Efectes neuroprotectors i mecanismes de procyanidines in vitro i in vivo part 1
Mar 21, 2022
Poseu-vos en contacte amboscar.xiao@wecistanche.comPer a més informació
Abstracte:Aquest estudi ha avaluat laneuroprotectorefectes i mecanismes de procyanidins (PC). In vitro, les cèl·lules de feocromocitoma de rata (cèl·lules PC12) van ser exposades a PC(1,2 o 4 ug/ml) o N-Acetil-L-cisteïna (NAC) (20 μM) durant 24 h i després incubades amb 200 μM d'H, O, durant 24 h. En comparació només amb H2O2, els PC van augmentar significativament les activitats antioxidants (per exemple, glutatió peroxidasa (GSH-Px), superòxid dismutasa (SOD), catalasa (CAT), disminució dels nivells d'espècies reactives d'oxigen (ROS) i malondialdehid (MDA), i augment del factor nuclear-eritroide 2-relacionat factor 2 acumulació (Nrf2) i augment de l'expressió de quinona oxidoreductasa 1 (NQO1), hemo oxigenasa 1 (HO-1), glutamat-cisteïna lligasse modificador subunitat (GCLM), i subunitat catalítica lligassa de glutamat-cisteïna (GCLC). In vivo, les larves de peix zebra (ABstrain)3 dies després de la fecundació (pdf) van ser exposades a NAC(30 uM) o PC(4, 8 o 16 μg/ml) en absència o presència de 300 μM d'H, O, durant 4 dies. En comparació amb H, O, només, els PC milloratsantioxidantactivitats(per exemple, GSH-Px, CAT i SOD), disminució dels nivells de ROS i MDA, i millora de l'activació de l'element de resposta antioxidant Nrf2/ (ARE) i els nivells d'expressió elevats de NQO1, HO-1, GCLM i GCLC.In conclusió, aquests resultats van indicar que els PC van exercir efectes neuroprotectors mitjançant l'activació de la via Nrf2 / ARE i l'alleujament del dany oxidatiu.
Paraules clau:procyanidins; neuroprotector; peix zebra; Cèl·lules PC12; Ruta Nrf2/ARE
1. Introducció
La malaltia neurodegenerativa es refereix a la degeneració lenta i gradual deNeuronesen el cervell humà, que condueix a una varietat de problemes motors i / o cognitius i eventualment condueix a la mort neuronal. Amb el creixent nombre de persones grans, la taxa d'incidència de malalties neurodegeneratives senils està augmentant ràpidament [2,3]. Tot i que els mecanismes subjacents de la neurodegeneració encara no estan clars, l'evidència considerable mostra que l'estrès oxidatiu causat per la sobreproducció d'espècies reactives d'oxigen (ROS) i / o deteriorament del sistema de defensa antioxidant juga un paper clau en aquestes malalties [ 4-6]. En el procés de neurodegeneració, hi ha un desequilibrat entre la producció de ROS intracel·lular i la capacitat del sistema de defensa antioxidant per netejar ROS i / o reparar el dany mediat per ROS 7]I. La producció excessiva de ROS condueix a danys macromoleculars. Per tant, l'acumulació de dany macromolecular cel·lular condueix a la necrosi [8,9. En conseqüència, complementar els antioxidants per eliminar l'excés de ROS pot ajudar a prevenir malalties neurodegeneratives. Els compostos bioactius naturals són segurs amb pocs o cap efecte secundari. Per tant, s'ha prestat cada vegada més atenció al descobriment de compostos antioxidants a partir dels recursos naturals.
La Cistanche pot millorar la immunitat
Les procyanidins (PC) són compostos fenòlics naturals dels flavonoides i contenen oligòmers de monòmers catequina iepicatequinaEls PC són nutrients naturals i antioxidants, i els seus efectes antioxidants són més forts que els de la vitamina C i la vitamina E.E.:
No obstant això, els efectes neuroprotectors i el mecanisme dels PC pel que fa al dany oxidatiu in vivo i in vitro segueixen sense estar clars.
Els peixos zebra són peixos ciprínids tropicals d'aigua dolça confinats a l'Índia. Curiosament, aproximadament el 87% dels gens relacionats amb malalties humanes estan relacionats amb gens homòlegs en peixos zebra. En relació amb els models experimentals de ratolí, la utilització del peix zebra com a sistema model s'associa amb períodes experimentals més curts, costos reduïts i manipulacions gèniques més susceptibles. Pel que fa als models in vitro, les ratespheocromocitomaLes cèl·lules (cèl·lules PC12) són similars a les neurones en termes de morfologia, estructura i funció. Les seves característiques són molt consistents amb les de les neurones cultivades primàries i tenen avantatges experimentals en termes de ser mantingudes fàcilment i de manera robusta en la cultura. A més, les cèl·lules PC12 s'han utilitzat àmpliament com a models in vitro per estudiar les cèl·lules nervioses[ 18-20]. El peròxid d'hidrogen (H, O2) és un tipus de ROS que pot penetrar a través de les membranes cel·lulars i iniciar l'estrès oxidatiu. Nombrosos informes han demostrat que HO, es pot utilitzar per establir models d'estrès oxidatiu [22-24]. En aquest estudi, hem avaluat els efectes neuroprotectors i els mecanismes dels PC en cèl·lules PC12 i peixos zebra.
2. Resultats
2.1.Efectes dels PC en el dany tractat amb H2O2 de les cèl·lules PC12
Les cèl·lules PC12 van estar exposades a 200μM H, O, durant 24 h, i la viabilitat cel·lular va disminuir a 56,5% (Figura la). El pretractament de cèl·lules amb PC només a 1,2, o 4 ug / ml no va tenir cap efecte sobre la viabilitat cel·lular, mentre que el tractament de PC 1,2 i 4 ug / ml va protegir significativament les cèl·lules PC12 de citotoxicitat tractada amb H2O2 mitjançant la viabilitat de les cèl·lules milioratadores (Figura 1b,c,p<0.05 versus="" h,="" o2-treated="" group).="" however,="" pcs="" treatment="" alone="" at8ug/ml="" decreased="" cell="" viability="" (figure="" 1b).="" n-acetyl-l-cysteine="" (nac),="" whichis="" is="" known="" to="" protect="" against="" h2o2-induced="" oxidative="" damage,="" was="" used="" as="" a="" positive="">
2.2.Efectes dels PC sobre l'estrès oxidatiu de les cèl·lules PC12 tractades amb H2O2
Els nivells de ROS i malondialdehid (MDA) indiquen la gravetat del dany oxidatiu. Les cèl·lules PC12 exposades a 200 μM H2O2 durant 24 h van elevar els nivells de ROS i MDA, i el pretractament de PC 2 i 4 μg/ml va inhibir els nivells de ROS i MDA (Figura 2a-c, p<0.05 versus="" h,="" o2-induced="" group).="" to="" further="" evaluate="" the="" antioxidant="" effects="" of="" pcs="" in="" h,o,-induced="" pc12="" cells,="" we="" measured="">GlutatióActivitats de peroxidasa (GSH-Px), catalasa (CAT) i superòxid dismutasa (SOD), i va observar que H, O, el tractament van suprimir les activitats de GSH-Px, CAT i SOD. No obstant això, els efectes induïts per H2O2 van ser rescatats per pretractament amb PC a 2 i 4 μg/ml (Figura 2d-f,p<0.05 versus="" h2o2-treated="">
2.3.Efectes dels PC en el factor nuclear-eritroide 2-relacionat factor 2 (Nrf2)/ARE Via en cèl·lules PC12 tractades amb H2O2
Vam trobar que el nivell de Nrf2 estava regulat i l'expressió de Keapl es va reduir després del pretractament de PC (2 i 4 ug / ml) abans de l'HO, tractament, en comparació amb aquests nivells en el grup HO, induït (Figura 3a-c,p<0.05 versus="" h,o,-induced="" group）.="" furthermore，="" pcs="" （4="" μg/ml）="" facilitated="" nuclear="" localization="" of="" nrf2="" under="" h,o,-lesioning="" conditions="" (figure=""><0.05 versus="" h2o2-induced="" group).addition-ally,="" western="" blotting="" showed="" that="" heme="" oxygenase="" 1="" (ho-1),="" quinone="" oxidoreductase="" 1(nqo1),="" glutamate-cysteine="" ligase="" catalytic="" subunit(gclc),="" and="" glutamate-cysteine="" ligase="" modifier="" subunit="" (gclm)="" levels="" were="" upregulated="" following="" pcs(2="" and="" 4="" ug/ml)treatment="" compared="" with="" h2o2="" alone="" (figure="" 3g-k,=""><0.05 versus="" h2o2-induced="">
Figura 3. Efectes dels PC en la via Nrf2 / ARE en cèl·lules PC12 tractades amb O2. (a) Els nivells de proteïnes de Nrf2 i Keap1, segons el que determina western blotting; b) Expressió relativa de la proteïna Nrf2/ GAPDH (relació a control); (c) Expressió relativa de la proteïna Keap1 / GAPDH (relació a control) ;(d) nivells d'expressió de proteïnes de Nrf2 nuclear i Nrf2 citoplasmàtic, segons el que determina la taca occidental; (e) expressió relativa de la proteïna nuclear Nrf2 / LaminB (relació a control); (f) citoplasmàtics Nrf2 / GAPDH expressió relativa de la proteïna (relació per controlar);(g) nivells de proteïnes de HO-1, NOO1, subunitat catalítica lligassa glutamat-cisteïna (GCLC), i GCLM, segons el que determina Western blotting;(h) EXPRESSIÓ relativa de la proteïna HO-1 / GAPDH (relació per controlar);(i) expressió relativa de la proteïna NQO1 / GAPDH (relació per controlar);(j)GCLC / EXPRESSIÓ RELATIVA DE LA proteïna GAPDH (relació al control); (k) Expressió relativa de la proteïna GCLM/ GAPDH (relació a control). Les dades s'expressen com la mitjana ± SD. Tots els experiments es van dur a terme tres vegades. Els valors amb diferents lletres anteriors són significativament diferents (p<0.05, one-way="">
2.4. La senyalització Nrf2/ARE és responsable dels efectes antioxidatius mediats per PC
Com es mostra a la figura 4a,b, el siRNA de Nrf2 va inhibir l'expressió de Nrf2. Mentrestant, el tractament de siRNA Nrf2 va eliminar els efectes protectors dels PC contra el dany idatiu de bou tractat amb H2O2, com ho demostra la reduïda viabilitat cel·lular en el grup transfectat per Nrf2-siRNA (Figura 4c). Simultàniament, les accions dels PC sobre el contingut de MDA i l'activitat de SOD es van revertir per la caiguda de Nrf2 en condicions de lesió H2O2 (Figura 4d, e).
Figura 4. La senyalització Nrf2/ARE és responsable de les accions antioxidatives mediades per PC en cèl·lules PC12 tractades amb H2O2. (a) L'eficiència eliminatòria es va detectar mitjançant la determinació de l'expressió de la proteïna Nrf2 utilitzant l'expressió relativa de la proteïna Nrf2 occidental(b)Nrf2 / GAPDH (relació a control) ;(c) viabilitat cel·lular;(d) nivells d'MDA;(e)activitat SOD. Les dades s'expressen com a themean± SD. Tots els experiments es van dur a terme tres vegades. Els valors amb diferents lletres anteriors són significativament diferents,(p<0.05, **p="">< 0.01="" relative="" to="" control="" group,="" one-way="">
2.5.Efects de PC sobre la motilitat de les larves de peix zebra després del tractament H2O2
El dany oxidatiu induït per H2O2 va disminuir la distància total de natació de les larves de peix zebra. El tractament dels PC(4, 8 i 16 ug/ml) va rescatar dèficits locomotors induïts per H2O2, com ho demostra una major distància de moviment en relació amb la del grup H2O2 (Figura 5a,b,p<0.05 versus="" h2o2-treated="" group).="" nac,="" which="" is="" known="" to="" protect="" against="" h2o2-induced="" oxidative="" damage,="" was="" used="" as="" a="" positive="" control.="" moreover,="" pcs(16ug/ml)or="" nac（30="" μm）="" alone="" did="" not="" affect="" the="" locomotor="" behavior="" of="" normal="" zebrafish="">
Figura 5. Efectes dels PC sobre la motilitat de les larves de peix zebra tractades amb H2O2. (a) Patrons típics de nedant traces de larves de peix zebra en cada grup;(b) distància total mitjana de larves de peix zebra en cada grup. Les dades es mostren com la mitjana ± SD. Tots els experiments es van repetir tres vegades. Els valors amb diferents lletres anteriors són significativament diferents (p<0.05, one-way="">
2.6.Efectes dels PC sobre l'estrès oxidatiu de les larves zebrajish tractades amb H2O2
Tractament de PC(4,8 i 16 ug/ml) a larves de peix zebra redueix els augments induïts per H2O2 en la formació de ROS intracel·lular (Figura 6a,b, p<0.05 versus="" h,="" o,-treated="" group).="" lipid="" peroxidation="" assays="" also="" indicated="" that="" pcs(4,8,="" and="" 16="" ug/ml)="" dose-dependently="" blocked="" h2o2-induced="" increases="" in="" mda="" levels="" in="" zebrafish="" larvae="" (figure="" 6c,=""><0.05 versus="" ho2-induced="" group).="" furthermore,="" gsh-px="" activity="" was="" reversed="" by="" pc's="" (4,8,="" and="" 16="" μg/ml）="" treatment="" （figure=""><0.05 versus="" h2o2-treated="" group）.="" additionally，="" pcs（8="" and="" 16="" μg/ml）increased="" h2o2-induced="" reductions="" in="" cat="" and="" sod="" activities（figure="" 6e，f，p=""><0.05 versus="" h2o2-induced="">
Figura 6. Efectes dels PC sobre l'estrès oxidatiu en les larves de peix zebra tractades amb H2O2. (a) Les fotomicrografies representatives de fluorescència de larves de peix zebra;(b)ELS nivells de ROS es van mesurar mitjançant programari d'imatge; (c) Nivells D'MDA;(d) Activitat GSH-Px;(e)CATactivity;(f) activitat SOD. Les dades s'expressen com la mitjana ± SD. Tots els experiments es van dur a terme tres vegades. Els valors amb diferents lletres anteriors són significativament diferents (p< 0.05,="" one-way="">
2.7.Efectes dels PC en les vies Nrf2/ARE en peixos zebra tractats amb H2O2 Laroae
Els efectes protectors del tractament de PC en larves de peix zebra tractades amb H2O2 suggereixen que les vies Nrf2 / ARE podrien haver estat involucrades. Els nivells d'expressió de Nrf2, HO-1, NQO1, GCLC i GCLM (Figura 7a-e, p<0.05 versus="" h,="" o,-induced="" group)were="" up-regulated="" following="" pcs(16="" ug/ml)="" treatment="" compared="" to="" levels="" after="" h2o,="" treatment="">
Figura 7. Efectes dels PC a la via Nrf2/ARE en larves de peix zebra tractades amb H>O. (a) Nivells de Nrf2;(b)nivells de GCLC;(c)nivells GCLM;(d)nivells HO-1;(e)NQO1 nivells. Les dades s'expressen com la mitjana± SD. Els valors amb diferents lletres anteriors són significativament diferents (p<0.05, one-way="" anova="">
Aquest article s'extreu de Molecules 2021, 26, 2963. https://doi.org/10.3390/molecules26102963 https://www.mdpi.com/journal/molecules
