L'estrès oxidatiu, el metabolisme energètic disfuncional i els neurotransmissors desestabilitzadors van alterar el perfil metabòlic cerebral en un model de rata de busseig de saturació d'heliox simulat fins a 4.0 MPa Ⅱ

Procediment d'extracció de teixit

El procediment d'extracció de metabòlits polars de mostres de teixit va ser una modificació menor tal com es va informar [18]. Les mostres de teixit congelat prèviament pesades es van descongelar en gel i després es van sotmetre a homogeneïtzació mecànica en un sistema de dissolvent de metanol-cloroform-aigua de grau HPLC fred (400 μL, 400). μL i 285 μL, respectivament, per 100 mg de teixit cerebral) mitjançant un homogeneïtzador de teixits (Precellys 24, Bertin Technologies, Villeurbanne, França). Els homogeneïtats resultants es van mantenir en gel durant un període de 30 min i després es van centrifugar a 12,000 xg durant un període de 10 min a 4˚C. A continuació, es va eliminar el sobrenedant de cada mostra i es va liofilitzar per obtenir una pols que contenia metabòlits polars en un liofilitzador (FD-1A{-80, BIOCOOL, Xina). Cada mostra de pols es va reconstituir posteriorment amb 550 μL de tampó PBS amb un 0, 1 per cent de TSP, i totes les mostres es van barrejar a fons i es van centrifugar a 12, 000 xg durant un període de 20 min a 4 °C. A continuació, es va transferir una alíquota de 500 μL de sobrenedant a un tub de RMN de 5, 0 mm de diàmetre (Norrel, Regne Unit). El principi d'extracció de proteïnes a la mostra de còrtex va ser com es va descriure anteriorment sense modificacions. La quantitat exacta de mostres de còrtex es va abocar en un tampó d'homogeneïtzació (HEPES 25 mmol/L, pH 7,4, MgC12 5 mmo1/L, DTT 2 mmol/L, EDTA 1,3 mmol/L, EGTA 1 mmol/L, 0,1 per cent de Tritó X-100, aprotinina, pepstatina A i leupeptina 10 ug/ml cadascuna) i homogeneïtzada manualment en un bany de gel. La mescla es va centrifugar a 1,000 xg durant un període de 10 min a 4˚C, i el sobrenedant es va utilitzar per a les concentracions de proteïnes quantificades mitjançant la prova de Bradford.

Feu clic aquí per conèixer la funció anti-oxidació de Cistanche

Assaig bioquímic

Es va aplicar un assaig immunosorbent lligat a enzims (ELISA) sensible i competitiu amb kits d'assaig per a la quantificació dels enzims metabòlics Na-KATPase i AChE i els neurotransmissors DA, E, NE, 5HT i GABA. ELISA també va determinar els nivells de SOD, MDA i GPx al teixit cortical amb kits d'assaig segons les instruccions del fabricant.

Mesura de RMN

La quantificació eficient dels metabòlits dels teixits es va aconseguir mitjançant una plataforma analítica basada en un espectròmetre RMN Bruker Avance-III líquid d'alta resolució equipat amb una sonda criogènica d'alta sensibilitat que funciona a una freqüència de 600. 17 MHz per a una observació d'1 H a 298 K. Es va aplicar una seqüència de polsos unidimensional 1 H ZGPR (TOPSPIN versió 3.0, Bruker Biospin) (RD-90˚-ACQ) suprimida per aigua. Adquirir dades de RMN per a cada mostra. Es van registrar quatre exploracions simulades i 128 transitoris en un domini temporal de 32 K punts de dades utilitzant una amplada espectral de 20 ppm amb un retard de relaxació de 10, 0 s i un temps d'adquisició de 2, 73 s. Es va aplicar una funció d'ampliació de línia exponencial de 0, 3 Hz i d'ompliment zero fins a 64 K punts de dades a totes les desintegracions d'inducció lliure (FID) abans de la transformació de Fourier. Es van utilitzar tècniques de RMN bidimensionals addicionals amb espectroscòpia de correlació de gradient de camp polsat (gCOSY) i espectroscòpia de correlació total homonuclear 2D (TOCSY) mitjançant programes de polsos estàndard en mostres seleccionades per confirmar les assignacions de canvi químic. En l'adquisició de tots els espectres es va utilitzar un canviador de mostres automatitzat per al lliurament continu de mostres.

Identificació i confirmació de metabolits

Els senyals de RMN basats en la ubicació de les ressonàncies individuals als espectres es van identificar al paquet de programari Chenomx NMR Suite v. 8.4 (versió d'avaluació). Les confirmacions d'algunes assignacions de metabòlits es van dur a terme tenint en compte els canvis químics, les constants d'acoblament i els patrons de multiplicitat de metabòlits com a informació sobre acoblaments escalars extrets d'1 H–1 H COSY, 1 H–1 H TOCSY, bases de dades públiques de RMN com COLMAR i Human Metabolome. Base de dades (HMDB) i la literatura [18, 19].

Anàlisi estadística multivariant

El protocol de preprocessament utilitzat per preprocessar cada espectre de RMN 1D 1H era el mateix que el descrit al nostre treball anterior [20]. Els espectres de RMN 1 H es van esglaonar i es van corregir a la línia de base mitjançant MestReNova (Mestrelab Research, SL, Espanya) i la regió espectral de cada metabòlit es va integrar en una galleda. Les ressonàncies del senyal de dissolvent orgànic i la regió del senyal H2O/HOD residual es van eliminar en tots els espectres de RMN 1D 1H. S'ha aplicat un procediment de cub de 0.{{30}}03 Hz i una normalització a la suma de la intensitat espectral multiplicada per 10.000 en tots els espectres. Només es van seleccionar els valors de galleda més grans en un pic per a l'anàlisi del següent pas per evitar una mala interpretació dels metabòlits discriminants a causa de senyals superposats. Posteriorment, es van extreure cubs integrals de 47 metabòlits i es van sotmetre a anàlisi de dades univariant i multivariant. L'anàlisi d'indiscriminació mitjançant anàlisi de components principals (PCA) i l'anàlisi de discriminació mitjançant anàlisi discriminant de mínims quadrats parcials (PLS-DA) i projeccions ortogonals a l'anàlisi discriminant d'estructures latents (OPLS-DA) es va realitzar mitjançant el paquet de programari SIMCA-P plus 14.0 (Umetrics). , Umeå, Suècia) s'han escalat a les dades de variància unitat. Els gràfics de puntuació PCA i PLS-DA es van il·lustrar amb el primer i el segon components principals (t[1], t[2]), mentre que el gràfic de puntuació OPLS-DA va utilitzar t[1] i el component ortogonal (a[1] ]). Els paràmetres Q2 (cum), R2Y (cum) i R2X (cum) es van calcular per provar la robustesa dels models de discriminació contra el sobreajustament [21]. Com s'ha descrit anteriorment, un valor d'avaluació de la qualitat de Q2 � 0,4 es considera un model fiable. L'estratègia de validació creuada de set vegades i la prova de permutació 200 vegades amb el primer component es van aplicar per protegir-se del sobreajustament del model i validar encara més la fiabilitat i la fiabilitat dels models. Si la línia de regressió Q2 tenia una intercepció negativa i els valors Q2 ajustats al punt més esquerre eren més grans que tots els valors Q2 dels punts de la dreta a la prova permutada, el model OPLS-DA establert era robust [22]. L'estratègia de validació creuada 10-predeterminada es va aplicar per protegir-se del sobreajustament del model. En general, una estadística d'avaluació de la qualitat (Q2) � 0,4 es considera un model fiable, tal com s'ha descrit anteriorment. Els coeficients de correlació (r) i els valors VIP extrets dels models OPLS-DA es van utilitzar per identificar metabòlits que van contribuir significativament a la separació entre els dos grups. A més, es van calcular els canvis de plec de metabòlits entre grups mitjançant una funció. IA/IB, on IA i IB representen els valors mitjans de la integral del metabòlit als grups A i B, respectivament. El mapa de calor i els gràfics de caixa es van dibuixar per facilitar la comprensió de les variacions de metabòlits entre grups.

Estadística univariada d'integrals de metabòlits

La mitjana dels metabòlits de cada grup s'expressa com a mitjana ± desviació estàndard (SD). També es va realitzar una anàlisi univariant mitjançant ANOVA (anàlisi de variància). Les diferències estadísticament significatives entre grups es van avaluar mitjançant una prova t no aparellada de dues cues després de la conversió de registre al programari GraphPad Prism V 8.4.3 (Graph Pad Software Inc., San Diego, CA, EUA). Les diferències estadísticament significatives es van definir mitjançant valors de p (< 0.05). According to the three criteria, including an absolute value of r greater than 0.50, a value of VIP greater than 1.0, and a p-value less than 0.05, the bucket variables with one of three features will be selected as discriminatory variables. Because more than one bucket value was listed from the same metabolite, two or more discriminative variables arising from the same metabolite will be present in the discriminatory panel. Selection will be carried out based on VIP rankings, and only the variables from the same metabolites with the highest VIP values were therefore selected as discriminatory metabolite level features, which will be included in the next-step analysis.

Anàlisi de correlació metabòlica estadística del sistema i anàlisi de clúster jeràrquic

El càlcul del coeficient de correlació de Pearson i l'anàlisi de clúster jeràrquic es van dur a terme a partir de les integrals relatives dels metabòlits a R Studio (versió 1.4.1717) amb scripts petits. Per a cada parell de grups, la matriu de correlació es va il·lustrar en un mapa de píxels tal com es descriu a la literatura [21]. Breument, per a cada variable d'un grup, les correlacions amb valors de p inferiors a 0.05 es van considerar correlacions estadístiques significatives i es van mantenir per construir la xarxa de correlació final per il·lustrar les relacions latents dels metabòlits dins del grup. grup i les relacions metabòliques alterades entre grups. Els quadrats més vermells indiquen una correlació positiva més significativa. Els quadrats més blaus indiquen una correlació positiva més significativa. Els quadrats blancs indiquen la correlació sense importància. L'anàlisi de les vies i xarxes metabòliques cerebrals més rellevants invocades com a enquestats a HSD es va realitzar mitjançant l'eina MetaboAnalyst 3.0. Per a l'anàlisi de la topologia de la via realitzada, es va seleccionar la biblioteca de vies de mamífers Rattus norvegicus (rata). Aquest enfocament també es va utilitzar per proporcionar estimacions de l'impacte de la via, la taxa de descobriment fals (FDR) i els valors p.

Resultats Índexs bioquímics corticals dels grups HSD i CON

Per validar els efectes d'alteració metabòlica de l'HSD en els teixits cerebrals, els paràmetres bioquímics, incloses les activitats enzimàtiques metabòliques relacionades amb el metabolisme energètic de Na-KATP, AChE i LDH, els neurotransmissors de DA, E, NE, 5HT i GABA, i elproteïnes relacionades amb l'estrès oxidatiudeSOD, MDA, i Gpx als teixits de l'escorça ipsilateral de rates HSD i CON (taula 1). En comparació amb el grup control, els nivells de DA, E, NE i MDA es van augmentar significativament, mentre que els continguts de Na-KATP, AChE, LDH, 5HT, GABA, SOD i Gpx es van reduir en el model HSD. El límit de detecció dels kits d'assaig utilitzats en el present treball es va enumerar a la taula S3 de la fitxa de materials suplementaris.

Taula 1. La quantificació dels paràmetres bioquímics es va mesurar en teixits de còrtex CON i animals HSD mitjançant ELISA amb els kits d'assaig. (mitjana ± SD). indica significació estadística.

Metabòlits identificats en espectres de RMN 1H de mostres de teixit cerebral

La figura 3 mostra tres espectres de RMN 1H representatius de l'escorça (Fig 3A), l'hipocamp (Fig 3B) i l'estriat (Fig 3C) d'una rata HSD. Es van identificar una àmplia gamma de metabòlits destacats segons les dades de RMN 1H de mostres de teixit cerebral, i són anions d'àcid orgànic (lactat (Lac), malonat (Maln), succinat (Suc), malat (Mal), fumarat (FMA). ), 2-hidroxibutirat (2-HB), acetat (Ace), formiat (For), taurina (Tau), ascorbat (Asc), 2-hidroxibutirat (2HIB)), aminoàcids (leucina (Leu), isoleucina (Ile), valina (Val), alanina (Ala), glicina (Gly), tirosina (Tyr), fenilalanina (Phe), aspartat (Asp), glutamina (Gln), glutamat (Glu) , treonina (Thr), serina (Ser), lisina (Lys), asparagina (Asn)), neurotransmissors (-aminobutirat (GABA)), metabòlits relacionats amb l'energia (creatina (Cre), trifosfat d'adenosina (ATP), monofosfat d'adenosina ( AMP)), metabòlits relacionats amb fosfolípids (Ofosfoetanolamina (PEA), O-fosfocolina (Pcho), sn-glicero-3-fosfocolina (GPC)) i altres (mio-inositol (MI), nicotinamida adenina dinucleòtid (NAD plus) ), àcid nicotíric (Nic), N-acetilaspartat (NAA), nicotinamida-adenina-dinucleòtid fosfat (NADP plus ), UDP-N-galactosa (UDPGa), uridina (Uri), uracil (Ura), cistidina (Cyt) , uridina 5'-monofosfat (UMP), inosina 5'-monofosfat (IMP), inosina (Ino), colina (Cho), car nitina (Car), glutatió (GSH). La taula S1 mostra informació detallada sobre les assignacions de metabòlits.

Alteracions del perfil metabòlic revelades per anàlisi metabolòmica

El PCA, un enfocament d'anàlisi exploratori i imparcial dels espectres de RMN 1H de tots els extractes cerebrals de diferents regions del cervell, es va fer per primera vegada per revelar les principals tendències metabòliques impulsades per l'exposició hiperbàrica a un 400 msw. entorn de saturació d'heliox. Un diagrama de dispersió PC1 vs. PC2 obtingut a partir de la PCA (Fig S1A–S1C) de dades integrals del cub va revelar una certa discriminació amb una certa superposició entre les dues classificacions. Les investigacions supervisades dels models PLS-DA (S1A'–S1C' Fig) i OPLS-DA (Figs 4A–4C) van mostrar clares discriminacions de classe dels perfils metabòlics entre grups. La figura 4 mostra els diagrames de puntuació del model OPLS-DA per a la regió de l'escorça (A), la regió de l'hipocamp (B) i la regió de l'estriat (C), mostrant una clara discriminació entre els grups HSD i els controls. L'alta variació explicada i la bondat de la predicció reflectida pels valors de R2X i Q2 (S1A'–S1C' Fig, Fig. 4A–4C) i els diagrames de prova de permutació (Fig 4'-4C'A) van indicar el robustesa dels models supervisats generats. Es va recollir el coeficient de correlació (r) extret de les gràfics de la línia S, la importància variable en la projecció (VIP) i el valor p de les proves univariants no paramètriques per avaluar els metabòlits significatius responsables dels patrons de discriminació de classe. Per tant, complint qualsevol dels tres criteris (el valor absolut de r superior a 0,50, el valor de VIP superior a 1,0, juntament amb un valor de p inferior a 0,05), vam seleccionar un panell de metabòlits estadísticament significatius. (Taula 1) responsable de la separació entre els grups CON i HSD. A la taula 1, els valors de canvi de plec superiors a 1 indiquen un nivell augmentat en el grup HSD, mentre que els valors de canvi de plec inferiors a 1 indiquen un nivell disminuït en el grup HSD. Els valors de SD mitjans dels metabòlits discriminatius es mostren a la taula S2. Utilitzant l'anàlisi de clúster jeràrquic de metabòlits i el mètode d'enllaç mitjà, el mapa de calor generat (Fig 5A-5C) amb dendrogrames permet una millor visualització de les alteracions metabòliques de tres regions cerebrals causades per l'exposició hiperbàrica en un entorn saturat d'oxigen d'heli.

Trastorns metabòlics observats en diferents regions cerebrals de rates HSD

L'anàlisi multivariant i l'anàlisi univariant esmentades anteriorment utilitzant l'alçada de la galleda de metabòlits en els diferents grups van proporcionar un gran tub de treball per identificar metabòlits discriminatius que revelaven les possibles alteracions metabòliques neurològiques associades als esdeveniments HSD. Es van trobar AMP, FMA, Nic i Phe elevats i una disminució d'Ala, Asn, Car, Cho, Cyt, GABA, GSH, Ino, Lac, Pcho, Phe, Tyr, Ura i Uri al teixit de l'escorça de l'HSD. grup en comparació amb el grup CON (Fig 5A, taula 1). Mentrestant, a l'hipocamp, Ala, GSH, Lac, Uri, Cyt, GABA, Tyr i Ura també van disminuir i l'AMP va augmentar en el grup HSD, com ho va fer a l'escorça. A més, el Thr regulat i el Gly, ATP, Tau, Imp, Suc, Asc i DMA regulats a la baixa es van expressar en extractes d'hipocamp del grup HSD en relació amb els controls (Fig 5B, 5D, Taula 1). En comparació amb el grup CONS, els continguts de Cyt, GABA, Ura, Cho i Thr també van disminuir com ho van fer a l'escorça i l'hipocamp. A més, l'augment dels nivells d'aminoàcids de cadena ramificada (BCAA, inclosos Leu, Ile, Val) i Lys i la disminució dels nivells de Gln, NAA, NAD plus, NADP plus, Asp, una sèrie de metabòlits d'ATP, Tau, IMP, i Suc, que també va disminuir a l'hipocamp, i altres dos metabòlits, Ino i Pcho, que també van disminuir a l'escorça, es van observar als teixits estriat de rates del grup HSD (Fig 5C, 5D, Taula 1). Tants metabòlits sempre indiquen vies moleculars implicades amb complexitat i diversitat. Es van quantificar els valors integrals de la galleda dels metabòlits discriminants i els canvis de plec estadísticament significatius de les seves concentracions entre els grups exposats a heliox-saturació-hiperbàric i control es resumeixen a la taula S2 i a la taula 2 per a les tres regions del cervell.

Figura 4. Gràfics de puntuació de l'anàlisi discriminant de mínims quadrats parcials ortogonals (OPLS-DA) i gràfics de prova de permutació que discriminen l'efecte de l'exposició a la saturació d'heliox de 400 msw en els espectres de RMN 1H dels grups de control de l'escorça (CONC, n=8, HSDC, n=8, A i A') (R2X=0,38; Q{2=0,46), hipocamp (CONH, n {{12} }, HSDH, n=8, B i B') (R2X=0,37; Q{2=0,43) i estriat (CONS, n=8, HSDS, n=8, C i C') (R2X=0,39; Q2=0,40). Els valors del paràmetre Q2 a les gràfics de puntuació OPLS-DA, que eren iguals o superiors a 0,40, juntament amb els valors Q2 del punt més esquerre dels models permutats eren més grans que tots els valors Q2 ajustats dels punts correctes (permutació). prova 80 vegades), indicant que els models OPLS-DA establerts eren vàlids.

Pcho, que també va disminuir a l'escorça, es va observar als teixits estriat de rates del grup HSD (Fig 5C, 5D, taula 1). Tants metabòlits sempre indiquen vies moleculars implicades amb complexitat i diversitat. Es van quantificar els valors integrals de la galleda dels metabòlits discriminants i els canvis de plec estadísticament significatius de les seves concentracions entre els grups exposats a heliox-saturació-hiperbàric i control es resumeixen a la taula S2 i a la taula 2 per a les tres regions del cervell.

Fig 5. Mapa de calor i gràfics de correlació estadística derivats dels valors de cub dels metabòlits discriminatoris de l'escorça (les mostres A, A', HSDC es troben al panell superior i CONC al panell inferior), hipocamp (B, B', HSDH). grup es troba al panell superior i CONH es troba al panell inferior) i teixits estriat (les mostres C, C', HSDS es troben al panell superior i CONS es troba al panell inferior) teixits de rates HSD i CON. Els metabòlits del mapa de calor s'organitzen mitjançant agrupacions jeràrquiques basades en la similitud general dels patrons de nivell. Diagrama de Venn (D) que il·lustra la superposició de metabòlits entre les comparacions HSDC-CONC, HSDH-CONH i HSDS-CONS.

Anàlisi de correlació de metabòlits

La relació entre o entre metabòlits era tan complexa a la figura 5A'-5C'. Per als metabòlits energètics, les correlacions positives per a Lac vs Ala a HSDC, AMP vs IMP a HSDH, ATP vs Pcho a HSDS, Suc vs GABA / Gln / Tyr / NAA a HSDS i les correlacions negatives per a Lac vs Thr i GSH vs. Suc a HSDH, Suc vs Val a HSDS estaven presents a les parcel·les de correlació de metabòlits. Per als neurotransmissors, les correlacions positives per a GABA vs Car a HSDC, GABA vs Cho a CONH i GABA vs Suc/Ino/Gln a HSDS estaven presents a les parcel·les de correlació de metabòlits. Les correlacions negatives de GABA vs FMA al CONC i GABA vs NAA/Ura/NADP plus al CONS estaven presents a les parcel·les de correlació de metabòlits. Per als metabòlits relacionats ambestrès oxidatiu, elcorrelacions positivesper a GSH vs Asn a l'HSDC i el CONC, Tau vs Lac a l'HSDH, Tau vs Suc/Ala a la CONH, les correlacions negatives per a GSH vs Suc a la HSDH, Tau vs Thr a la HSDH estaven presents a la correlació de metabòlits parcel·les.

Anàlisi de la via metabolòmica

L'anàlisi quantitativa de la via que consisteix en l'anàlisi de l'enriquiment de la via i l'impacte de la via de la topologia de la via va revelar modulacions induïdes per HSD altament significatives estadísticament a una sèrie de vies metabòliques. Les puntuacions d'impacte de les vies, juntament amb la taxa de descoberta falsa (FDR) i els valors de p, es descriuen a la figura 6. Les vies es van considerar significativament enriquides si els valors de p eren inferiors a 0.05; els metabòlits perfilats (èxits) en relació amb els metabòlits totals de la via (estat de coincidència) eren superiors a 1; i les puntuacions d'impacte (que indiquen l'impacte dels metabòlits afectats significativament a la via basant-se en la mesura de la topologia de xarxa de la centralitat relativa de l'intermediació) van ser superiors a 0. Les vies a l'escorça (Fig 6A) amb el major valor d'impacte metabòlic van serfenilalanina, tirosina, ibiosíntesi de triptòfan>metabolisme de la fenilalanina> Metabolisme de la pirimidina > Metabolisme de l'alanina, l'aspartat i el glutamat. Les vies de l'hipocamp (figura 6B) amb major impacte metabòlic van ser la biosíntesi de fenilalanina, tirosina i triptòfan > metabolisme del glutatió > metabolisme de la glicina, serina i treonina > metabolisme de la purina > metabolisme de la pirimidina > metabolisme de l'alanina, aspartat i glutamat > metabolisme del butanoat . Les vies de l'estriat (Fig 6C) amb un impacte metabòlic més gran van ser el metabolisme de l'alanina, l'aspartat i el glutamat > el metabolisme del nicotinat i la nicotinamida > el metabolisme de les purines.

Demana més:

Correu electrònic:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: més 86 15292862950