Els àcids grassos omega-3 augmenten SIRT1/3, activen PGC-1 mitjançant la desacetilació i indueixen la producció de Nrf1 en el model de rata de nefrectomia 5/6
Mar 10, 2022
Introducció
Ronyonsestan implicats en la regulació de diverses funcions, com ara diverses vies metabòliques, l'equilibri d'aigua i electròlits, el control de la pressió arterial i la producció de diverses hormones. Com que aquestes funcions consumeixen una enorme energia,ronyonssón rics en mitocondris [1]. Els mitocondris poden adaptar-se a diferents condicions metabòliques mitjançant la regulació d'objectius mecanicistes de rapamicina (mTOR) i vies de detecció de nutrients mediades per proteïna cinasa activada per AMP (AMPK) per mantenir una població mitocondrial sana [2]. Entre els estudis sobre mitocondris, fins ara, només hi ha uns quants estudis sobre la biogènesi mitocondrial. La majoria dels estudis relacionats amb la biogènesi mitocondrial es basen en norenalteixit [3,4], i estudis sobreronyonses relacionen principalment amb els agutslesió renal(AKI), models animals, cèl·lules tubulars proximals i nefropatia diabètica [5–7]. Tot i que la biogènesi mitocondrial pot relacionar-se amb la patogènesi de la disfunció mitocondrial en la crònica no diabèticamalaltia de ronyó (CKD), la investigació sobre aquest tema també és molt limitada. La CKD i la biogènesi mitocondrial estan relacionades amb la malaltia cardiovascular [8,9]. Millorar la biogènesi mitocondrial pot ser beneficiós per a la cardioprotecció en la ERC. Es va realitzar un estudi que indica que els àcids grassos omega-3 (AG) faciliten la biogènesi dels mitocondris es va realitzar mitjançantronyóteixits [3,10]. Un estudi recent va demostrar un paper prometedor dels omega-3 FA en la biogènesi mitocondrial en models animals amb malalties cardiovasculars i neurodegeneratives [11]. Per tant, en el present estudi, hem volgut investigar la biogènesi mitocondrialronyonsde 5/6 rates de nefrectomia (Nx). A més, vam avaluar l'efecte dels omega-3 FA sobre la biogènesi mitocondrial mitjançant aquest model.
Paraules clau:factor respiratori nuclear 1; factor nuclear eritroide 2-factor 2 relacionat; sirtuïna 1; sirtuïna 3; àcids grassos omega-3; ronyó, renal
CISTANCHE MILLORARÀ LA MALALTIA RENAL/RENAL
2. Resultats
2.1. Canvis en la funció renal i troballes histològiques
En comparació amb el grup control, el nivell de nitrogen ureic en sang (BUN) als grups Nx i Nx tractats amb omega{{0}} FA es va incrementar significativament (grup control 17,7 ± 1,5, grup Nx 77,7 土 28,4 i tit amb omega-3 grup FA 63,9 土 17.0 mg/dL, p = 0.{{20}}07). Tot i que no hi va haver cap diferència significativa entre els grups Nx i Nx tractats amb omega-3 FA, els nivells de BUN van ser numèricament més baixos en el grup Nx tractat amb omega-3 FA. El nivell de creatinina sèrica (sCr) entre els tres grups era similar al de BUN (grup control, 0.4th 0.U; grup Nx, 1.3 土 0.6; omega-3 FA, 1.0 ± 0,3 mg/dL; y=0,008). En comparació amb el grup control, es va observar una dilatació i atròfia tubular severa mitjançant la tinció de PAS al grup Nx (figura suplementària S1). A més, els resultats van mostrar que el grup Nx tractat amb omega-3 FA presentava menys canvis tubulointersticials que el grup Nx. Elfunció renali els canvis histològics en els tres grups ja s'han informat en un estudi anterior [12].
22 Canvis en els factors relacionats amb la biogènesi mitocondrial
2.2.1. Expressió Nrf1 i Nrf2.En comparació amb el grup control, el grup Nx va mostrar una disminució significativa del nivell d'expressió del factor nuclear respiratori 1 (Nefl) i del factor nuclear eritroide 2-factor 2 (Nrf2). Tanmateix, en el grup Nx tractat amb omega-3 FA, el nivell d'expressió de Nrf1 i Nrf2 va augmentar significativament en comparació amb el grup Nx, però no va assolir el nivell del grup control (Oigure P, figura suplementària St) . Aquests resultats també es van trobar cn Nrf1 mRNA anàlisi quantitativa de PCR en temps real (figura suplementària S3).
2.2.3. Expressió de factors relacionats amb PGC-1 Activitat: pAMPK, SIRT1/3.En comparació amb el grup control, els grups Nx i Nx tractats amb omega-3 van mostrar nivells significativament més baixos d'AMPK fosforilada (la proporció de carbassa a AMPK) (figura 3A). A més, el grup Nx va mostrar un nivell significativament més baix d'expressió de sirtuina 1 (SIRT1) en comparació amb el grup control (figura 3B, figura suplementària S6). Tanmateix, després de l'addició d'omega-3 FA, l'expressió SIRT1 va augmentar relativament, però aquesta diferència no va ser estadísticament significativa. Aquests resultats es van trobar a l'anàlisi quantitativa de PCR en temps real d'ARNm SIRT1 (figura suplementària S7). Per contra, l'expressió de sirtuïna 3 (SIRT3) es va reduir significativament al grup Nx en comparació amb el grup control, que es va rescatar significativament al grup Nx tractat amb el grup omega -3 FA (figura 3C).
2.2.4. Expressió de Keap1, mTOR, FoxO1 i FoxO3, en comparació amb el grup control, l'expressió de la proteïna 1 associada a EC H-like Kelch (Keap1) i les proteïnes de la caixa Forkhead O1 i O3 (FoxO1/3) va augmentar significativament al grup Nx . En el grup Nx tractat amb el grup omega-3 FA, el nivell d'expressió de Keap1 i FoxO1/3 es va reduir significativament en comparació amb el grup Nx (figura 4C, E, F). En comparació amb el grup control, l'expressió de mTOR es va reduir significativament al grup Nx. Tanmateix, al grup Nx tractat amb omega-3 FA, l'expressió mTOR es va rescatar, però no va assolir el nivell del grup control (figura 4B)
2.2.5. Contingut d'ADN mitocondrial (ADNmt), es va observar una reducció significativa de l'ADNmt en el grup Nx en comparació amb el grup control. Tanmateix, la quantitat de reducció d'ADNmt es va recuperar significativament al grup omega -3 Nx tractat amb Nx (figura suplementària S9).
3. Discussió
PGC-1, que s'activa mitjançant la fosforilació i la desacetilació, és el regulador principal de la biogènesi mitocondrial i la producció d'energia. Hem trobat una disminució de l'expressió i desacetilació de PGC-1 en el model CKD. Cal destacar que la disminució de la desacetilació de PGC-1 és el principal mecanisme que contribueix a la biogènesi mitocondrial disfuncional i la reducció de la producció d'energia en la CKD. AMPK activa PGC-1 mitjançant la fosforilació dels seus residus de treonina o serina [13, 14]. L'AMPK també s'activa després de la fosforilació quan la relació AMP/ATP és alta. Tanmateix, se sap que l'AMPK està inactivada en la CKD a causa de la detecció deteriorada dels nivells elevats d'AMP [15, 16]. De manera similar amb estudis anteriors, vam demostrar que la fosforilació d'AMPK es va reduir significativamentronyóteixit del grup Nx. Tot i que pPGC-1/PGC-1 sembla augmentar fins a cert punt en el grup Nx, és poc probable que augmenti el nivell de fosforilació de PGC-1 a causa de la disminució de PGC{{3 }} expressió. A més, el Nx tractat amb el grup omega-3 FA també va mostrar resultats similars als del grup Nx, la qual cosa indica que l'administració d'omega-3 FA no va afectar la fosforilació d'AMPK i PGC{{6} } . La desacetilació pot ocórrer en tota la seqüència de PGC-1, i SIRT1 i 3 tenen un paper important en el procés de desacetilació [13,14]. Després de l'administració d'omega-3 FA, el nivell d'expressió de PGC-1 , SIRT1 i 3 va augmentar, donant lloc al rescat de PGC desacetilat-1 al mateix nivell que el del grup control normal . El rescat del nivell d'expressió de Nrf1 i Nrf2, que es demostra en el grup Nx tractat amb omega-3 FA, està directament relacionat amb l'augment del nivell d'expressió SIRT1 i 3, que va conduir encara més a la desacetilació de PGC{ {22}} .
CISTANCHE MILLORARÀ LA FUNCIÓ RENAL/RENAL
Estudis recents sobre mitocondris amalaltia de ronyóhan demostrat que l'augment del nivell d'expressió PGC- 1 o SIRT mitjançant intervencions genètiques o farmacològiques ha milloratdany renalen models animals AKI [5–7,17,18]. El mecanisme subjacent implica l'efecte de la millora en l'oxidació de FA o la resposta antioxidant. Un estudi anterior va informar que l'administració d'omega-3 FA va millorar la beta-oxidació mitocondrial de FA i va mostrar efectes antioxidants en un model de rata 5/6 Nx [19]. També hi ha informes que suggereixen que omega-3 FA augmenta l'expressió de PGC-1, Nrf1 i SIRT1 a les cèl·lules musculars, els macròfags i les cèl·lules nervioses [3,10,11]. Com que encara no s'han informat els efectes dels omega-3 FA sobre els mitocondris en un model d'ERC, hem demostrat que els omega-3 FA són eficaços per recuperar les molècules relacionades amb la biogènesi mitocondrial i l'ADNmt mitjançant un model d'ERC. estudiar.
Tant mTOR com AMPK estan implicats en la biogènesi mitocondrial, però les seves funcions varien en funció de l'estat nutricional. mTOR, un objectiu del complex 1 de rapamicina (mTOC1), es pot activar mitjançant estímuls energètics, com ara aminoàcids o glucosa, i pot desencadenar vies que condueixen a processos anabòlics i biogènesi mitocondrial. Per contra, l'AMPK es pot activar mitjançant hipòxia i dèficits nutricionals, la qual cosa condueix a l'activació del procés catabòlic i la biogènesi mitocondrial, i inhibeix el consum d'energia mitjançant mTOC1 [2]. En aquest estudi, no només vam demostrar una disminució de pAMPK/AMPK, sinó també una disminució de mTOR en el model CKD. A més, l'administració d'omega-3 FA va provocar una recuperació gairebé de l'expressió mTOR, però cap recuperació de la disminució de pAMPK/AMPK. Per tant, els omega-3 FA podrien alleujar la disminució de la biogènesi mitocondrial augmentant l'expressió de mTOR a laronyonsd'un model animal d'ERC. Tanmateix, cal fer més estudis per aclarir si mTOR disminueix en pacients amb ERC i com l'augment de l'expressió de mTOR mitjançant el tractament amb omega-3 FA afectarà la salut mitocondrial i la progressió de la CKD.
FoxO1 i 3 s'uneixen al promotor PGC-1 i milloren la seva transcripció [20,21]. Tanmateix, en aquest estudi, es va trobar que FoxO1 i 3 augmentaven en el grup Nx i disminuïen en els grups control i Nx tractats amb omega-3 FA. Per tant, se suposa que l'expressió de FoxO1 i 3 és rellevant per a la resposta compensatòria per disminuir la PGC-1 en la CKD o augmentar la PGC-1 mitjançant l'administració d'omega-3 FA. Nrf2 té un paper important en l'homeòstasi redox cel·lular i la biogènesi mitocondrial. Hi ha tres sistemes d'ubiquitin-ligasa relacionats amb la degradació de Nrf2 (Keap1, proteïna que conté repeticions de transducina i E3 ubiquitin-ligasa sinovial) [22]. En aquest estudi, vam mostrar una disminució significativa de Nrf2 i un augment significatiu de Keap1 en el grup Nx en comparació amb el grup control.d No obstant això, en el grup Nx tractat amb omega-3 FA, es va trobar l'expressió de Keap1 disminuir i augmentar Nrf2. Els resultats suggereixen que l'efecte antioxidant millorat de l'administració d'omega-3 FA en el model de rata CKD pot estar relacionat amb la disminució de l'expressió de Keap1 i la degradació de Nrf2, que podria millorar la biogènesi mitocondrial. A partir dels resultats obtinguts en aquest estudi, es necessiten més investigacions per dilucidar la relació causal entre FoxO1/3 i Nrf2 a l'entorn de la CKD i l'efecte de l'administració d'omega-3 FA.
CISTANCHE MILLORARÀ LA INFECCIÓ RENAL/RENAL
El pes molecular de Nrf2 es va trobar a l'àrea de 68 kilodaltons (kDa) en aquest estudi i en altres estudis recents [23,24]. Tanmateix, estudis anteriors van indicar que un pes molecular biològicament rellevant de Nrf2 és de 95-110 kDa amb evidència [25, 26]. També vam trobar bandes que es sospitaven com a Nrf2 biològicament rellevants (figura suplementària S8). Es necessiten més estudis per trobar el pes molecular de Nrf2 biològicament important. En estudis anteriors, s'han informat els canvis en els mitocondris el 28è dia després de 5/6 Nx, que indicaven una disminució de l'expressió gènica o proteica associada a la beta-oxidació, la fosforilació oxidativa i la proteïna estructural de la membrana interna, però no hi va haver resultat. relacionat amb l'expressió PGC-1 [27,28]. En aquest estudi, vam confirmar que les molècules relacionades amb la biogènesi mitocondrial i l'ADNmt que reflectien la biogènesi mitocondrial es van modular durant l'etapa crònica, ja que els canvis es van observar el dia 45 després de 5/6 Nx en rates. Malgrat les millores histològiques i biològiques, el tractament amb omega-3 FA no va donar lloc a la recuperació funcional deronyonsen comparació amb el model Nx. Per tant, cal investigar més per determinar si els omega-3 FA són efectius per restaurarfunció renalinduint efectes que podrien millorar la funció mitocondrial. Hi ha diverses limitacions en aquest estudi. En primer lloc, no vam avaluar l'activitat de la citrat sintasa i la formació de superòxids a la cadena de respiració mitocondrial. En segon lloc, no vam experimentar amb quins components FA d'Omacor es veuen afectats principalment en molècules relacionades amb la biogènesi mitocondrial. En tercer lloc, no vam demostrar un mecanisme clar per millorar les molècules relacionades amb la biogènesi mitocondrial. Només suggerim que l'efecte antiinflamatori, que redueix l'estrès oxidatiu i els propis àcids grassos omega-3 com a compostos metabòlics, pot estar relacionat amb el mecanisme.
4. Materials i mètodes Biogènesi mitocondrial
4.1. Animals i disseny experimentalEs van realitzar estudis sobre rates Sprague-Dawley mascles (9-setmanes d'edat) comprades a Japan SLC, Inc. (Shizuoka, Japó). Totes les rates van ser sotmeses a un control simulat o a 5/6 Nx. Tots els procediments amb animals es van realitzar d'acord amb l'aprovació del Comitè Institucional de Cura dels Animals de la Universitat Dong-A (DIACUC-14-4). Les rates es van mantenir en condicions estàndard i es van permetre l'accés lliure a l'aigua de l'aixeta i a una dieta estàndard. Totes les rates es van assignar als grups següents: grup 1 (control simulat, n=6), rates control mantingudes en solució salina (1 ml/kg/dia mitjançant rentat gàstric); grup 2 (grup Nx, n=6), rates Nx mantingudes amb solució salina (1 ml/kg/dia per rentat gàstric); grup 3 (grup omega-3 FA), rates Nx tractades amb omega-3 FA. La dosi i la via d'administració dels omega-3 FA (Omacor, 300 mg/kg/dia per sonda gàstrica, Pronova Biocare, Sandefjord, Noruega) es van determinar a partir d'estudis anteriors [19]. Omacor és omega-3 FA d'origen marí i està format per 460 mg d'àcid eicosapentaenoic (EPA) i 380 mg d'àcid docosahexaenoic (DHA) en 1 g d'Omacor. Generalment, Omacor es prescriu per a la prevenció secundària després d'un infart de miocardi i un tractament amb hipertrigliceridèmia [29]. Dos omega-3 FA (EPA més DHA) són components principals (84 per cent) i actius d'Omacor, que es preparen farmacèuticament
composicions que superen components menors (16 per cent). Vam triar Omacor per a la suplementació amb omega-3 FA amb antiinflamatori i reduint l'estrès oxidatiu perquè va reduir el risc de malalties cardiovasculars en els estudis clínics [30]. Les rates es van alimentar de manera uniforme i el seu pes es va observar diàriament. A les rates se'ls va permetre l'accés lliure a l'aigua de l'aixeta durant 15 setmanes després de la cirurgia i després es van sacrificar amb anestèsia amb èter dietílic. A la mort, es va recollir una mostra de sang aòrtica i després es va centrifugar a 3000 rpm durant 10 min. Per identificar canvis enfunció renalEls nivells de , BUN i sCr es van mesurar mitjançant un analitzador automàtic (Roche, Alemanya).
4.2. Exploració histopatològica.Fixat amb formolronyóels teixits es van incrustar en parafina, es van tallar en rodanxes (4 µm) i es van tenyir amb àcid periòdic-Schiff. Es van observar canvis histopatològics amb Aperio ScanScope (Aperio Technologies, Vista, CA, EUA).
4.3. Aïllament d'ARN i anàlisi quantitativa de PCR en temps real.Es va extreure l'ARN totalronyóteixits utilitzant el reactiu TRIzol. A continuació, es va convertir 1 µg d'ARN total en ADNc monocatenari mitjançant el kit de síntesi d'ADNc M-MLV (Enzynomics, Daejeon, Corea). Els cebadors es van dissenyar a partir de seqüències gèniques respectives mitjançant el programari Primer3 i mfold. Per a l'anàlisi quantitativa de PCR en temps real, l'ADNc es va sotmetre a una amplificació per PCR mitjançant cebadors específics del gen: rata PGC1 50- CCG AGA ATT CAT GGA GCA AT-30(sentit), 50- GTG TGA GGA GGG TCA TCG TT-30(antisentit); rat Nrf1 50- GTT TCA TGG ACC CAA GCA TT-30(sentit), 50- GGT GGC CTG AGT TTG TGT CT-30(antisentit); rata SIRT3, 50- GAG ACT TGG TGG GGT CCT TT -30(sentit), 50- ATC CTG CAG CTC TTG TGT CC -30(antisentit); rata SIRT1, 50- CAG GTT GCA GGA ATC CAA AG -30(sentit), 50- CTC CAC GAA CAG CTT CAC AA -30(antisentit); rata -actina, 50- GCG CAA GTA CTC TGT GTG GA -30(sentit), 50- CAT CGT ACT CCT GCT TGC TG -30 (antisentit). La PCR en temps real es va realitzar mitjançant SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) amb un instrument ABI 7500 (Applied Biosystems, Waltham, MA, EUA).
CISTANCHE MILLORARÀ EL DOLOR RENAL/RENAL
4.4. Western Blotting i immunoprecipitació.El Western blotting es va analitzar tal com es va descriure anteriorment amb lleugeres modificacions [10].Ronyóels teixits es van homogeneïtzar mitjançant tampó de lisi (solució d'extracció de proteïnes PRO-PREP), es van incubar (30 min a 4 ◦C) i es van centrifugar (14, 000 rpm durant 20 min a 4 ◦C). La concentració de proteïnes es va determinar mitjançant el reactiu d'assaig de proteïnes Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). La mostra de proteïna igual es va carregar en una SDS-PAGE del 7,5-15 per cent i es va transferir a una membrana de nitrocel·lulosa (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EUA). Després, les proteïnes es van immunoblotar amb cada anticòs. Els anticossos contra PGC-1 i SIRT1 es van obtenir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). Els anticossos contra AMPK, pAMPK, Nrf1, SIRT3, FoxO1, FoxO3a i mTOR es van comprar a Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA). Els anticossos contra Nrf2, Keap1 (monòmer) i -actina es van comprar a Abcam (Cambridge, MA, EUA) i Sigma (St. Louis, MO, EUA). Per a la immunoprecipitació, es van incubar un total de 500 µg de proteïna amb anticossos PGC-1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) i proteïna A/G més perles d'agarosa (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), i es deixa barrejar a 4 ◦C durant la nit. A continuació, es van separar els immunoprecipitats mitjançant electroforesi SDS-PAG i es van immunoblotar mitjançant anticossos acetil-lisina (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA) i fosforesina (MerckMillipore, Burlington, MA, EUA). Les membranes es van incubar posteriorment amb anticossos secundaris conjugats amb peroxidasa de rave durant 60 min a temperatura ambient. Els nivells de proteïnes es van estandarditzar per -actina (ImageJ versió 1.48q). L'anàlisi de Western blotting i immunoprecipitació amb anticossos es va realitzar mitjançant el substrat de quimioluminescència millorat Super Signal West Pico (Thermo Scientific, Hudson, NH, EUA) i es va detectar mitjançant LAS-3000 Plus (Fuji Photo Film, Tòquio, Japó).
4.5 Mesurament del contingut d'ADNmtLa qPCR es va utilitzar per determinar el contingut relatiu de mtDNA. La reacció es va realitzar mitjançant la química SYBR Green utilitzant 3 ng d'ADN total com a plantilla i els primers següents: ADNmt de rata 5'-GGTTCTTACTTCAGGGCCCATCA-3' (sentit), 5,-TGATTAGACCCGTTACCA TCGA-3' ( antisentit); p-actina de rata, 5'- CCCAGCCATGTACGTAGCCA (sentit), C- CGTCTC- CGGAGTCCATCAC f (antisentit). El contingut d'ADNmt en relació amb l'ADN nuclear es va informar a [31].
4.6 Anàlisi estadísticaLes anàlisis estadístiques es van realitzar mitjançant el programari SPSS 18.0 (IBM Corp., Armonk, NYP USA). Els resultats s'expressen com a mitjana 土 SD. Les mitjanes dels grups es van comparar mitjançant l'anàlisi de la variància seguida de les comparacions múltiples de Tukey. p e 0,05 es va considerar estadísticament significatiu.
5. Conclusions
En conclusió, es van observar modulacions significatives en l'expressió de mediadors relacionats amb la biogènesi mitocondrial en un model de rata CKD. Omega-3 FA pot millorar la biogènesi mitocondrial regulant Nrf1 i Nrf2. Aquest mecanisme protector es pot iniciar mitjançant un augment de l'expressió de PGC-1 i la desacetilació de PGC-1, que es va desencadenar per l'augment de la producció de SIRT1/3 (figura 5). Figura 5. Efecte de l'omega-3 FA sobre la biogènesi mitocondrial en la ERC. Les fletxes negres en negreta indiquen l'expressió de mediadors relacionats amb la biogènesi mitocondrial en un model de rata CKD. Les fletxes vermelles indiquen l'expressió dels mediadors després de l'administració d'omega-3 FA. Les fletxes amunt / avall indiquen un augment i una disminució de l'expressió dels mediadors.
