L'extracte de fulla d'olivera (OLE) altera el tràfic d'aquaporina-2 induït per vasopressina mitjançant l'activació del receptor de detecció de calci

Per a més informació. contacte:tina.xiang@wecistanche.com

La vasopressina (AVP) augmenta la permeabilitat a l'aiguarenalconducte col·lector mitjançant la regulació del tràfic d'aquaporines-2 (AQP2). Diversos trastorns, inclosa la hipertensió i la secreció inadequada d'hormona antidiürètica (SIADH), s'associen amb anomalies en l'homeòstasi de l'aigua. S'ha demostrat que certs fitocompostos són beneficiosos per a la salut humana. Aquí, els efectes de l'extracte de fulla d'olivera (OLE) s'han avaluat mitjançant models in vitro i in vivo. Els estudis confocals van demostrar que l'OLE impedeix la translocació d'AQP2 induïda per vasopressina a la membrana plasmàtica en cèl·lules MCD4 i rata.ronyons. La incubació amb OLE disminueix l'augment depenent de l'AVP del coeficient de permeabilitat a l'aigua osmòtica (Pf). Per dilucidar els possibles efectors de l'OLE, es va avaluar el calci intracel·lular. L'OLE augmenta el calci intracel·lular mitjançant l'activació del receptor de detecció de calci (CaSR).NPS2143 , un inhibidor selectiu de CaSR, va abolir l'efecte inhibidor de l'OLE sobre la permeabilitat de l'aigua depenent de l'AVP. Els experiments in vivo van revelar que el tractament amb OLE augmenta l'expressió de l'ARNm de CaSR i disminueix l'ARNm d'AQP2 paral·lelament a un augment de l'ARNm d'AQP2-orientat-137. En conjunt, aquestes troballes suggereixen que l'OLE antagonitza l'acció de la vasopressina mitjançant l'estimulació del CaSR, cosa que indica que aquest extracte pot ser beneficiós per atenuar els trastorns caracteritzats per una senyalització anormal de CaSR i que afecten la reabsorció renal d'aigua.

Les fulles de l'olivera s'han utilitzat àmpliament com a remeis tradicionals per curar diverses malalties, especialment als països mediterranis. Les fulles es consumeixen habitualment en la dieta humana com a extracte o pols per preparar infusions o infusions d'herbes. L'anàlisi de caracterització química va revelar que les fulles de l'olivera contenen diversos compostos bioactius que poden exercir efectes beneficiosos en determinades morbiditats com la síndrome metabòlica, la dislipèmia i la hipertensió. S'han trobat nombrosos polifenols com l'oleuropeïna, l'hidroxitirosol i el tirosol enriquits en un extracte de fulla d'olivera verda (OLE)5, i se sap que participen en la prevenció de certes malalties caracteritzades per l'estrès oxidatiu. Per tant, en els últims anys, l'interès per investigar els efectes beneficiosos potencials de l'extracte de fulla d'olivera està augmentant entre els científics de diferents camps d'investigació. L'OIE va mostrar un efecte antiproliferatiu significatiu en cèl·lules de mesotelioma maligne alterant la dinàmica intracel·lular del calci, possiblement dirigint-se a T- canals tipus Ca2 plus. Curiosament, es va trobar que l'OLE exercia efectes antihipertensius sobre la hipertensió genètica en rates espontàniament hipertenses (SHR), relacionats amb la millora de la funció vascular*. La reabsorció excessiva d'aigua té un paper important en la patogènesi de l'augment de la pressió arterial. En pacients hipertensos, tractats amb extracte de fulla d'olivera, es va trobar una reducció significativa de diversos factors inflamatoris associada a una disminució de la pressió arterial. A més, la retenció excessiva d'aigua caracteritza diversos trastorns com la cirrosi hepàtica, la insuficiència cardíaca i la secreció inadequada d'hormona antidiürètica (SIADH). L'homeòstasi de l'aigua corporal està estretament controlada per l'hormona antidiürètica vasopressina (AVP) que s'allibera en condicions de deshidratació. L'AVP s'uneix al seu receptor V2R cognat localitzat a la membrana basolateral derenalles cèl·lules principals activen així la via del senyal de cAMP que dóna lloc a la translocació de les vesícules que porten l'aquaporina-2(AQP2) des d'una piscina intracel·lular a la membrana plasmàtica apical on es produeix la reabsorció d'aigua. A nivell molecular, diversos factors poden modular l'equilibri hídric renal. Un nivell elevat de calci luminal va regular a la baixa el tràfic d'AOP2 depenent de la vasopressina a curt termini mitjançant l'activació del receptor sensor de calci (CaSR)1,12. D'altra banda, l'activació de CaSR en cèl·lules epitelials tubulars proximals renals immortalitzades condicionalment, aïllades de l'orina humana, va induir un augment significatiu del calci citosòlic i va reduir significativament l'augment de cAMP provocat per la forskolina (FK), un activador directe de l'adenilat cvclase3. , a les cèl·lules MCD4 del conducte col·lector renal, que expressen de manera estable el canal d'aigua AOP2, l'estimulació del CaSR va atenuar l'augment depenent de cAMP de la fosforilació d'AQP2 a la serina 256 que és un esdeveniment fonamental en la cascada de transducció del senyal activada per la vasopressina i que finalment va augmentar la permeabilitat a l'aigua4. ,15 A més, enronyórodanxes del ronyó de la medul·la interna del ratolí, l'activació del CaSR amb el calcimimètic NPS-R568 va provocar un augment significatiu de l'AQP2-orientat a miRNA-137, confirmant una estreta interacció entre la via del senyal CaSR i AQP{ {4}}permeabilitat de l'aigua depenent.17. En el present estudi, es van avaluar els efectes de l'extracte de fulla d'olivera, obtingut a partir del conreu local Coratina, sobre la funció AQP2 induïda per vasopressina en cèl·lules MCD4 del conducte col·lector renal que expressen de manera estable AOP2 i dDAVP. rates tractades injectades amb l'extracte. Proporcionem proves que el tractament OLE contraresta la resposta de la vasopressina a les cèl·lules renals, cosa que podria explicar en part el seu efecte diürètic. Curiosament, aquest efecte sembla estar relacionat amb l'activació induïda per OLE del CaSR, un receptor conegut per tenir una interacció negativa amb el receptor de vasopressina 2.

Més informació sobre els efectes del cistanche sobre el ronyó

Resultats

Efectes de l'OLE sobre la funció AQP2 induïda per vasopressina a les cèl·lules MCD4. Per investigar la possible implicació de l'OLE en la funció AQP2 dependent de la vasopressina,renalCom a model experimental es van utilitzar cèl·lules MCD4 del conducte de recollida, que expressaven de manera estable el receptor de vasopressina 2 (V2R) i l'AQP2 humà. Els estudis confocals (Fig. 1A) van revelar que, en comparació amb les cèl·lules tractades amb dDAVP, en les quals la tinció d'AQP2 es va localitzar a la membrana plasmàtica apical, el tractament amb OLE va impedir la localització de la membrana d'AOP2 induïda per l'estimulació amb dDAVP. D'acord amb aquestes observacions, el tractament OLE va alterar l'augment induït per dDAVP de la resposta osmòtica temporal (indicat com a 1/t a la Fig.1B) (OLE/dDAVP=88.70±1.86 per cent, n=292 cel·les enfront dDAVP=206,8±5,49 per cent, n=186 cel·les;p<0.001).altogether these="" findings="" suggested="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" principal="" cell="" permeability="" by="" preventing="" aqp2="" translocation="" from="" an="" intracellular="" vesicle="" pool="" to="" the="" apical="" plasma="" membrane.="" vasopressin-induced="" aop2="" trafficking="" is="" controlled="" by="" intracellular="" camp="" which="" stimulated="" the="" camp-dependent="" kinase="" (pka)1.="" further,="" to="" evaluate="" the="" functionality="" of="" the="" v2r="" in="" the="" presence="" of="" ole="" in="" terms="" of="" camp="" production,="" permeable="" 8-br-camp="" was="" used="" as="" an="" external="" source="" of="" camp.="" treatment="" with="" 8-br-camp="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" elicited="" by="" ole="" on="" osmotic="" water="" permeability(ole/8-br-camp="188.7±3.56%,n=293" cells="" vs="" ole="85.93±2.27%," n="238"><0.001).therefore, to="" evaluate="" whether="" treatment="" with="" ole="" regulates="" aqp2="" trafficking="" by="" fine-tuning="" intracellular="" camp="" level,="" fluorescence="" resonance="" energy="" transfer(fret)technology="" was="" applied.="" compared="" to="" untreated="" cells="" (ctr),="" normalized="" netfret="" signals="" are="" reduced="" with="" ddavp="" stimulation(ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.00l; fig.2a),consistent="" with="" a="" significant="" increase="" of="" intracellular="" camp.="" conversely,="" treatment="" with="" ole="" prevented="" the="" ddavp="" dependent="" decrease="" of="" netfront="" signals="" consistent="" with="" a="" decrease="" of="" the="" vasopressin="" dependent="" camp="" release="" (ole/ddavp="92.97±3.46%," n="211" cells="" vs="" ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells;=""><0.05; fig.2a).treatment="" with="" ole="" alone="" did="" not="" affect="" the="" intracellular="" cgmp="" level="" compared="" with="" cells="" left="" under="" basal="" conditions(ole="96.15±3.80%," n="184" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.05).besides, western="" blotting="" studies(fig.2b)revealed="" that="" treatment="" with="" ole="" significantly="" reduced="" the="" ddavp="" induced="" increase="" of="" aqp2="" phosphorylation="" at="" serine="" 256(aqp2-ps256),="" indicating="" that="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking,="" in="" response="" to="" ole,="" are="" dependent="" on="" camp-pka="" function.="" the="" phosphorylation="" level="" of="" aqp2-ps256="" in="" response="" to="" ole="" was="" not="" statistically="" different="" from="" the="" control="" even="" though="" it="" tended="" to="" be="" reduced.="" to="" gain="" insight="" into="" the="" molecular="" signals="" underlying="" the="" action="" of="" ole,="" intracellular="" calcium="" dynamics="" were="" evaluated.="" mcd4="" cells="" endogenously="" express="" a="" functional="" calcium-sensing-receptor(casr)20,="" which="" plays="" an="" important="" role="" in="" controlling="" aqp2="" expression="" and="" trafficking'4.long="" term="" incubation="" with="" ole(0.1="" mg/ml)slightly="" increased="" the="" intracellular="" calcium="" level="" compared="" with="" untreated="" cells(fig.3;="" ole="209.0±13.45" nm,n="128" cells="" ys="" ctr="163.3±8.957" nm,n="97cells:"><0.05).co-incubation with="" ole(0.1="" mg/ml)="" and="" the="" selective="" nps2143(1um)antagonist="" of="" the="" casr="" abolished="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" mobilization(ole/nps2143="168.8±11.43" nm,n="144" cells="" ys="" ole="209.0+13.45" nm.="" n="128"><0.05).to dissect="" further="" intracellular="" calcium="" signals="" in="" response="" to="" ole,="" functional="" experiments="" were="" also="" performed="" under="" acute="" stimulation="" with="" ole="" and="" nps2143.="" short-term="" treatment="" with="" ole="" (1="" mg/ml)="" evoked="" specific="" calcium="" oscillations(fig.4a)="" that="" were="" prevented="" when="" cells="" were="" pretreated="" with="" the="" selective="" casr="" inhibitor="" nps2143（10="" μm）.="" statistical="" analysis="" of="" the="" fluorescence="" responses（fig.="" 4b）revealed="" that="" incubation="" with="" ole="" increased="" cytosolic="" calcium="" by="" 97.06±6.93%(vs="" atp="" 100.00±2.28%).pretreatment="" with="" nps2143="" reduced="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" increase(ole/nps2143="18.87±2.17%,n=59" cells="" vs="" ole="97.06±6.93%," n="50" cell;=""><0.001).to deeper="" investigate="" whether="" the="" effect="" of="" ole="" on="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" occurred="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling,="" functional="" studies="" were="" performed="" as="" previously="" shown="" (fig.1b).="" interestingly,="" treatment="" with="" nps2143="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ole="" on="" avp-regulated="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.5;="" ole/ddavp/nps2143="190.4±7.15%," n="191 cells" vs="" ole/ddavp="88.70±1.86%,n=292"><0.001), suggesting="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" the="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling.="" compared="" to="" untreated="" cells,="" treatment="" with="" only="" nps2143="" did="" not="" affect="" the="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.="">

<0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" alt="Figure 2. Efects of OLE on AQP2 phosphorylation and cAMP production in MCD4 cells. (A) Evaluation of cAMP production by FRET experiments in MCD4 cells transiently transfected with H96 as described in the " materials="" and="" methods"="" section.="" histogram="" reports="" netfret="" measured="" in="" cells="" under="" basal="" conditions,="" treated="" with="" ddavp="" (100 nm="" for="" 30 min),="" ole="" (0.1 mg/ml="" o/n),="" or="" co-treated="" with="" ole="" and="" ddavp.="" te="" treatment="" with="" ddavp="" displayed="" a="" signifcantly="" higher="" camp="" production="" depicted="" as="" a="" reduced="" netfret="" signal.="" data="" are="" shown="" as="" single="" values="" in="" a="" scatter="" plot="" reporting="" means±s.e.m=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Efectes de l'OLE en els ronyons de rates injectades amb OLE.

Per investigar més a fons les accions de l'OLE, s'han realitzat estudis in vivo. Concretament, les rates han estat injectades amb OLE (250 mg/kg/dia) una vegada al dia durant tres dies. Alternativament, les rates van ser cotractades amb OLE, durant 3 dies, i dDAVP, durant 30 min. L'avaluació de l'ARNm de CaSR que es va aïllar del conducte col·lector renal de rates i processat per a la PCR en temps real (Fig. 6) va revelar un augment significatiu de l'ARNm de CaSR en OLE (OLE=1.87±0.29, n{{{ 10}} rates vs CTR=1,02±0,17, n=5 rates; p<0.05) and="" ole/ddavp(ole/ddavp="2.77±0.25," n="5" rats="" vs="" ctr="1.02±0.17,n=5" rats="" and="" ddavp="1.08±0.11," n="5" rats;=""><0.001)injected rats="" compared="" with="" control="" and="" ddavp="" animals,="" casr="" signaling="" can="" regulate="" the="" expression="" level="" of="" selective="" mirnas,="" which="" downregulated="" the="" expression="" level="" of="" aqp216.based="" on="" these="" findings,="" and="" considering="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" aqp2="" function,="" the="" level="" of="" mir-137,="" a="" known="" aqp2-targeting="" mir="" in="" the="" renal="" collecting="" duct,="" was="" evaluated.="" compared="" to="" control="" rats="" (fig.7),="" the="" level="" of="" mir-137="" in="" the="" renal="" collecting="" ducts="" of="" ole(ole="4.18.10-8±1.07.10-8ng,n=5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.05)and ole/ddavp="" rats="" was="" increased="" indicating="" that="" treatment="" with="" ole="" upregulates="" the="" casr="" signaling="" and="" the="" expression="" level="" of="" the="" mir-137(ole/ddavp="4.38.10-8±47.01·10-9ng," n="5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.01 and="" vs="" ddavp="2.1610-8±3.52.10-°ng," n="5"><0.05). to="" verify="" whether="" the="" increase="" of="" mir-137="" affected="" the="" expression="" level="" of="" aqp2,="" renal="" samples="" were="" processed="" for="" real-time="" pcr.="" data(fig.8a)revealed="" that="" the="" expression="" levels="" of="" aqp2="" mrna="" were="" lower="" in="" ole(ole="0.36±0.06,n=5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5"><0.01)and ole/ddavp(ole/ddavp="0.65±0.12," n="5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5" rats="" and="" ddavp="1.03±0.16,n=5" rats;=""><0.05)renal samples="" compared="" with="" specimens="" obtained="" from="" control="" animals.="" besides,="" western="" blotting="" analysis(fig.="" 8b)showed="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" the="" abundance="" of="" aop2="" regardless="" of="" ddavp="" stimulation(ole/ddavp="0.62±0.13,n=5" rats="" vs="" ddavp="1.04±0.16,n=5"><0.05)indicating that="" the="" ole-induced="" reduction="" of="" aqp2="" mrna="" expression="" level="" coincided="" with="" a="" decrease="" of="" aqp2="" protein="" content.="" to="" evaluate="" the="" effect="" of="" ole="" on="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking="" in="">ronyó, es van realitzar anàlisis de western blotting i estudis confocals (Fig. 9). En rates injectades amb OLE/dDAVP, la fosforilació d'AQP2 a la serina 256 es va reduir significativament en comparació amb els teixits renals dels animals tractats amb dDAVP (OLE/dDAVP=0). 77±0,16, n=5 rates vs dDAVP{=2,16±0,25,n=5 rates; p<0.001,fig.9a),thereby confirming="" the="" in="" vitro="" findings(fig.2b).="" besides,="" confocal="" studies="" (fig.9b)="" of="" kidney="" sections="" revealed="" that="" exposure="" to="" ole="" prevented="" the="" aop2="" mem-brane="" localization="" that="" instead="" was="" observed="" in="" ddavp="" treated="">

Discussió

El calci és un missatger intracel·lular important que modula una gran quantitat de funcions cel·lulars2. La senyalització anormal de calci pot provocar diverses malalties, com ara insuficiència cardíaca, càncer i hipertensió23. S'ha demostrat que el control específic de l'expressió i l'activitat de les proteïnes que controlen múltiples senyals de calci intracel·lulars té èxit per afrontar nombrosos trastorns i, per tant, és atractiu per al desenvolupament de fàrmacs. Aquest estudi proporciona nous coneixements sobre el mecanisme d'acció de l'OLE mostrant la seva capacitat per modular la senyalització intracel·lular de calci mitjançant l'estimulació del CaSR que participa en l'ajustament del tràfic i expressió d'AQP2 induït per vasopressina. En condicions fisiològiques, AQP2 té un paper important en el control de l'homeòstasi de l'aigua corporal25. L'estimulació de la maquinària intracel·lular, que condueix a la localització d'AQP2 a la membrana plasmàtica apical, provoca una retenció anormal d'aigua i la consegüent hiponatremia, com en la síndrome de secreció inadequada d'hormona antidiürètica (SIADH), cirrosi hepàtica i insuficiència cardíaca congestiva. En un ratolí. model de SIADH, associat a l'haploinsuficiència de la malaltia renal poliquística 1, el nivell de calci intracel·lular basal es va reduir significativament en comparació amb el nivell mesurat als conductes col·lectors de ratolins de tipus salvatge. El baix calci intracel·lular va regular a la baixa l'activitat de certs enzims, inclosa la proteïna fosfatasa PP2A, donant lloc a la regulació positiva de la fosforilació AOP2 a la serina 2561. Per contra. L'activació del CaSR amb el calcimimètic NPS-R568 va augmentar la concentració de calci intracel·lular i va reduir el nivell d'AMPc a les cèl·lules amb deficiència de PKD1. És important destacar que el calci citosòlic pot regular a la baixa la ciclasa adenilada inhibible pel calci3, ajustant així el nivell intracel·lular de cAMP. ciclasa4. En aquest estudi, el tractament amb OLE va evitar l'augment depenent de la vasopressina del cAMP i AOP2-pS256, possiblement secundari a un augment de la concentració intracel·lular de calci. Cal destacar que l'exposició a una font externa d'AMPc mitjançant 8-Br-cAMP permeable, va contrarestar significativament l'efecte inhibidor de l'OLE a la via V2R.

Un nivell elevat de calci citosòlic pot provocar la mort cel·lular i l'apoptosi. Tanmateix, un augment sostingut del calci intracel·lular de 250 nM a més de 600 nM va promoure la supervivència neuronal4. A les cèl·lules MCD4, el tractament amb OLE a 0,1 mg/ml no es mostra. un efecte citotòxic. A aquesta concentració, l'OLE (0,1 mg/ml) va augmentar lleugerament el nivell de calci intracel·lular. Les imatges de calci van revelar que l'estimulació aguda amb OLE va provocar un augment transitori del calci intracel·lular mitjançant l'activació del CaSR que s'elimina quan les cèl·lules es van preincubar amb l'antagonista selectiu del CaSR NPS2143, a les cèl·lules del túbul proximal renal, l'activació al·lostèrica del CaSR amb I-ornitina. va reduir la producció de ROS, regulant així l'estrès oxidatiu mitocondrial que va provocar l'apoptosi cel·lular356. A més, el nostre estudi anterior va demostrar que l'expressió de les variants de guany de funció del CaSR va reduir l'alliberament de ROS i la S-glutationilació d'AQP237. La incubació amb OLE va disminuir la generació de ROS a les cèl·lules MCD435 demostrant la seva capacitat antioxidant. No obstant això, de moment no està clar si l'OLE afecta la AOP2-S-glutationilació. Nombrosos estudis van revelar que l'OLE o l'oleuropeïna, que és el principal constituent de l'OLE, poden tenir funcions protectores en inhibir les morts cel·lulars,39 No obstant això, s'han descrit efectes dependents de la dosi en rates que reben OLE. Es van obtenir respostes beneficioses a dosis de 250 i 500 mg/kg. Per contra, a concentracions més altes, el tractament amb OLE pot tenir efectes nocius possiblement a causa de les accions pro-oxidants de diversos fitocompostos. En aquest estudi, les rates es van injectar amb OLE a una dosi de 250 mg/kg durant tres dies mostrant una regulació de CaSR. El nivell d'expressió del CaSR s'incrementa per certs compostos que actuen com a activadors al·lostèrics del receptor. Els calcimimètics, de fet, van disminuir les calcificacions vasculars augmentant la biosíntesi del CaSR a les cèl·lules musculars llises vasculars humanes0. En aquest concurs, no es pot excloure la possibilitat que determinats compostos de l'OLE puguin funcionar com a moduladors al·lostèrics del CaSR. D'altra banda, l'estimulació amb vasopressina pot conduir a l'alliberament d'IL-6 que pot contribuir a augmentar el nivell d'expressió del CaSR42.

Al ronyó, l'estimulació de la senyalització CaSR s'associa amb una regulació a la baixa de l'expressió AQP2 possiblement a través de la generació de miR-137. Els miRNA són moduladors posttranscripcionals fonamentals. També s'han descrit diversos miRNAs dependents de vasopressina dirigits a l'expressió d'AQP243. La transfecció amb miR-32 i miR-137 va reduir significativament el nivell d'expressió d'AOP2 a les cèl·lules mpkCCDc14. Curiosament, l'OLE pot atenuar els senyals inflamatoris i exercir efectes protectors mitjançant la modulació del nivell d'expressió de diversos miRNAs". En particular, a les cèl·lules de glioblastoma multiforme, l'OLE va promoure l'expressió de diferents miRNA inclòs el miR-13745 que està implicat en la regulació a la baixa de la via de senyalització Akt/mTOR 46. Cal destacar que el tractament amb oleuropeïna impedeix la senyalització Akt/mTOR mitjançant l'activació de CAMK i AMPK induïts per calci". L'activació de CaSR amb NPS-R568 activa AMPK i redueix l'activitat de mTOR en cèl·lules tubulars proximals humanes3. D'acord amb aquestes troballes, la incubació amb OLE augmenta el calci citosòlic, regula l'activitat de PKA i redueix la mida del quist en un model de cultiu de cèl·lules 3D48. En conjunt, aquestes troballes suggereixen que l'OLE pot ser útil en el tractament de trastorns caracteritzats per la desregulació de la dinàmica del calci intracel·lular relacionada amb la baixada de la senyalització CaSR.

L'extracte de fulla d'olivera consta de diversos components bioactius, inclosos polifenols, fibres i minerals49. De moment, no està clar si un compost o una combinació sinèrgica de fitocompostos en OLE pot ser beneficiosa per modular les respostes intracel·lulars. L'extracte utilitzat en aquest estudi s'ha aplicat com a possible additiu alimentari i, per tant, és important definir l'impacte fisiològic del propi extracte tenint en compte que diversos fenols, inclòs l'hidroxitirosol, poden ser filtrats pel ronyó i recuperats a l'orina50. Estudis posteriors proporcionaran l'eficàcia de components específics que poden regular activament la senyalització intracel·lular de calci mitjançant el CaSR. Per concloure, aquest estudi proporciona proves que l'OLE es pot considerar un nou adjuvant potencial útil per mitigar els trastorns caracteritzats per una reducció de l'expressió de CaSR, així com per senyalitzar i afectar la permeabilitat renal de l'aigua.

Materials i mètodes

Productes químics i anticossos.Tots els productes químics i antibiòtics es van comprar a Merck (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanya). Calcein-AM, Fura-2-AM, medis de cultiu cel·lular, sèrum boví fetal (FBS) i substrats quimioluminiscents Super Signal West Pico es van comprar a Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Aquaporin{ {2}}(AQP2) es va detectar mitjançant anticossos específics (C-tail Ab) generats contra un pèptid sintètic corresponent als darrers 15 aminoàcids C-terminals de l'AQP2 humà!. Els anticossos AQP2-pS256 van ser amablement regalats pel professor Peter Deen. Es van obtenir anticossos secundaris de cabra anti-conill acoblats a peroxidasa de rave picant de Merck (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanya). Es va comprar un anticòs secundari de cabra-anti-conill acoblat a Alexa-488 a Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA).

Producció d'extractes rics en fenòlics i caracterització química.La producció d'un extracte ric en fenòlics a partir de fulles d'olivera es va dur a terme tal com es va informar a Ranieri et al.35. Després de triturar amb una batedora (Waring-Commercial, Torrington, CT, EUA), es va afegir aigua ddH2O (proporció 1/20, w/a) i després es va sotmetre a ultrasons (CEIA, Viciomaggio, Itàlia) tres vegades , durant 30 min a 35±5 graus cada vegada. Finalment, els extractes es van filtrar a través de paper de filtre, es van liofilitzar i es van emmagatzemar a -20 grau C. Els extractes obtinguts es van filtrar amb filtres de niló de 0,45 μm (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanya) i es van utilitzar per a la caracterització química. El contingut total de fenols, l'activitat antioxidant i la identificació de compostos fenòlics individuals es van realitzar segons Difonzo et al.. L'OLE va mostrar un contingut de polifenols, determinat per Folin-Ciocalteu, igual a 195 mg. equivalents d'àcid gàlic (GAE) i una activitat antioxidant, determinada per ABTS (2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sal diamoni de l'àcid sulfònic), que representa 750 μmol TE (equivalents Trolox) .

Cultiu cel·lular i tractaments.Com a model experimental es van utilitzar cèl·lules MCD4 del conducte de recollida cortical del ratolí, que expressaven de manera estable AQP2 humana i el V2R-Rluc quimèric18. Les cèl·lules es van cultivar en una barreja 1:1 de medi d'àguila modificat amb Dalbec-cos i F-12 suplementat amb sèrum boví fetal al 5% (a/a). 1 per cent (a/a) L-glutamina i 1 per cent de penicil·lina/estreptomicina, 5 μM dexametasona, 400 ug/ml G418 (per a la resistència AQP2) i 1 ug/ml de puromicina (per a la resistència a V2R-Rluc) , en una atmosfera humidificada del 5 per cent de CO, a 37 graus. Les cèl·lules MCD4 es van deixar en condicions basals (CTR) o tractades a llarg termini amb OLE a 0,1 mg/ml O/N, dDAVP a 100 nM durant 30 min, o cotractades amb OLE i dDAVP o NPS2143 a l μM O/N .Alternativament, les cèl·lules es van exposar a 8-Br-cAMP a 500 μM durant 45 min. Es van realitzar experiments a curt termini amb OLE a 1 mg/ml durant 5 min i NPS2143 a 10 μM durant 15 min. Els experiments es van realitzar 3-5 vegades independentment utilitzant cel·les de diferents passatges.

Model animal i tractaments.Tots els procediments es van realitzar d'acord amb les directrius nacionals daneses per a la cura i el maneig d'animals d'experimentació i les directrius publicades dels Instituts Nacionals de Salut. Els protocols van ser aprovats per l'Institut de Medicina Clínica. Universitat d'Aarhus, segons les llicències per a l'ús d'animals d'experimentació emeses pel Ministeri de justícia danès (número d'aprovació 2015-15-0201-00658). Es van realitzar estudis en rates Wistar mascles adults amb un pes inicial de 200-225 g. Els animals es van mantenir amb una dieta estàndard de rosegadors (Altromin, Lage, Alemanya) i tenien accés gratuït a l'aigua de l'aixeta. Durant els experiments, les rates es van allotjar en grups de dos per gàbia, amb un cicle de llum-foscor de 12:12 h, una temperatura de 21 ± 2 graus C i una humitat del 55 ± 2 per cent. Es van tractar cinc rates amb injecció subcutània d'1 ng dDAVP (Sigma-Aldrich, Glostrup, Dinamarca) en 200 ul de solució salina/animal, i cinc rates tractades amb vehicles van servir de control. Després de 30 minuts, les rates van ser assassinades i els ronyons es van processar tal com es descriu a continuació.

Cèl·lules i lisats IMCD.Les cèl·lules es van cultivar en plats de {{{0}}mm i es van tornar a suspendre en un tampó que contenia 220 mM de manitol, 70 mM de sacarosa, {{10}}. 5 M EGTA pH 8,0,0,5 M EDTA pH 8,0,1 M Tris-HCl pH 7,4 en presència de proteases (PMSF 1 mM, leupeptina 2 mg/ml i pepstatina A 2 mg/ml) i fosfatases (NaF 10 mM i Inhibidors d'ortovanadat de sodi 1 mM. Alternativament, es van preparar seccions de ronyó d'aproximadament 0,5 mm i es van equilibrar durant 10 min en un tampó que contenia 1i8 mM NaCl, 16 mM Hepes, 17 mM Na-Hepes, 14 mM glucosa, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,8 mM i Mg. 1,8 mM de KH2PO4 (pH7,4). La papil·la renal es va picar amb tisores al mateix tampó en presència de proteases (PMSF 1 mM, 2 mg/mlleupeptina i 2 mg/mlpepstatina A) i fosfatases (NaF 10 mM i sodi 1 mM). Inhibidors de l'ortovanadat). Després de la sonicació (60 kHz durant 5 s), els lisats es van centrifugar a 12,000xg durant 10 min. Els sobrenedants es van recollir i es van utilitzar per a estudis d'immunoblotting'8.

Microscòpia confocal.Es van realitzar estudis confocals tal com es va descriure anteriorment1. Breument, les cèl·lules es van cultivar en insercions de PET de cultiu cel·lular i es van tractar com es descriu anteriorment. Alternativament, les seccions de ronyó obtingudes del control, OLE, dDAVP i OLE amb rates tractades amb dDAVP es van sotmetre a experiments d'immunofluorescència tal com es va descriure anteriorment. Les imatges es van obtenir amb un microscopi de fluorescència d'exploració làser confocal Leica TCS SP2 (Leica Microsystems, Heerbrugg, Suïssa). Electroforesi en gel i immunoblot. Les proteïnes es van separar en gels de poliacrilamida sense taques del 12% (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA) en condicions reductores tal com es va descriure anteriorment =5,52. Breument, les bandes de proteïnes es van transferir a membranes d'Immobilon-P (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanya) i es van immunoblotar mitjançant anticossos anti-AQP2 (Pre-C-tail Ab) i anti-AQP2-pS256. Els senyals immunoreactius es van obtenir mitjançant substrats quimioluminiscents Super Signal West Pico amb sistema Chemidoc (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA). Les bandes es van normalitzar a proteïnes totals mitjançant tecnologia sense taques (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA). L'anàlisi de densitometria es va realitzar mitjançant ImageLab (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA) i es va analitzar amb GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA).

Assaig de permeabilitat a l'aigua.La permeabilitat a l'aigua osmòtica es va mesurar tal com es va descriure anteriorment43. Breument, les cèl·lules MCD4 es van cultivar sobre cobertors de vidre de 40- mm. Després dels tractaments, les cèl·lules es van carregar amb 10 μM de Calceïna-AM permeable a la membrana durant 45 min a 37 graus, 5 per cent de CO, en DMEM/F-12. Els cobreobjectes es van muntar en una cambra de perfusió (FCS2 Closed Chamber System, BIOPTECHS, Butler, EUA). Les mesures es van realitzar mitjançant un microscopi TE2000-S invertit (microscopi Nikon Eclipse, Tòquio, Japó) equipat per a mesures de fluorescència unicel·lular. i anàlisi d'imatges. Les mostres carregades amb Calcein-AM es van excitar a 490 nm. Mesures de fluorescència, després de solucions isomòtiques (NaCl 140 mM, 5 mM KCl, MgCl 1 mM. . es van realitzar amb el programari Metafluor (Molecular Devices, MDS Analytical Technologies, Toronto, Canadà). Es van registrar les dades de fluorescència del temps després de la perfusió de cèl·lules amb solucions iso-i hiperosmòtiques. El curs temporal de la contracció cel·lular es va mesurar com la constant de temps (Ki, expressada com a 1/r, seg), un paràmetre correlacionat amb la permeabilitat a l'aigua, obtinguda ajustant les dades amb una funció exponencial analitzada mitjançant GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego). , CA, EUA).

Mesures de transferència d'energia per ressonància de fluorescència.Per avaluar els canvis d'AMPc intracel·lular, es va aplicar la tecnologia de transferència d'energia de ressonància de fluorescència (FRET). Per als experiments FRET, les cèl·lules es van transfectar amb un plasmidi que codificava el sensor H96 que contenia el motiu de consens d'unió a cAMP d'EPAC1 incrustat entre la proteïna fluorescent cian (CFP) i cp173Venus-Venus, tal com es mostra anteriorment 32.33.54. El plasmidi que codifica la sonda H96 va ser un regal del Dr.K. Jalink. La visualització de cèl·lules que expressen ECFP i/o EYFP i la detecció de FRET es va realitzar mitjançant un microscopi TE2000-S invertit (microscopi Nikon Eclipse, Tòquio, Japó). Cada imatge es va corregir i analitzar com es mostra anteriorment55.

Mesures de calci intracel·lular. Les mesures de calci intracel·lular es van realitzar com es va mostrar anteriorment56. Breument, les cèl·lules MCD4 es van carregar amb 4 μM Fura-2 AM durant 15 min a 37 graus en DMEM/F-12. La solució de Ringer es va utilitzar per perfondre cèl·lules durant l'experiment que contenia 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl, 10 mM de HEPES, 5 mM de glucosa, 1,8 mM de CaCl, pH 7,4. En mesures de fluorescència, els cobreobjectes amb cèl·lules sobrecarregades es van muntar en una cambra de perfusió (FCS2 Closed Chamber System. BIOPTECHS. Butler, EUA). Les mesures es van realitzar mitjançant un microscopi TE2000-S invertit (microscopi Nikon Eclipse, Tòquio. Japó), es va representar la relació de les intensitats de fluorescència a 340 i 380 nm i es va calcular com el canvi de fluorescència. En particular, l'estimulació amb OLE (1 mg/ml) o NPS2143 (10 μM) es va comparar en el mateix tipus de cèl·lula amb les obtingudes després de l'estimulació amb una dosi màxima de l'agonista mediat per calci ATP (100 μM) que es va utilitzar com a control intern (100 per cent).

El nivell de calci intracel·lular es va mesurar en estat estacionari i es va calibrar tal com descriu Grynkiewicz57. OLE i NPS2143 es van utilitzar a llarg termini a 0.1 mg/ml i l uM, respectivament, i cada mostra es va calibrar mitjançant l'addició de 5 μM d'ionomicina en presència d'1 mM EGTA (Rm.) seguida de 5 Ionomicina μM en CaCl 5 mM, (RMA).

Anàlisi PCR en temps real de l'ARNm d'AQP2 i CaSR en rates control i tractades.Es van realitzar experiments de PCR en temps real per mesurar l'expressió relativa de l'ARNm al conducte col·lector de la medul·la interna (IMCD) aïllat de les papil·les de ronyó de rata de control i tractades. Es van fer rodanxes de ronyó d'uns 0,5 mm i es van equilibrar durant 10 min en un tampó que contenia 118 mM NaCl, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM glucosa, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2,1,8 MgSO4 mM i KH2PO4 1,8 mM (pH 7,4). La papil·la renal es va aïllar sota un estereomicroscopi. A continuació, es van picar mostres de rates control i tractades amb una tisora ​​directament a Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). La transcripció inversa es va realitzar amb 2,5 ug d'ARN total mitjançant SuperScriptVilo Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA), d'acord amb els suggeriments del fabricant (25C durant 10 min; 42C durant 60 min; 85C durant 5 min). L'amplificació de PCR en temps real es va realitzar utilitzant TagMan Fast Advanced Master Mix amb assajos CaSR, AOP2 i GAPDH (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) al sistema StepOne de PCR en temps real (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). ), establint les condicions de cicle tèrmic tal com especifica el fabricant (95 graus C durant 20 s; 40 cicles alternativament a 95 °C durant 1 s i 60 graus C durant 20 s). Els resultats es van expressar com a 2- valors (quantificació relativa) amb △ACt=(Ct objectiu-Ct GAPDH) tractat-(Ct objectiu-Ct GAPDH)Sham1.

Avaluació de miRNA-137 en rates control i tractades.El contingut de miRNA{{{0}} en el conducte de recollida de la medul·la interna de la rata controlada i tractada es va avaluar mitjançant TagMan Advanced miRNA Assays (has-miR{-137; Assay ID; 477904 mir; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). .USA), que va permetre una notificació molt sensible i específica de miRNA madur mitjançant PCR quantitativa. Es van fer rodanxes de ronyó d'uns 0,5 mm i es van equilibrar durant 10 min en un tampó que contenia 118 mM de NaCl, 16 mM de HEPES, 17 mM de Na-Hepes, 14 mM de glucosa, 3,2 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl2, 1,8 mM de MgSO4m i 1,8 mM de MgSO4 m. KH2PO4(pH7,4).La papil·la renal es va aïllar sota un estereomicroscopi. A continuació, es van picar mostres de rates control i tractades amb una tisora ​​directament a Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) per extreure l'ARN total. TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit （Catàleg n²∶A25576; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) es va utilitzar per obtenir la síntesi d'ADNc, segons el protocol proporcionat pel fabricant (reacció de cua Poly(A); reacció de lligament; reacció de transcripció inversa; reacció miR-Amp). L'ARN sintètic (UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG) amb 59-fòsfor va ser sintetitzat per Thermo Fisher Scientific i es va utilitzar per realitzar una corba de calibratge per interpolar els valors de la mostra de miRNA i per obtenir una avaluació precisa (en nanograms) del contingut de miR-137 en mostres16, utilitzant GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA).

Anàlisi estadística.Tots els valors es presenten com a mitjans ± SEM L'anàlisi estadística es va realitzar mitjançant ANOVA unidireccional seguida de la prova de comparacions múltiples de Newman-Keuls amb * p<0.05 considered="" statistically="" different="">

Declaracions, aprovació ètica i consentiment per participar.Els estudis en animals es van realitzar d'acord amb les directrius nacionals daneses per a la cura i el maneig d'animals d'experimentació i les directrius publicades dels Instituts Nacionals de Salut. El comitè d'ètica de la cura dels animals de l'Institut de Medicina Clínica de la Universitat d'Aarhus va aprovar els protocols d'estudi, segons les llicències per a l'ús d'animals d'experimentació emeses pel Ministeri de Justícia danès (número d'aprovació 2015-15-0201-00658). Els autors confirmen que tots els mètodes es van dur a terme d'acord amb les directrius i regulacions pertinents. A més, els autors confirmen que l'estudi es va dur a terme d'acord amb les directrius ARRIVE.

Referències

1. El, SN & Karakaya, S. L'olivera (Olea europaea) deixa potencials efectes beneficiosos sobre la salut humana. Nutr. Rev. 67, 632–638.

2. Javadi, H., Yaghoobzadeh, H., Esfahani, Z., Reza Memarzadeh, M. & Mehdi Mirhashemi, S. Efectes de l'extracte de fulla d'olivera sobre la resposta metabòlica, les funcions hepàtiques i renals i els biomarcadors inflamatoris en pacients hipertensos. PJBS 22, 342–348.

3. Saibandith, B., Spencer, JPE, Rowland, IR & Commane, DM Polifenols d'oliva i la síndrome metabòlica. Molècules

4. Cherif, S. et al. Un assaig clínic d'un extracte d'olea titulat en el tractament de la hipertensió arterial essencial. J. Pharm. Belg. 51, 69–71 (1996).

5. Difonzo, GRA et al. Els extractes verds del conreu d'olivera cortina deixen caracterització antioxidant i activitat biològica. J. Funct. Aliments 31, 8.

6. Herrero, M. et al. Noves possibilitats per a la valorització dels subproductes de l'oli d'oliva. J. Cromatogr. 1218, 7511–7520.

7. Marchetti, C. et al. L'extracte de fulla d'olivera enriquit amb oleuropeïna afecta la dinàmica del calci i perjudica la viabilitat de les cèl·lules malignes del mesotelioma. eCAM 2015, 908493.

8. Romero, M. et al. Efectes antihipertensius de l'extracte de fulla d'olivera enriquit amb oleuropeïna en rates espontàniament hipertenses. Food Function 7, 584–593.

9. Hall, JE Disfunció renal, més que disfunció vascular no renal. Media la hipertensió induïda per la sal. Circulació 133, 894–906.

10. Wilson, JL, Miranda, CA i Knepper, MA Vasopressina i la regulació de l'aquaporina-2. Clin. Exp. Nefrol. 17, 751–764.