va reduir la viabilitat cel·lular de les cèl·lules HeLa i A549 al 82,9  2,1 per cent i al 73,5=3,0 per cent, respectivament, però no va afectar la viabilitat de MCF{-7 o Cèl·lules HepG2 (figura 3). El compost 3 no va afectar la viabilitat de cap de les línies cel·lulars (figura 3).

A continuació, es van utilitzar macròfags RAW264.7 per investigar els efectes antiinflamatoris dels compostos aïllats. Per eliminar els errors en la producció de NO causats pel canvi de les taxes de supervivència cel·lular, es van examinar les concentracions no tòxiques de cada compost. Com es mostra a la figura 4, els compostos 1-3 van tenir pocs efectes citotòxics a les cèl·lules RAW264.7 (figura 4A-C) i no van exercir cap efecte inhibidor sobre la producció de NO a les cèl·lules RAW264.7 estimulades per lipopolisacàrids (LPS) (figura 4D-F) .

Els efectes inhibidors dels compostos 1-3 sobre el contingut de melanina a les cèl·lules B16F10 es van examinar com a evidència de les seves activitats per blanquejar la pell (figura 5). Com que els canvis en la viabilitat cel·lular causen errors en la producció i mesura de melanina, primer vam examinar els efectes dels compostos 1-3 sobre la supervivència de les cèl·lules B16F10. Els compostos 1-3 no van exercir cap efecte citotòxic a les cèl·lules B16F10 a cap de les concentracions utilitzades (figura 5A-C). A continuació, vam avaluar els efectes inhibidors dels compostos sobre la producció de melanina induïda per 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) a les cèl·lules B16F10 (figura 5D-F). IBMX, un conegut estimulador de la melanogènesi, indueix un augment significatiu de la producció de melanina després d'un sol tractament en cèl·lules de melanoma. Entre els compostos avaluats, el compost 3 (a 5-100 µM) va mostrar efectes inhibidors significatius sobre la síntesi de melanina mediada per IBMX de manera dependent de la dosi. L'àcid kòjic, el nostre control positiu, s'ha utilitzat àmpliament com a material cosmètic amb efectes per blanquejar la pell [20]. L'efecte inhibidor del compost 3 sobre la producció de melanina induïda per IBMX va ser similar al de l'àcid cògic (figura 5F), cosa que suggereix que el compost 3 funciona com un potent inhibidor de la producció de melanina induïda per IBMX a les cèl·lules de melanoma B16F10.

A més, el compost 3 es va contaminar amb un petit nombre d'impureses, que es va determinar que eren anàlegs d'àcids grassos mitjançant la interpretació de dades espectroscòpiques de RMN i l'anàlisi LC/MS (materials suplementaris, figures S11-S15 i S23). Per identificar l'activitat de les impureses, es van realitzar experiments addicionals amb els anàlegs d'àcids grassos pels seus efectes inhibidors sobre la producció de melanina induïda per IBMX a les cèl·lules B16F10, cosa que va revelar que els compostos provats no tenien efecte blanquejador (materials suplementaris, figura S24). Així, tot i que no podem excloure que les impureses del compost 3 siguin responsables de l'efecte inhibidor sobre la producció de melanina induïda per IBMX, això sembla poc probable.

3. Materials i Mètodes

3.1. Procediments Experimentals Generals

Els espectres d'infrarojos es van adquirir amb un espectròmetre Bruker IFS-66/S FT-IR (Bruker, Billerica, MA, EUA). La ionització electrospray i els espectres HR-ESIMS es van mesurar en un espectròmetre de masses per cromatografia líquida (LC) SI-2/LCQ DecaXP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Els espectres de RMN, inclosos els experiments 1H–1H COSY, HSQC i HMBC, es van realitzar mitjançant un espectròmetre RMN Varian UNITY INOVA 800 (Varian, Palo Alto, CA, EUA) que funcionava a 800 MHz (1H) i 200 MHz (13C), amb desplaçaments químics donats en ppm (δ). L'HPLC preparativa va utilitzar una bomba HPLC binària Waters 1525 amb un detector de matriu de fotodiodes Waters 996 (Waters Corporation, Milford, CT, EUA). Per a la cromatografia en columna es van utilitzar gel de sílice 60 (230–400 mesh, Merck, Kenilworth, NJ, EUA) i gel de sílice RP-C18 (230–400 mesh, Merck. La HPLC semipreparativa va utilitzar un sistema Shimadzu Prominence HPLC amb SPD{ {22}}Detectors HPLC Prominence de la sèrie A/20AV (UV-Vis) (Shimadzu, Tòquio, Japó). Les anàlisis LC/MS es van dur a terme en un sistema HPLC Agilent de la sèrie 1200 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) equipat amb un detector de matriu de díodes i un espectròmetre de masses ESI de la sèrie 6130 amb un Kinetex analític (4,6 × 100 mm, 3,5 µm). Es van utilitzar plaques F254 de gel de sílice prerevestides de Merck i plaques RP-18 F254s per a plaques primes. -cromatografia en capes (TLC) Es van detectar taques en TLC sota llum UV o escalfant després de ruixar amb una solució d'àcid sulfúric-anisaldehid.

3.2. Material microbià

Actinomadura sp. RB99 es va aïllar de la superfície d'un treballador de tèrmits del gènere, M. natalensis, (colònia Mn103, GPS S25 43 45.9 E{28 14 08.9) el 2 de gener{{ {13}}10. El biomaterial es va col·locar en bosses de plàstic netes i es va processar en un dia després de la recollida. Els tèrmits es van rentar amb aigua desionitzada estèril i els bacteris es van aïllar en xapa de les suspensions resultants en medis baixos en nutrients amb quitina (per litre: 4 g de quitina, 0,7 g K2HPO4, 0,3 g). KH2PO4, 0,5 g MgSO4·5H2O, 0,01 g FeSO4·7H2O, 0,001 g ZnSO4, 0,001 g MnCl2 i 20 g d'agar) [21]. Els aïllats amb morfologia semblant als Actinobacteria es van transferir a l'agar ISP2 (per litre: 10 g d'extracte de malta, 4 g d'extracte de llevat, 4 g de glucosa i 20 g d'agar) i es van subcultivar fins que es van obtenir aïllats purs.

3.3. Extracció d'ADN i amplificació per reacció en cadena de la polimerasa

Actinomadura sp. RB99 es va cultivar en un medi líquid ric en nutrients ISP2 durant cinc a set dies a 30 ◦C. Es van recollir cèl·lules i es va extreure l'ADN genòmic mitjançant el kit de purificació d'ADN genòmic GenJet (# K0721, Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) seguint les instruccions del fabricant amb els canvis següents: (a) el tractament amb lisozim es va ampliar a 40 min i ( b ) El tractament amb proteinasa K es va ampliar a 40 min. L'ADN es va quantificar fotomètricament mitjançant un espectròmetre Nanodrop Lite (Thermo Scientific).

Per als estudis filogenètics, el gen rRNA 16S es va amplificar mitjançant el conjunt d'imprimadors, 1492R/27F. Cada reacció d'amplificació es va preparar en un volum de reacció final de 25 µL que contenia 7,25 µL d'aigua destil·lada, 5 µL de tampó HF, 5 µL de cada cebador (2,5 µM), {{10}},5 µL de dNTPs (10 µM), 0,25 µL d'ADN polimerasa d'alta fidelitat Phusion (New England Biolabs, Ipswich, MA, EUA) i 2 µL d'ADN extret (plantilla). La reacció en cadena de la polimerasa (PCR) es va realitzar en les condicions següents: 98 ◦C durant 38 s; 32 cicles de 98 ◦ durant 30 s, 52 ◦C durant 45 s, 72 ◦C durant 1 min 20 s; i una extensió final de 72 ◦C durant 8 min. El producte de PCR es va visualitzar mitjançant electroforesi en gel d'agarosa i les reaccions de PCR es van purificar mitjançant un kit de purificació de PCR (Thermo Scientific). Els fragments d'ADN es van seqüenciar al GATC (Konstanz, Alemanya).

3.4. Seqüenciació i identificació d'espècies

Les seqüències es van avaluar per a la puresa i els desajustaments mitjançant BioEdit [22]. Les seqüències directes i inverses obtingudes per a cada soca es van reunir amb BioEdit i es van provar les quimeres mitjançant DECIPHER (http://decipher.cee.wisc.edu/FindChimerasOutputs.html). Les seqüències resultants es van dipositar a GenBank (número d'adhesió: KY558684). Les anàlisis explosives amb seqüències d'ARNr 16S gairebé completes (1368 pb) es van realitzar mitjançant la base de dades del National Center for Biotechnology Information (NCBI) (seqüències d'ARN de referència). Els resultats van indicar que la soca RB99 és membre del gènere Actinomadura. Les seqüències dels primers 10 hits es van descarregar de la base de dades NCBI i es van alinear amb la seqüència d'ARNr 16S d'Actinomadura sp. RB99 utilitzant el servei d'alineació de seqüències Sina [23]. Es van reconstruir dos arbres filogenètics diferents amb algorismes d'unió de veïns o de màxima probabilitat mitjançant la versió 7.0.26 del programari MEGA [24–26]. El model de distància evolutiva de Tamura i Nei es va utilitzar per generar matrius de distància evolutiva per als algorismes de màxima probabilitat i unió de veïns, amb la supressió de buits complets i dades que falten [27]. Per a l'algorisme de màxima probabilitat, es va utilitzar una distribució gamma discreta (més G) i el model de variació de la velocitat va permetre que alguns llocs fossin evolutivament invariables (més I). Per a l'algorisme d'unió de veïns, la variació de la taxa entre els llocs es va modelar amb una distribució gamma (més G). Els valors de confiança dels nodes es van avaluar mitjançant anàlisis d'arrencada basades en 1000 passos de mostreig [28].

3.5. Extracció i aïllament

Actinomadura sp. RB99 es va cultivar en 50 mL de brou ISP2 durant set dies a 30 ◦C (precultiu) i es va utilitzar per inocular 100 plaques d'agar ISP2. Les plaques es van incubar durant 10 dies a 30 ◦ C, es van tallar en trossos petits, es van consolidar i es van submergir durant la nit en MeOH. La fase MeOH es va filtrar i es va evaporar a pressió reduïda. L'extracte de MeOH (20 g) es va dissoldre en aigua destil·lada (700 ml) i després es va repartir amb dissolvent amb EtOAc (700 ml) tres vegades, donant 1,1 g de residu. La fracció soluble en EtOAc (1,1 g) de l'extracte de MeOH es va carregar en una columna de gel de sílice (230-400 malles) per a la cromatografia i es va eluir amb un sistema de dissolvent de gradient de CH2Cl2-MeOH (100:1 a 1: 1, v/v). Això va proporcionar sis fraccions (A-F), que van ser sotmeses a anàlisi basada en LC-UV/MS. L'anàlisi de la dereplicació utilitzant una biblioteca espectral UV interna va suggerir l'existència d'anàlegs de pèptids menors a la fracció E. Aquests mostraven un patró UV senzill a uns 220 nm i pics d'ions de fórmula molecular única que contenien àtoms de nitrogen. La fracció polar E (233 mg) es va fraccionar mitjançant HPLC preparativa en fase inversa (Phenomenex Luna C18, 250 × 21,2 mm id, 5 µm, Torrance, CA, EUA) mitjançant CH3CN/H2O (1:9 a 9:1, v /v, sistema de gradient, cabal: 5 ml/min) per produir cinc subfraccions (E1–E5). La subfracció E2 (27 mg) es va purificar mitjançant una HPLC semipreparativa de fase inversa (Phenomenex Luna C18, 250 × 10,0 mm id, 5 µm) amb un 33 per cent de MeOH/H2O (sistema isocràtic, cabal: 2 ml/min). ) per produir el compost 1 (5,8 mg, tR=57,0 min). Els compostos 2 (1,6 mg, tR=42,0 min) i 3 (1,5 mg, tR=55,0 min) es van aïllar de la subfracció E3 (15 mg) mitjançant fase inversa semipreparativa HPLC eluint un 43 per cent de MeOH/H2O (sistema isocràtic, cabal: 2 ml/min).

3.5.1. Natalenamida A (1)

3.5.2. Natalenamida B (2)

3.5.3. Natalenamida C (3)

3.6. Hidròlisi àcida dels compostos 1–3

Es va hidrolitzar una quantitat total de 0,4 mg de cada compost (1–3) amb HCl 6 N (500 µL) durant 1 h a 110 ◦C. Després de refredar-se a temperatura ambient, els hidrolitzats d'1-3 es van evaporar per eliminar restes d'HCl. Es va afegir aigua destil·lada (500 µL) a les mescles d'hidrolitzat i després es va evaporar per eliminar restes de HCl; aquest procés es va realitzar tres vegades.

3.7. Determinació de la configuració absoluta dels aminoàcids en 1–3

Les mescles d'hidrolitzat (1-3), així com els aminoàcids estàndard (L/D-Leu, Glu, Phe i Val), es van dissoldre en NaHCO3 1 N (100 µL) i després es van tractar amb 50 µL de L-FDAA (10 mg/mL en acetona). Successivament, cada hidrolitzat es va escalfar durant 10 min a 80 ◦ C. Cada mescla es va apagar amb HCl 2 N (50 µL) i es va concentrar al buit. El residu es va dissoldre en 300 µl de MeOH. Cada alíquota (5 µL) adquirida de les mescles d'hidrolitzat es va injectar directament al LC/MS (Phenomenex Luna C18, 4,6 × 100 mm, 3,5 µm, cabal de 0,3 mL/min) i una exploració completa en positiu i negatiu. Es van aplicar modes iònics (interval d'exploració de m/z 100 a 1000) per identificar els temps de retenció dels aminoàcids derivats de L-FDAA.

La fase mòbil, que consisteix en àcid fòrmic en aigua destil·lada ({{0}},1 per cent v/v) (A) i acetonitril (B), es va portar amb un sistema de dissolvent de gradient de la següent manera: 20-40 per cent (B) durant 10 min, 100 per cent (B) isocràtic durant 5 min, i després 20 per cent (B) isocràtic durant 5 min, per dur a terme un procediment de rentat posterior a la columna. Els temps de retenció dels aminoàcids derivatitzats L-FDAA utilitzats com a estàndards van ser de 16,7 min (L-Glu, m/z 400 [M més H] més), 18,2 min (D-Glu, m/z 400 [M més H] més ), 22,1 min (L-Val, m/z 370 [M més H] més ), 25,1 min (D-Val, m/z 370 [M més H] més ), 25,6 min (L-Phe, m/ z 418 [M més H] més), 27,0 min (D-Phe, m/z 418 [M més H] més), 25,5 min (L-Leu, m/z 384 [M més H] més) i 28,2 min (D-Leu, m/z 384 [M més H] més ). Els temps de retenció dels hidrolitzats derivatitzats d'1-3 van ser L-Glu (16,9 min), L-Phe (25,7 min) i L-Val (22,5 min) a partir d'1; L-Glu (16,7 min), L-Phe (25,7 min) i L-Leu (25,6 min) a partir de 2; i L-Glu (16,9 min) i L-Phe (25,7 min) a partir de 3.

3.8. Assajos citotòxics amb cèl·lules canceroses

Les cèl·lules MCF7, HeLa i A549 es van comprar a la American Type Culture Collection (Rockville, MD, EUA). Les cèl·lules HepG2 es van comprar al Korean Cell Line Bank (Seül, Corea). Les cèl·lules MCF7 es van cultivar al medi 1640 de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) complementat amb sèrum boví fetal al 10%. Les cèl·lules HeLa i A549 es van cultivar en el medi essencial mínim de Dulbecco (DMEM, Cellgro, Manassas, VA, EUA) complementat amb sèrum boví fetal al 10%. Les cèl·lules HepG2 es van cultivar en un medi essencial mínim complementat amb un sèrum boví fetal al 10%. Les condicions de cultiu es van mantenir a 37 ◦ C en una atmosfera humidificada que contenia un 5 per cent de CO2. La citotoxicitat es va provar en aquestes quatre línies cel·lulars humanes (MCF7, HeLa, A549 i HepG2) mitjançant el kit d'assaig de viabilitat cel·lular EZ-CyTox (Laboratoris Dojindo, Kumamoto, Japó). Breument, es van sembrar 5 × 103 cèl·lules/pou en plaques de 96-pous. Després de 24 h, les cèl·lules es van tractar amb compostos a les concentracions indicades. Després de 72 h d'incubació, es va utilitzar el kit d'assaig de viabilitat cel·lular EZ-CyTox. Després de 2 h d'incubació, es va mesurar l'absorbància a 450 nm amb una referència a 620 nm. La viabilitat cel·lular es va calcular com a percentatge del control.

3.9. Activitat antiinflamatòria

La línia cel·lular RAW264.7 del macròfag del ratolí es va comprar a la American Type Culture Collection. Les cèl·lules es van cultivar en DMEM complementat amb un 10% de sèrum fetal boví (FBS), 100 unitats/ml de penicil·lina i 100 µg/ml d'estreptomicina i es van incubar a 37 ◦ C en una atmosfera humidificada amb un 5% de CO2. La viabilitat cel·lular es va mesurar mitjançant el kit de detecció de la viabilitat cel·lular Ez-Cytox. Les cèl·lules es van incubar en plaques de 96-pous a una concentració de 2500 cèl·lules per pou durant 24 hores i es van tractar amb les concentracions indicades de compostos 1-3 durant 24 hores. A continuació, es van afegir reactius Ez-Cytox a cada pou. La densitat òptica a 450 nm es va mesurar després d'1 h mitjançant un lector de microplaques (PowerWave XS; Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, EUA) per estimar la viabilitat cel·lular. En un experiment separat, les cèl·lules RAW264.7 es van incubar en 96-plaques de pous a una concentració de 30,000 cèl·lules per pou durant 24 h. Després de la fam de sèrum durant 12 h, les cèl·lules es van tractar prèviament amb els compostos 1-3 durant 1 h i després es van estimular amb 1 µg/mL de LPS durant 24 h. L'absorbància del medi de cultiu en una reacció de Griess es va mesurar a 540 nm mitjançant un lector de microplaques PowerWave XS per estimar el nivell de NO.

3.10. Mesura del contingut de melanina

La línia cel·lular de melanoma de ratolí, B16F10, es va comprar a la American Type Culture Collection. Les cèl·lules es van cultivar en DMEM suplementat amb un 10 per cent de FBS, 100 unitats/ml de penicil·lina i 100 µg/mL d'estreptomicina i es van incubar a 37 ◦ C en una atmosfera humidificada amb un 5 per cent de CO2. Les cèl·lules B16F10 es van incubar en plats de cultiu de 6 cm a 250,000 cèl·lules per pou en DMEM suplementat amb un 10 per cent de FBS, 100 µg/mL d'estreptomicina i 100 U/mL de penicil·lina durant 24 h. Les cèl·lules es van rentar dues vegades amb solució salina tamponada amb fosfat (PBS) i després es van estimular per IBMX i es van incubar amb diferents concentracions de compostos 1-3 o àcid cògic (control positiu) en medi RPMI sense vermell de fenol complementat amb un 10 per cent de FBS, 100 unitats. /mL de penicil·lina i 100 µg/mL d'estreptomicina durant 24 h i 48 h. L'absorbància del medi de cultiu es va mesurar a 405 nm mitjançant un lector de microplaques PowerWave XS per estimar el contingut de melanina. Els resultats s'expressen com a canvi de plec en comparació amb el control (cèl·lules no estimulades per IBMX).

3.11. Anàlisi estadística

Totes les dades, incloses la viabilitat cel·lular, NO i les produccions de melanina, es van presentar com a valor mitjà i desviació estàndard (SD). Tots els assajos es van fer per triplicat i es van repetir almenys tres vegades. En aquest estudi, només es van incloure uns quants nombres de repeticions de cada experiment cel·lular, per la qual cosa es va adoptar el mètode d'anàlisi no paramètric per a l'anàlisi estadística. Per a l'anàlisi estadística de cada variable es va utilitzar el test de Kruskall-Wallis. El paquet estadístic SPSS es va utilitzar per a totes les anàlisis (estadístiques SPSS d'International Business Machines Corporation (IBM) versió 21, Boston, MA, EUA). La significació estadística es va considerar amb un valor p inferior a 0,05.

4. Conclusions

El nostre informe proporciona una anàlisi química dels aïllats microbians d'un tèrmit que creix fongs. Es van aïllar i caracteritzar estructuralment tres nous tripèptids cíclics, natalenamides A–C (1–3), a partir del brou de cultiu de l'Actinomadura sp. RB99 utilitzant un mètode de dereplicació basat en LC-UV/MS. Tots els compostos aïllats es van avaluar per a activitats biològiques mitjançant assaigs basats en cèl·lules. Els compostos 1 i 2 van mostrar una citotoxicitat feble contra les cèl·lules HepG2 i HeLa/A549, respectivament. Cap dels compostos aïllats va mostrar efectes inhibidors significatius sobre la producció de NO a les cèl·lules RAW264.7 estimulades per LPS. El compost 3 va mostrar efectes inhibidors significatius sobre la síntesi de melanina mediada per IBMX de manera dependent de la dosi. L'efecte era similar al de l'àcid kògic, que s'utilitza com a material cosmètic amb efectes blanquejants de la pell.

Agraïments:

Estem profundament agraïts a Michael Thomas-Poulsen (Departament de Biologia, Universitat de Copenhaguen, Dinamarca) per donar suport al nostre treball de camp.

Conflictes d'interès:

Els autors declaren cap conflicte d'interessos.

Referències

1. Newman, DJ; Cragg, GM Els productes naturals com a fonts de nous fàrmacs de 1981 a 2014. J. Nat. Prod. 2016, 79, 629–661. [CrossRef] [PubMed]

2. Mishra, BB; Tiwari, VK Productes naturals: un paper en evolució en el futur descobriment de fàrmacs. Eur. J. Med. Chem. 2011, 46, 4769–4807. [CrossRef] [PubMed]

3. Beemelmanns, C.; Guo, H.; Rischer, M.; Poulsen, M. Productes naturals a partir de microbis associats amb insectes. Beilstein J. Org. Chem. 2016, 12, 314–327. [CrossRef] [PubMed]

4. Ramadhar, TR; Beemelmanns, C.; Currie, CR; Clardy, J. Els simbionts bacterians en sistemes agrícoles proporcionen una font estratègica per al descobriment d'antibiòtics. J. Antibiòtic. 2014, 67, 53–58. [CrossRef] [PubMed]

5. Harvey, AL; Edrada-Ebel, R.; Quinn, RJ La reaparició de productes naturals per al descobriment de fàrmacs a l'era de la genòmica. Nat. Rev. Drug Discov. 2015, 14, 111–129. [CrossRef] [PubMed]

6. Sattely, ES; Fischbachb, MA; Walsh, CT Biosíntesi total: reconstitució in vitro de vies de pèptids i poliketides no ribosòmics. Nat. Prod. Rep. 2008, 25, 757–793. [CrossRef] [PubMed]

7. Oh, D.; Scott, JJ; Currie, CR; Clardy, J. Mycangimycin, un peròxid de poliè d'un mutualista Streptomyces sp. Org. Lett. 2009, 11, 633–636. [CrossRef] [PubMed]

8. Seu, CS; Ruzzini, AC; Van Arnam, EB; Ramadhar, TR; Currie, CR; Clardy, J. Les arquitectures genètiques variables produeixen molècules pràcticament idèntiques en simbionts bacterians de formigues que creixen fongs. Proc. Natl. Acad. Ciència. EUA 2015, 112, 13150–13154. [CrossRef] [PubMed]

9. Baix, KE; Ler, S.; Chen, KJ; Campbell, RL; Hickey, JL; Tan, J.; Scully, CCG; Davies, RL; Yudin, Alaska; Zaretsky, S. Disseny racional d'inhibidors de calpaïna basats en peptidomimètics de calpastatina. J. Med. Chem. 2016, 59, 5403–5415. [CrossRef] [PubMed]

10. Zheng, J.; Xu, Z.; Wang, Y.; Hong, K.; Liu, P.; Zhu, W. Tripèptids cíclics del fong halotolerant Aspergillus sclerotiorum PT06-1. J. Nat. Prod. 2010, 73, 1133–1137. [CrossRef] [PubMed]

11. Weerakkody, D.; Moshnikova, A.; El-Sayed, NS; Adochite, RC; Slaybaugh, G.; Golijanin, J.; Tiwari, RK; Andreev, OA; Parang, K.; Reshetnyak, YK Nou pèptids cíclics sensibles al pH. Ciència. Rep. 2016, 6, 31322. [CrossRef] [PubMed]

12. Zhao, M.; Lin, HC; Tang, Y. Biosíntesi del tripèptid cíclic psicofílic que conté -nitro. J. Antibiòtic. 2016, 69, 571–573. [CrossRef] [PubMed]

13. Zorzi, A.; Deyle, K.; Heinis, C. Terapèutica peptídica cíclica: passat, present i futur. Curr. Opina. Chem. Biol. 2017, 38, 24–29. [CrossRef] [PubMed]

14. Kim, KH; Ramadhar, TR; Beemelmanns, C.; Cao, S.; Poulsen, M.; Currie, CR; Clardy, J. Natalamycin A, una ansamicina d'un Streptomyces sp. associat a tèrmits. Chem. Ciència. 2014, 5, 4333–4338. [CrossRef] [PubMed]

15. Kang, HR; Lee, D.; Benndorf, R.; Jung, WH; Beemelmanns, C.; Kang, KS; Kim, KH Termisoflavones A–C, glucòsids isoflavonoides de Streptomyces sp. associats a tèrmits. RB1. J. Nat. Prod. 2016, 79, 3072–3078. [CrossRef] [PubMed]

16. Beemelmanns, C.; Ramadhar, TR; Kim, KH; Klassen, JL; Cao, S.; Wyche, TP; Hou, Y.; Poulsen, M.; Bugni, TS; Currie, CR; et al. Macrotermicines A–D, macrolactames glicosilats d'una Amycolatopsis sp. associada a tèrmits. M39. Org. Lett. 2017, 19, 1000–1003. [CrossRef] [PubMed]

17. Guo, H.; Benndorf, R.; Leichnitz, D.; Klassen, JL; Vollmers, J.; Görls, H.; Steinacker, M.; Weigel, C.; Dahse, HM; Kaster, Alaska; de Beer, ZW; et al. Aïllament, biosíntesi i modificacions químiques de rubterolones A–F: alcaloides de tropolone rars d'Actinomadura sp. 5–2. Chem. Eur. J. 2017, 23, 9338–9345. [CrossRef] [PubMed]

18. Sano, S.; Ikai, K.; Katayama, K.; Takesako, K.; Nakamura, T.; Obayashi, A.; Ezure, Y.; Enomoto, H. OF4949, nous inhibidors de l'aminopeptidasa B. II. Elucidació de l'estructura. J. Antibiòtic. 1986, 39, 1685–1696. [CrossRef] [PubMed]

19. Ciasullo, L.; Casapullo, A.; Cutignano, A.; Bifulco, G.; Debitus, C.; Hooper, J.; Gómez-Paloma, L.; Riccio, R. Renieramida, un tripèptid cíclic de l'esponja de Vanuatu Reniera n. sp. J. Nat. Prod. 2002, 65, 407–410. [CrossRef] [PubMed]

20. Solano, F.; Briganti, S.; Picardo, M.; Ghanem, GH Agents hipopigmentants: una revisió actualitzada sobre aspectes biològics, químics i clínics. Pigm. Melanoma cel·lular Res. 2006, 19, 550–571. [CrossRef] [PubMed]

21. Visser, AA; Nobre, T.; Currie, CR; Aanen, DK; Poulsen, M. Explorant el potencial dels actinobacteris com a simbionts defensius en tèrmits que creixen fongs. Microbi. Ecol. 2012, 63, 975–985. [CrossRef] [PubMed]

22. Hall, TA BioEdit: un programa d'anàlisi i editor d'alineació de seqüències biològiques fàcil d'utilitzar per a Windows 95/98/NT. Símptoma dels àcids nucleics. Ser. 1999, 41, 95–98.

23. Pruesse, E.; Peplies, J.; Glöckner, FO SINA: Alineació precisa de seqüències múltiple d'alt rendiment dels gens d'ARN ribosòmic. Bioinformàtica 2012, 28, 1823–1829. [CrossRef] [PubMed].

24. Saitou, N.; Nei, M. El mètode d'unió de veïns: un nou mètode per a la reconstrucció d'arbres filogenètics. Mol. Biol. Evol. 1987, 4, 406–425. [PubMed]

25. Felsenstein, J. Arbres evolutius a partir de seqüències d'ADN: un enfocament de màxima probabilitat. J. Mol. Evol. 1981, 17, 368–376. [CrossRef] [PubMed]

26. Kumar, S.; Stecher, G.; Tamura, K. MEGA7: Anàlisi de genètica evolutiva molecular versió 7.0 per a conjunts de dades més grans. Mol. Biol. Evol. 2016, 33, 1870–1874. [CrossRef] [PubMed]

27. Tamura, K.; Nei, M. Estimació del nombre de substitucions de nucleòtids a la regió de control de l'ADN mitocondrial en humans i ximpanzés. Mol. Biol. Evol. 1993, 10, 512–526. [PubMed]

28. Felsenstein, J. Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolució 1985, 39, 783–791. [CrossRef] [PubMed]

Disponibilitat de mostra:

Els autors no disposen de mostres dels compostos.

For more information:1950477648nn@gmail.com