Paràsits, infeccions i inoculació en cèl·lules mínimes sintètiques

RESUM: Les cèl·lules mínimes sintètiques proporcionen un model controlable i dissenyable per als processos biològics. Tot i que és molt més senzill que qualsevol cèl·lula natural viva, les cèl·lules sintètiques ofereixen un xassís per investigar els fonaments químics dels processos biològics clau. Aquí, mostrem un sistema cel·lular sintètic amb cèl·lules hostes, que interactuen amb paràsits i pateixen infeccions de diversa gravetat. Demostrem com es pot dissenyar l'hoste per resistir la infecció, investiguem el cost metabòlic de portar la resistència i mostrem una inoculació que immunitza l'hoste contra patògens. El nostre treball amplia la caixa d'eines d'enginyeria cel·lular sintètica demostrant interaccions hoste-patògen i mecanismes per adquirir immunitat. Això fa que els sistemes de cèl·lules sintètiques un pas més a prop de proporcionar un model complet de vida complexa i natural.

Beneficis de cistanche per a homes que enforteixen el sistema immunitari

INTRODUCCIÓ

En les últimes dècades, el camp de la biologia sintètica ha esclatat, permetent la construcció de cèl·lules sintètiques que s'assemblen i modelin aspectes de la vida biològica natural. El modelatge de vies i comportaments cel·lulars en cèl·lules sintètiques ofereix molts avantatges sobre les cèl·lules vives, com ara un entorn de reacció més simplificat i definit, un control complet sobre la composició proteòmica i química de la cèl·lula, la capacitat de compartimentar les vies i processos biològics interferents, així com el manteniment. sistemes biològics importants que estan absents en els sistemes de reacció in vitro.1,2 Aquests actius únics de les tecnologies de cèl·lules sintètiques ja han permès la simulació de condicions i vies biològiques dins d'un bioreactor in vitro (cèl·lula sintètica) semblant a la vida i han aportat una millor comprensió de moltes àrees d'estudi, inclosa l'amuntegament molecular3, la dinàmica de proteïnes de lípids,4 el metabolisme mínim,5 i molts altres aspectes crítics de la vida biològica.2 Aquestes cèl·lules sintètiques semblants a la vida amb els seus actius únics s'estan convertint ràpidament en millors models i aportant més llum el misteriós funcionament intern de la vida cel·lular.6,7 Aquests avenços no es limiten als processos unicel·lulars; Les interaccions d'enginyeria entre poblacions de liposomes també han demostrat una tecnologia potent. Per exemple, el disseny d'un sistema cel·lular sintètic que imite una relació depredador-presa s'ha desenvolupat utilitzant la llum com a senyal entre aquestes poblacions de cèl·lules sintètiques. permetent que la fluorescència s'estengui d'una manera espacial entre la població.9 A més de les interaccions cèl·lula sintètica-cèl·lula sintètica, també hi ha hagut avenços recents en les interfícies cèl·lules vives sintètiques. Per exemple, s'ha demostrat que una cèl·lula sintètica dissenyada per connectar amb una cèl·lula mare neural és capaç d'induir la diferenciació neuronal i d'actuar com un xassís generalitzat capaç d'interconectar-se amb altres tipus de cèl·lules.10 Hi ha hagut innombrables avenços en el desenvolupament. de la propagació del senyal i les cèl·lules sintètiques que actuen com a interfícies, gran part de les quals s'explora en les revisions següents.11−13 En resum, hi ha camps sencers d'investigació preocupats per imitar les interaccions de les poblacions cel·lulars en el sistema model de cèl·lules sintètiques. Malgrat això, no hi ha hagut cap estudi que utilitzi cèl·lules sintètiques per modelar la infecció, el parasitisme o la inoculació. De la mateixa manera que les cèl·lules sintètiques s'utilitzen habitualment per modelar processos biològics complexos d'una manera simplificada i controlada, existeix el potencial de poder modelar aquestes interaccions interorganismes complexes. La importància d'això es pot veure en l'estudi innovador que va produir amb èxit partícules de fags actius dins d'una plataforma d'expressió de proteïnes lliures de cèl·lules.14 El nostre objectiu és portar aquest concepte al nivell macro mitjançant el disseny de poblacions de cèl·lules sintètiques que puguin infectar-se activament entre elles i segrestar. el genoma d'una cèl·lula hoste, tal com ho fan els virus i els paràsits vius. Ser capaç d'aplicar i dissenyar cèl·lules sintètiques per modelar aquests comportaments de malaltia proporcionarà una eina valuosa per a la comunitat científica.

En aquest treball, mostrem el nostre sistema per al modelatge de malalties cel·lulars sintètiques. Vam dissenyar una cèl·lula hoste que podria patir una infecció de la segona població de cèl·lules sintètiques paràsites i vam investigar la competència de recursos, el segrest del genoma i la reutilització metabòlica que es produeix durant aquesta infecció. També modelem un mètode que permet el rescat de l'hoste després de la infecció, així com un mitjà d'inoculació que permetrà a l'hoste resistir la infecció de les cèl·lules sintètiques que causen la malaltia. En resum, presentem un nou xassís de model de malaltia i infecció per a cèl·lules sintètiques. Amb aquesta tecnologia, les cèl·lules sintètiques poden començar a utilitzar-se com a models rudimentaris per a malalties, infeccions i inoculació (figura 1).

Figura 1. Paràsit, infecció i sistema d'inoculació en cèl·lules mínimes sintètiques. ( a ) L'"hoste" és una cèl·lula sintètica que expressa proteïna fluorescent verda (GFP). A la superfície de la membrana externa, l'hoste porta etiquetes d'ADNss. Les úniques proteïnes traduïdes en un hoste sa són les pròpies proteïnes de l'hoste dels plasmidis amb què es va crear l'hoste. (b) El "paràsit" és un liposoma ple d'ADN plasmidi que codifica un gen per a la proteïna fluorescent mCherry, i la superfície del liposoma del paràsit està decorada amb l'etiqueta ssDNA (complementària a l'etiqueta de la superfície de l'hoste). La "infecció" comença amb una fusió dels liposomes hoste i paràsit, mediada per les etiquetes d'ADN complementàries a la seva superfície. Després de la infecció, l'hoste expressa tant el gen original de l'hoste (GFP) com el gen del paràsit (mCherry). (c) La "infecció" comença amb liposomes "patògens" que porten un gen per a l'enzim de restricció MunI que es fusiona amb els liposomes hoste. El gen patogen MunI és expressat per l'hoste i l'enzim de restricció MunI digereix l'ADN de l'hoste. Això fa que el genoma de l'hoste natiu sigui digerit, convertint la major part de l'expressió de la proteïna hoste de GFP a la proteïna codificada pel patogen, MunI. (d) La "infecció letal" és una fusió del liposoma hoste (amb el genoma GFP) amb el liposoma patogen que conté el gen que codifica aHL, una proteïna de membrana. Després de la infecció, l'hoste expressa aHL, que crea porus de membrana, provocant fuites de nutrients de l'hoste i tancant eficaçment el metabolisme de l'hoste. (e) La "immunització" és la incubació de l'hoste amb ssDNA que conté una seqüència compatible amb les etiquetes de fusió a la superfície dels liposomes hoste. L'ADN immunitzant crea un dúplex amb etiquetes d'ADN hoste, evitant la hibridació d'altres oligos d'ADN amb aquestes etiquetes. Això evita la fusió de qualsevol liposomes patògens amb l'hoste. Aquesta és una figura de prova de concepte i els gràfics tenen finalitats il·lustratives, representant quantitats relatives de proteïnes expressades per l'hoste i diversos patògens. Les dades reals de cada sistema es proporcionen en xifres posteriors.

RESULTATS I DISCUSSIÓ

En aquest treball, utilitzem les paraules: hoste, paràsit, infecció, mortal, vacuna i inoculació, tot en el context de sistemes cel·lulars sintètics no vius. Per infecció "mortal" entenem una disminució marcada de la traducció en la població de cèl·lules sintètiques. Tots els experiments d'aquest treball es van realitzar amb cèl·lules sintètiques que no estan vives, no s'autoreplican i no evolucionen. Aquest és un sistema model de propietats i processos biològics naturals.

Beneficis del suplement de cistanche: augmenta la immunitat

Feu clic aquí per veure els productes Cistanche Enhance Immunity

【Demanar més】 Correu electrònic:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

La infecció d'una cèl·lula sintètica amb una cèl·lula sintètica paràsita segresta els recursos de l'amfitrió.

Per provar el concepte d'un sistema cel·lular sintètic que imita una infecció, vam començar construint un sistema model per a un paràsit. Hem utilitzat el concepte més senzill de paràsit possible per reconstituir en aquest sistema bioquímic no viu: un paràsit que segresta alguns dels recursos de l'hoste. En aquest cas, el metabolisme de l'hoste està representat per l'expressió de la proteïna GFP i el paràsit està representat per l'expressió de la proteïna mCherry. Per a aquest sistema, hem utilitzat el fenomen demostrat anteriorment del rendiment d'expressió de proteïnes lineals depenent de la concentració de plantilla d'ADN a TxTl. la proporció de fluorescència observada d'aquestes proteïnes. Vam assignar arbitràriament el gen GFP com a "amfitrió" i el gen mCherry com a "paràsit". Aquests noms no signifiquen res especial en aquest experiment en particular, però indicaran l'hoste i el paràsit en experiments posteriors amb cèl·lules sintètiques. Aquí, fem servir aquests noms per facilitar la relació d'aquests experiments de prova de concepte amb experiments posteriors d'infecció de cèl·lules sintètiques amb els mateixos plasmidis. Hem barrejat plasmidis GFP i mCherry, amb tots dos gens sota el control del promotor T7 a diferents proporcions de plasmidi i una concentració total de plasmidi a les mostres 1, 5, 10 o 15 nM (figura 2b). Els resultats van seguir la relació gairebé lineal esperada entre la concentració de plasmidi i la intensitat de fluorescència registrada, amb la millor coincidència entre les proporcions de concentració de fluorescència i plasmidi observada en un total de plasmidi de 10 nM. La relació observada indica que els plasmidis, amb les proteïnes de mida i composició d'aminoàcids similars (figura S1), competeixen pel mateix conjunt de recursos TxTl per a la seva expressió. El canvi de la concentració relativa dels dos plasmidis provoca canvis en l'eficiència d'expressió aproximadament proporcionals a la proporció dels plasmidis. Això indica que seria un bon model per imitar la infecció per paràsits: el genoma del paràsit (plasmidi mCherry) competirà amb el genoma hoste (plasmidi GFP). A continuació, vam decidir provar un cas en què qualsevol dels plasmidis estava sota el control d'un promotor més fort, imitant així un escenari d'assignació de recursos esbiaixat. Per mantenir l'aspecte de la competència de recursos dels futurs experiments d'infecció "paràsits", vam mantenir els dos gens sota el mateix promotor de l'ARN polimerasa (l'ARN polimerasa T7, T7 RNAP), però vam variar la seva força. Hem utilitzat un fort promotor T7 RNAP T7Max, que demostra un rendiment de transcripció significativament més elevat, donant lloc a rendiments de traducció corresponents més alts, a TxTl. concentracions de plasmidi. Un dels plasmidis estava sota el control del fort promotor T7Max, mentre que l'altre estava sota el promotor canònic T7. En ambdós casos de prova, l'expressió del plasmidi T7Max era prou forta perquè la fluorescència de la proteïna d'un gen sota T7Max no augmentava significativament amb l'augment de la concentració total del plasmidi (figura 2c, 2d). No semblava importar si T7Max impulsava GFP o mCherry, ambdues proteïnes van respondre al promotor més fort amb un augment relatiu similar. Això va proporcionar un model prometedor d'infecció amb un paràsit "més fort" (un paràsit que porta el gen sota T7Max a un hoste sota T7) i un hoste invers, més fort que resisteix un paràsit més feble (un hoste amb genoma sota T7Max i un paràsit que porta el gen T7). Encoratjats per aquests experiments de prova de principis, vam passar a experiments amb cèl·lules sintètiques.

La "infecció", en tots els casos, és la fusió d'una cèl·lula sintètica hoste i paràsit. La fusió es facilita mitjançant etiquetes d'ADN a la superfície dels liposomes, utilitzant el sistema de fusió induïble per ADN descrit abans.18 Breument, les cèl·lules sintètiques es van crear amb Escherichia coli TxTl dins d'una membrana de POPC i colesterol, i es va decorar el fullet exterior. amb ADN monocatenari ancorat a la membrana per modificació del colesterol. Si un parell de liposomes amb etiquetes complementàries es troben, les etiquetes d'ADN s'hibriditzen, reunint les membranes i iniciant la fusió de la membrana, que és seguida de la barreja del lumen. En els nostres experiments, la cèl·lula sintètica hoste és el liposoma que conté TxTl amb T7 RNAP a més del genoma d'una GFP codificada per plasmidi. El seguiment de la fluorescència de GFP serveix com a indicador de la "salut" del metabolisme hoste. El paràsit entrant conté un genoma en forma de plasmidi que codifica mCherry, el sistema de traducció complet, però cap ARN polimerasa T7. Això assegura que qualsevol canvi observat en el metabolisme de l'hoste resulti dels gens introduïts pel paràsit i no de la fusió del paràsit i els liposomes de l'hoste, diluint el citoplasma de l'hoste. Els experiments d'infecció per paràsits es van dur a terme amb la membrana hoste etiquetada amb Marina Blue DHPE, un colorant lipídic de membrana blava. Això ens va permetre normalitzar la fluorescència del gen de l'hoste i del paràsit observat a la fluorescència blava, normalitzant els resultats a la quantitat total de fluorescència de la membrana hoste present a la mostra. Això explica les dilucions del volum total de la mostra després de l'addició de liposomes paràsits. Les membranes del paràsit no estaven marcades fluorescentment. Tots els experiments van ser acompanyats d'una mostra de control, on només hi havia una població present l'hoste, però amb plasmidi mCherry, per mostrar els nivells d'expressió màxims teòrics possibles de mCherry si fos l'únic gen de la població. En el primer conjunt d'experiments, vam barrejar l'hoste i el paràsit amb gens ambdós sota el control del promotor T7 normal.de manera que tant els gens hoste com el paràsit eren igualment "forts". Hem barrejat l'hoste amb el paràsit de manera que el paràsit estigués al 25, 50 o 75% de la població total de liposomes. En tots els casos, la fluorescència GFP hoste va disminuir en presència del paràsit, amb el corresponent augment de la fluorescència mCherry del paràsit (figura 2e). Les mostres amb només el paràsit i sense hoste no van produir fluorescència de cap color, com s'esperava. En tots els casos, la fusió de liposoma mediada per ADN no és eficient al 100%;18,19 Per tant, la disminució relativa de la fluorescència de l'hoste i l'augment de la fluorescència del paràsit no van ser tan grans com el valor teòric esperat basat en la proporció d'hoste a paràsit. En altres paraules, la infecció no va ser 100% eficient. Aquesta qualitat fortuïta del sistema de fusió induït per l'ADN va ser, en aquest cas, una característica beneficiosa del sistema. Com en el cas de la infecció natural, la infecció mediada per la fusió de cèl·lules sintètiques no va afectar tots els hostes i no tots els paràsits van trobar un hoste. A continuació, vam investigar dos casos en què l'amfitrió i el paràsit no estaven igualats en la força dels seus genomes. En un cas, el genoma hoste estava sota el control del promotor T7 mentre que el genoma del paràsit estava sota el promotor T7Max (figura 2f), i en l'escenari contrari, el genoma hoste estava sota T7Max i el genoma del paràsit estava sota el promotor T7. (Figura 2g). En el cas de l'hoste més feble atacat per un paràsit més fort, l'augment relatiu de la fluorescència de mCherry paràsit i la corresponent disminució de la fluorescència de GFP de l'hoste van ser molt més forts que en el cas anterior d'un hoste i paràsit igualment igualats. Com era d'esperar, quan l'amfitrió era més fort que el paràsit, era cert el contrari: els nivells de fluorescència de mCherry eren més baixos i la disminució relativa de la fluorescència de GFP era menor que en el cas igualat. Això s'il·lustra millor comparant un únic punt de dades en les mateixes condicions d'infecció: amb una proporció de paràsits del 75%. Les poblacions d'hoste i paràsit igualment igualades donen lloc a una fluorescència del paràsit lleugerament més gran que l'hoste. Quan el paràsit és més fort, la fluorescència del paràsit és significativament més alta que l'hoste. I quan l'hoste és més fort, la fluorescència del paràsit és lleugerament inferior a la de l'hoste. Aquests punts de dades destacats estan marcats amb una estrella groga a la figura 2e−g. Vam realitzar l'experiment de control d'un hoste infectat amb un paràsit "asimptomàtic" un paràsit que portava un plasmidi amb el promotor T7 però sense seqüència de codificació de proteïnes (hem eliminat el casset mCherry del plasmidi) (Figura 2h). La fluorescència de GFP hoste disminueix mínimament a nivells de paràsits més alts, cosa que indica que una petita quantitat de recursos de l'amfitrió es dediquen a la transcripció de l'ARN no codificant curt del plasmidi del paràsit. Aquestes dades també confirmen que la principal càrrega metabòlica de la infecció per paràsits a l'hoste rau en la utilització de recursos translacionals, no transcripcionals. Aquesta observació s'ajusta a les observacions anteriors de la traducció com el recurs més variable i limitant en sistemes lliures de cèl·lules.20 En general, aquests experiments proporcionen un model d'infecció amb un paràsit que segresta els recursos metabòlics de l'hoste, amb comportaments de cèl·lules sintètiques que imiten. aspectes de la relació natural hoste-paràsit.

Figura 2. La infecció per paràsits segresta els recursos de l'hoste. ( a ) El liposoma de la cèl·lula sintètica hoste conté un sistema de traducció lliure de cèl·lules i un plasmidi que codifica GFP. La superfície de l'amfitrió està decorada amb etiquetes ssDNA. El liposoma del paràsit conté un plasmidi que codifica mCherry, amb un sistema de traducció però sense ARN polimerasa (per tant, el paràsit no pot expressar mCherry). La superfície del paràsit està decorada amb etiquetes ssDNA complementàries a les etiquetes de la superfície de l'hoste. Les etiquetes d'ADN faciliten la fusió dels liposomes hoste i paràsit i l'hoste expressa tant la seva pròpia GFP genòmica com el genoma paràsit que conté mCherry. ( b - d ) Prova de principi per als genomes de l'hoste (GFP) i del paràsit (mCherry) que competeixen pels mateixos recursos cel·lulars sintètics. Aquests experiments es fan en solució TxTl, no en liposomes. Es van barrejar dos plasmidis, que codificaven GFP i mCherry, a la proporció indicada per les icones de plasmidi a l'esquerra del mapa de calor, amb la concentració total d'ADN de la mostra indicada a la fila de sobre del mapa de calor. La fluorescència es va mesurar en canals verd (GFP) i vermell (mCherry). Cada plasmidi es va provar en dues variants amb promotors de diferents forces: amb T7 i amb el promotor T7Max més fort. Les dades individuals per a tots els mapes de calor es proporcionen a les figures S2-S4. A les figures S5-S7 es proporcionen cursos de temps individuals representatius per a l'expressió de proteïnes de l'hoste i el paràsit T7 i per al paràsit T7Max a les figures S8-S10. (e-g) Infecció de l'hoste amb el paràsit. En cada experiment, els liposomes hoste es barregen amb liposomes paràsits. La fusió del paràsit amb l'hoste proporciona ADN mCherry paràsit, que s'expressa juntament amb l'ADN GFP de l'hoste. Es van provar diferents proporcions de l'hoste al paràsit, tal com indiquen les icones que hi ha a sota dels gràfics de barres. El genoma hoste sota el promotor T7 es va infectar amb un paràsit amb el seu genoma sota el panell promotor T7 (e) i amb un paràsit amb el seu genoma sota el panell promotor T7Max (f), l'hoste també es va fer amb un genoma T7Max i es va infectar. amb el paràsit amb un panell del genoma T7 (g). A la figura S11 es proporcionen cursos de temps individuals representatius per a l'expressió de proteïnes. A la figura S12 es proporcionen experiments similars amb concentracions de lípids totals més altes i més baixes. A la figura S13 es proporcionen traces de purificació d'exclusió de mida que mostren l'estabilitat de les vesícules postfusió. (h) Infecció amb paràsits incompatibles: el paràsit porta el promotor T7 però ADN no codificant. Les barres d'error indiquen SEM, n=3. Els valors de fluorescència en panells (e-h) es normalitzen a la fluorescència blava d'un colorant de membrana per normalitzar els resultats a la concentració de cèl·lules hostes. Totes les sèries de mostres etiquetades com "host GFP infectat" són experiments, on l'hoste i el paràsit tenien etiquetes d'ADN complementàries a la superfície, que permeten la fusió dels liposomes, anomenada infecció. L'etiqueta de sèrie "host GFP healthy" mostra mostres, on l'amfitrió i el paràsit es van barrejar amb les proporcions mostrades, però no contenien etiquetes de fusió complementàries, cosa que va fer impossible la infecció. El diamant dels panells (e-h) indica una condició d'infecció particular que il·lustra millor les diferències en les forces d'expressió de l'hoste i del paràsit als panells (e-g) i els beneficis de la immunitat de l'hoste al panell (h). A la figura S14 es proporciona una comparació directa dels valors de l'hoste i el paràsit que representa l'estrella. Les dades per a la infecció amb un paràsit sense cap plasmidi es mostren a la figura S15.

La infecció d'una cèl·lula sintètica pot destruir el genoma de l'hoste.

El paràsit descrit anteriorment expressava un mCherry que codificava el genoma utilitzant recursos de l'amfitrió, però l'amfitrió va mantenir part del seu metabolisme i va continuar expressant GFP malgrat la infecció. A continuació, vam decidir investigar un sistema en què la infecció dóna lloc a una presa completa del metabolisme hoste per part del paràsit mitjançant la destrucció del genoma de l'hoste (figura 3a). Per dissenyar aquest escenari, vam investigar una digestió d'enzims de restricció d'un plasmidi a TxTl. En els experiments de prova de principi, es va expressar un enzim de restricció MunI en TxTl sense liposomes. El plasmidi MunI es va barrejar amb el plasmidi GFP en diferents proporcions. Si el plasmidi GFP no conté llocs de restricció MunI, la disminució relativament petita de la fluorescència GFP observada es pot explicar per la competència descrita anteriorment entre els dos plasmidis pels recursos TxTl. Si el plasmidi GFP té un lloc de restricció MunI, la fluorescència GFP disminueix significativament i la disminució s'escala proporcionalment a una quantitat creixent del plasmidi que codifica MunI (figura 3b). L'expressió MunI es va controlar mitjançant Western Blot i es va escalar proporcionalment amb la concentració de plasmidi (figura 3c).

cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari

Encoratjats per aquests resultats, vam posar en marxa un experiment d'infecció amb cèl·lules sintètiques. L'amfitrió portava el plasmidi GFP i el patogen portava el plasmidi MunI. La concentració de plasmidis GFP i MunI es va establir en 2 mM, molt per sota de la concentració de saturació de plasmidi per a TxTl.21 Teníem la intenció de romandre sota la concentració total de plasmidi a la qual l'expressió de l'hoste i el paràsit seria prou alta com per competir directament per recursos limitats ( com en el cas descrit anteriorment d'un paràsit simple), en comptes de fer-ho amb la intenció de mesurar principalment l'efecte de l'enzim paràsit destruint activament el genoma hoste. Igual que en els experiments de paràsits descrits anteriorment, l'amfitrió contenia TxTl i ARN polimerasa T7 bacteriana, el patogen només portava extracte cel·lular sense ARN polimerasa T7, i tant l'amfitrió com el patogen estaven etiquetats amb etiquetes complementàries de fusió d'ADN. La membrana hoste es va etiquetar amb Marina Blue DHPE per normalitzar els resultats de fluorescència a la concentració de liposomes hoste. L'hoste i el patogen es van barrejar en proporcions variables, amb el patogen el 25, el 50 o el 75% de la població total. La fluorescència de l'hoste "infectat", on l'hoste i el patogen contenien etiquetes de fusió complementàries, va disminuir amb una quantitat creixent de patogen. La fluorescència GFP de l'hoste "sana", on el patogen no contenia etiquetes de fusió complementàries, no va disminuir en presència de cap quantitat de patogen. Les mostres amb només el patogen no van donar lloc a una fluorescència mesurable (figura 3d). L'expressió de la proteïna MunI patògena es va quantificar mitjançant l'anàlisi Western Blot, amb dades mostrades per a la sèrie de mostres de l'hoste infectat (figura 3e). A continuació, vam investigar la infecció en el cas d'un hoste immune al patogen: el plasmidi hoste GFP no tenia un lloc de restricció MunI (figura 3f). La fluorescència de l'hoste després de la infecció va disminuir, però no va ser tan significativa com en el cas anterior d'un hoste amb un lloc MunI al genoma. La proteïna patògena MunI es va expressar a nivells comparables als experiments d'infecció anteriors (figura 3g), de manera que la càrrega metabòlica a l'hoste era similar. La disminució de la fluorescència de l'amfitrió infectat en aquests experiments és causada pel fet que alguns dels recursos de l'amfitrió són segrestats pel patogen que expressa MunI, però com que la concentració total de plasmidi és molt més baixa que en els experiments de patògens simples anteriors, la disminució de la fluorescència de l'hoste és menys significativa. Aquest experiment també confirma que la disminució de la fluorescència de l'amfitrió amb un lloc MunI (figura 3d) va ser causada pels cursos de temps d'expressió de proteïnes proporcionats a la figura S22. ( g ) Es va fer un seguiment de l'expressió de MunI mitjançant l'anàlisi de western blot a través de l'experiment per a les mostres mostrades a la sèrie "GFP infectada" al panell (f). Les barres d'error de tots els panells indiquen SEM, n=3. Els valors de fluorescència dels panells (d, f) es normalitzen a la fluorescència blava del colorant de membrana utilitzat per normalitzar els resultats a la concentració de les cèl·lules hoste. La fluorescència al panell (b) es normalitza al plasmidi MunI 0 mM per a cada sèrie de mostres. Els símbols de diamant dels panells (d, f) destaquen una condició particular que il·lustra millor les diferències en les respostes a la infecció d'un hoste susceptible al panell de patògens (d) i immune al panell de patògens (f). Totes les sèries de mostres etiquetades com "GFP infectades" són experiments, on l'hoste i el patogen tenien etiquetes d'ADN complementàries a la superfície, que permetien la fusió dels liposomes, anomenada infecció. La sèrie etiquetada "GFP saludable" mostra mostres, on l'amfitrió i el patogen es van barrejar amb les proporcions mostrades, però no contenien etiquetes de fusió complementàries, cosa que va fer impossible la infecció.

Figura 3. La infecció destrueix el genoma de l'hoste i segresta els recursos de l'hoste. ( a ) Les cèl·lules hostes contenen un plasmidi que codifica GFP, amb dos llocs de restricció MunI; el patogen conté un plasmidi que codifica l'enzim de restricció MunI. Després de la fusió de l'hoste i el patogen, l'hoste TxTl expressa l'enzim de restricció MunI, que després digereix el genoma de l'hoste. ( b ) Els experiments de prova de principi per a la infecció: el plasmidi GFP es va preparar amb i sense llocs de restricció MunI. El plasmidi GFP es va barrejar amb el plasmidi MunI i es va registrar l'expressió GFP. Aquests experiments es van realitzar en solució TxTl sense liposomes. A les figures S16 i S17 es mostra la prova de principi per a l'experiment d'infecció, amb l'enzim MunI afegit externament en lloc d'expressar-se en TxTl. A la figura S18 es proporcionen cursos de temps d'expressió de proteïnes representatius. ( c ) L'expressió MunI es va controlar mitjançant l'anàlisi de western blot; la intensitat de la banda MunI es va quantificar a les mateixes mostres que els resultats de fluorescència que es mostren al panell (b) per a la sèrie "El lloc MunI absent". A la figura S19 es proporciona un western blot representatiu de l'enzim de restricció MunI. ( d ) Fluorescència GFP de l'amfitrió barrejada amb liposomes patògens a la proporció que es mostra al gràfic de dades. El plasmidi host GFP té dos llocs de restricció MunI. A la figura S20 es proporcionen cursos representatius del temps d'expressió de proteïnes. Les dades dels experiments d'infecció amb etiquetes de fusió incompatibles es proporcionen a la figura S21. ( e ) Es va fer un seguiment de l'expressió de MunI mitjançant l'anàlisi de western blot a través de l'experiment per a les mostres mostrades a la sèrie "GFP infectada" al panell (d). ( f ) Fluorescència GFP de l'hoste barrejada amb liposomes patògens a la proporció que es mostra al gràfic de dades. La GFP host no té llocs de restricció MunI, cosa que li dóna immunitat a la proteïna patògena. A la figura S22 es proporcionen cursos de temps d'expressió de proteïnes representatius. ( g ) Es va fer un seguiment de l'expressió de MunI mitjançant l'anàlisi de western blot a través de l'experiment per a les mostres mostrades a la sèrie "GFP infectada" al panell (f). Les barres d'error de tots els panells indiquen SEM, n=3. Els valors de fluorescència dels panells (d, f) es normalitzen a la fluorescència blava del colorant de membrana utilitzat per normalitzar els resultats a la concentració de les cèl·lules hoste. La fluorescència al panell (b) es normalitza al plasmidi MunI 0 mM per a cada sèrie de mostres. Els símbols de diamant dels panells (d, f) destaquen una condició particular que il·lustra millor les diferències en les respostes a la infecció d'un hoste susceptible al panell de patògens (d) i immune al panell de patògens (f). Totes les sèries de mostres etiquetades com "GFP infectades" són experiments, on l'hoste i el patogen tenien etiquetes d'ADN complementàries a la superfície, que permetien la fusió dels liposomes, anomenada infecció. La sèrie etiquetada "GFP saludable" mostra mostres, on l'amfitrió i el patogen es van barrejar amb les proporcions mostrades, però no contenien etiquetes de fusió complementàries, cosa que va fer impossible la infecció.

La infecció d'una cèl·lula sintètica pot ser "mortal", esgotar els recursos de la cèl·lula hoste, i aquestes infeccions es poden "tractar" per a la funció de rescat.

Els experiments de paràsits i patògens anteriors van demostrar que les cèl·lules sintètiques es poden utilitzar com a model d'infecció, on un patogen segresta els recursos de l'hoste. A continuació, vam decidir investigar un escenari en què la infecció fa que el metabolisme de l'hoste deixi de funcionar després de l'expressió de la proteïna patògena. En aquest cas, el patogen és comparable a la infecció amb un bacteri que expressa una toxina mortal menys l'aspecte de replicació de l'hoste o paràsit, ja que aquestes cèl·lules sintètiques no es repliquen (figura 4a). Per dissenyar aquest sistema, vam triar l'hemolisina (aHL), una toxina natural i una proteïna de membrana àmpliament utilitzada en l'enginyeria cel·lular sintètica per crear porus de membrana inespecífics. toxina, i la proteïna es va apropiar més tard per dissenyar el transport de membrana i perllongar el metabolisme cel·lular sintètic.24 Aquí, tornem a utilitzar l'aHL pel seu paper natural com a toxina nociva produïda per una infecció. Un altre exemple notable relacionat amb l'enginyeria de cèl·lules sintètiques de l'ús de la toxicitat d'aHL per causar la mort natural de les cèl·lules prové de l'aplicació de cèl·lules sintètiques com a tecnologia de teràpia contra el càncer.25 Com a prova de principi, vam establir que expressar una alta concentració d'aHL en vesícules cel·lulars sintètiques. provoca una fuga de contingut cel·lular i una disminució significativa de l'expressió de GFP dins de la cèl·lula. Aquest efecte es pot revertir si l'exterior dels liposomes conté totes les petites molècules necessàries per a TxTl (figura 4b). Al nostre sistema de model host-patogen, l'amfitrió conté un plasmidi que codifica GFP i el patogen conté un plasmidi que codifica aHL. El disseny de tots els experiments d'infecció és similar als escenaris de paràsits i patogens descrits anteriorment, amb el patogen que no porta RNAP T7 i tant l'hoste com el patogen estan decorats amb etiquetes de fusió d'ADN. Curiosament, vam observar que a concentracions més baixes de patogen (el patogen és el 25 o el 50% de la població total), la fluorescència de l'hoste només disminueix lleugerament. Tanmateix, augmentar la concentració de patògens al 75% provoca una disminució significativa de la fluorescència GFP hoste (figura 4c). Especulem que aquest resultat podria ser causat per la fuita relativament lenta de nutrients de les cèl·lules sintètiques a una concentració d'aHL més baixa. La fluorescència de GFP es va mesurar només després de 12 h d'incubació i la GFP és una proteïna molt estable. Per tant, és possible que en el cas de concentracions més baixes d'aHL (menor quantitat de patògens), la fuita de nutrients causada per aHL fos prou lenta perquè les cèl·lules hostes acumulessin quantitats significatives de GFP abans que els efectes de la fuita induïda per aHL es tornin paralizants. el metabolisme. Per desacoblar els resultats de la competència simple per recursos entre els genomes hoste i paràsit, vam realitzar experiments d'"infecció amb rescat" en què el tampó exterior contenia totes les petites molècules que componen l'energia TxTl, aminoàcids i mescles de sal. Això es va configurar de manera similar a la condició de "nutrients exteriors" provada a la figura 4b. La disminució de la fluorescència de l'hoste en aquests experiments va ser similar a les mostres anteriors de "infecció sense rescat" amb nivells del 25 i 50% del patogen. La disminució de la fluorescència de l'hoste al 75% del patogen va ser significativament menor que la disminució observada a les mostres sense rescat (figura 4d). La gran diferència de resultats de l'experiment amb el 75% del paràsit, amb els punts de dades dels panells de la figura 4 (c, d) destacats amb una estrella, sembla donar suport a la nostra hipòtesi que les concentracions més altes d'aHL causen danys al principi de la reacció. A una concentració de patògens més baixa, la fuga és prou lenta perquè s'acumuli la GFP hoste (com es veu amb i sense nutrients de rescat), de manera que la fluorescència de GFP observada disminueix després de la infecció, principalment a causa de la competència pels recursos. A concentracions més altes de patògens, la fluorescència GFP en mostres amb nutrients externs disminueix principalment a causa de la competència dels recursos. Aquests experiments demostren que podem dissenyar cèl·lules sintètiques per modelar la infecció, donant lloc a dos resultats diferents: la penalització metabòlica de la pròpia infecció (disminució de la GFP a causa de la competència dels recursos) i una infecció més "mortal" resultant de l'abolició de l'expressió de proteïnes dels hostes. Encoratjats per aquesta observació, vam decidir investigar un sistema en què les cèl·lules sintètiques poguessin resistir activament una infecció patògena i investigar la penalització metabòlica d'aquesta resposta.

Beneficis de cistanche per a homes que enforteixen el sistema immunitari

Les cèl·lules sintètiques poden defensar-se de la infecció mitjançant una estratègia inspirada en bacteris.

Inspirats per la coneguda funció de les endonucleases de restricció per salvaguardar els bacteris contra l'ADN estrany, vam intentar emprar aquesta estratègia dins de cèl·lules sintètiques. Hem ampliat el sistema de paràsits que es presenta a la figura 2: a més de la GFP, hem afegit un plasmidi que conté MunI a l'hoste. El paràsit contenia mCherry, com en experiments anteriors. El plasmidi mCherry conté un lloc de restricció MunI (figura 5a). Primer, vam realitzar experiments de prova de principi per avaluar la càrrega metabòlica d'expressar MunI a l'amfitrió. En aquests experiments de TxTl no encapsulats, vam controlar l'expressió de GFP i l'expressió de mCherry, cadascuna barrejada amb una quantitat creixent de plasmidi MunI o EcorI. Tots els gens estaven sota el control del mateix promotor T7. El gen GFP tenia un lloc de restricció EcorI però no MunI i el gen mCherry tenia un lloc de restricció MunI però no EcorI. Quan el plasmidi de l'enzim de restricció es va barrejar amb un plasmidi de proteïna fluorescent sense un lloc de reconeixement per a aquest enzim de restricció, l'expressió de la proteïna fluorescent va disminuir proporcionalment a l'augment del plasmidi de l'enzim de restricció, cosa que indica la competència entre els dos plasmidis pels recursos TxTl, com es va demostrar anteriorment per a GFP. i mCherry a la figura 2. Aquestes parelles no talladores eren GFP amb MunI (figura 5b) i mCherry amb EcorI (figura 5e). Quan una proteïna fluorescent es va emparellar amb un enzim de restricció capaç de tallar el gen d'aquesta proteïna fluorescent, la fluorescència va disminuir significativament fins a nivells gairebé de fons a concentracions més altes de plasmidi de l'enzim de restricció. Aquests parells de tall eren GFP amb EcorI (figura 5c) i mCherry amb MunI (figura 5d). Això va indicar una disminució de la fluorescència significativament més enllà de la simple competència pels recursos i similar a l'escenari d'infecció demostrat a la figura 3. L'expressió MunI en presència de GFP disminueix l'expressió de GFP. Si utilitzem GFP com a intermediari per al metabolisme "de base" de l'amfitrió, llavors MunI es pot veure com una càrrega metabòlica a l'amfitrió.

Figura 4. L'hoste és susceptible a una infecció "mortal", però l'hoste pot ser rescatat. ( a ) L'amfitrió conté un plasmidi GFP i el patogen conté un plasmidi que codifica el canal de membrana d'hemolisina (aHL). Després de la infecció, l'hoste expressa aHL, que crea porus a la membrana, provocant fuites de nutrients i provocant una disminució de l'activitat metabòlica de l'hoste. ( b ) Prova de principi per a un aHL que expressa l'hoste (sense infecció, l'amfitrió es va crear amb GFP de 5 nM i la quantitat indicada de plasmidi aHL). L'hoste es va incubar en un tampó amb o sense nutrients (tots els components de la barreja d'energia, sal i aminoàcids utilitzats per preparar el sistema de traducció lliure de cèl·lules hoste). La concentració òptima de nutrients de rescat es va establir experimentalment, les dades es mostren a la figura S23. (c) Infecció de l'hoste amb el patogen, amb quantitats variables de patogen per cèl·lula hoste. La fuita de molècules petites de les cèl·lules "sanes" i "infectades" es va mesurar directament mitjançant un colorant de molècules petites, les dades es mostren a les figures S24 i S25. (d) Experiments similars a aquests es mostren al panell (c), però el tampó exterior conté nutrients de molècules petites similars a les condicions experimentals "nutrients fora" que es mostren al panell (b). Les barres d'error de tots els panells indiquen SEM, n=3. Els valors de fluorescència dels panells (b-d) es normalitzen a la fluorescència blava del colorant de membrana utilitzat per normalitzar el senyal a la concentració de les cèl·lules hoste. Els símbols de diamant als panells (c, d) destaquen una condició particular que il·lustra millor les diferències en resposta a la infecció d'un hoste sense panell de nutrients externs (c) i immune al patogen a causa de la presència de panell de nutrients externs (d). Per als panells (c, d), la sèrie "GFP infectat" és l'amfitrió fusionat amb el patogen que porta la proteïna aHL, i "GFP saludable" és l'amfitrió fusionat amb el patogen que no porta plasmidi.

Passem als experiments d'infecció, barrejant l'hoste (amb plasmidis GFP i MunI) amb un paràsit (amb plasmidi mCherry). Com abans, vam investigar escenaris amb una quantitat creixent de paràsits a la població (figura 5f). El control positiu d'un mCherry que expressa l'hoste només (amb EcorI en lloc de MunI per equilibrar la càrrega metabòlica) va crear un punt de referència per a la quantitat màxima teòrica de proteïna patògena que es pot expressar a l'amfitrió (figura 5f). A mesura que augmentava la quantitat de paràsit, la fluorescència de GFP de l'hoste va disminuir, però la disminució de la fluorescència de l'hoste infectat va ser significativament menor que la disminució de l'expressió de GFP observada en experiments anteriors amb el mateix paràsit. La fluorescència de GFP i mCherry paràsit d'aquest MunI que expressa l'hoste infectat (punt de dades etiquetat amb una estrella a la figura 5f) es pot comparar directament amb hostes d'infecció similars sense MunI (punt de dades etiquetat amb una estrella a la figura 2e). En l'hoste que expressa MunI, la GFP hoste va començar amb un nivell absolutament més baix mentre estava sana (perquè alguns recursos es desvien per expressar MunI), però després de la infecció, la disminució de la fluorescència de l'hoste és molt menys significativa i l'amfitrió fa molt menys paràsit de la proteïna mCherry. que en el cas de l'amfitrió no expressant MunI. Aquest experiment demostra el benefici que l'hoste gasta alguns recursos en defensa contra els paràsits. Aquest sistema es podria veure com un model bioquímic molt senzill per als organismes que expressen proteïnes per defensar-se de futures infeccions o fins i tot de factors ambientals nocius. L'amfitrió originalment és menys robust (si prenem l'expressió GFP com a referència per a la salut de l'amfitrió), però en cas d'infecció, els recursos addicionals que l'amfitrió va gastar en expressar proteïnes defensives es beneficien, proporcionant protecció contra el paràsit infectant. Per tant, en aquesta senzilla cèl·lula sintètica no viva, vam reconstituir un exemple d'una carrera d'armes biològica fonamental.

Figura 5. Les cèl·lules hoste es defensen de la infecció. ( a ) Les cèl·lules hostes contenen dos plasmidis: un que codifica GFP (sense lloc de restricció MunI) i l'altre que codifica l'enzim de restricció MunI (el gen de la "resistència dels paràsits"). El paràsit conté plasmidi mCherry, en un sistema similar als experiments que es mostren a la figura 2. La infecció està mediada per la fusió mitjançant etiquetes d'ADN a la superfície de l'hoste i el paràsit. Després de la infecció, el plasmidi mCherry introduït pel paràsit és digerit per l'enzim de restricció MunI de l'hoste. ( b - e ) Mesurar el cost metabòlic d'expressar la resistència del paràsit. Els experiments es fan en un sistema TxTl a granel, no encapsulat en vesícules. En cada experiment, el plasmidi proteic fluorescent (GFP o mCherry) es va barrejar amb el plasmidi de l'enzim de restricció (MunI o EcorI) a la proporció indicada a l'eix x per a la concentració total de plasmidi de 10 mM. GFP té un lloc de restricció EcorI però no un lloc MunI, i mCherry té un lloc de restricció MunI però no un lloc de restricció EcorI. La línia de tendència és una guia visual però no un ajust de dades. Les barres d'error indiquen SEM, n=3. A la figura S26 es proporcionen experiments de control amb enzims de restricció purificats, en lloc d'expressar-los a partir d'un plasmidi. També es va mesurar l'estabilitat dels liposomes amb una quantitat augmentada de plasmidi de paràsits, dades que es mostren a la figura S27. (f) Infecció de l'hoste amb una quantitat creixent de paràsits. "Host GFP healthy" és l'expressió de GFP de cèl·lules hoste fusionades amb el paràsit sense cap plasmidi. "Host GFP infectat" és l'amfitrió fusionat amb el paràsit que porta mCherry. La fluorescència vermella és la fluorescència mCherry del paràsit fusionat amb l'hoste (només es disposa de dades de l'hoste infectat. Les mostres de l'hoste sans no portaven plasmidi mCherry). Les barres d'error de tots els panells indiquen SEM, n=3. Els valors de fluorescència es normalitzen a la fluorescència blava del colorant de membrana utilitzat per normalitzar els resultats a la concentració de les cèl·lules hoste. El símbol del diamant indica l'expressió de la proteïna del paràsit en condicions particulars d'infecció, directament comparable al punt de dades destacat amb una estrella a la figura 2e, un experiment en les mateixes condicions, però amb l'hoste sense el gen de resistència MunI.

Figura 6. La inoculació proporciona defensa contra les infeccions. ( a ) L'amfitrió conté plasmidi GFP. El patogen d'aquests experiments és un dels tres esquemes d'infecció demostrats en aquest article: un paràsit (com es mostra a la figura 2), un patogen amb l'enzim de restricció MunI que digereix el genoma GFP de l'hoste (com es mostra a la figura 3) o un patogen. transportant el canal de membrana aHL provocant fuites de nutrients de l'hoste (com es mostra a la figura 4). En cada cas, l'hoste i el patogen contenen etiquetes complementàries de fusió d'ADN. Abans d'introduir el patogen, l'hoste s'"inocula": s'incuba amb un excés d'oligos d'ADN ss complementaris a les etiquetes d'ADN de fusió a la superfície de l'hoste (etiquetes idèntiques a aquestes del patogen menys la part de colesterol utilitzada per ancorar l'etiqueta a la membrana de el patogen). La inoculació fa que les etiquetes de fusió a la superfície de l'hoste es tornin bicatenàries, la qual cosa fa que la fusió amb el patogen sigui impossible. (b) L'esquema de prova de principi per a la inoculació. La població de liposomes que porten GFP sota el control del promotor de l'ARN T7, però sense ARN polimerasa T7, es fusiona amb liposomes que contenen ARN polimerasa T7. La proteïna GFP només es pot expressar si les dues poblacions es fusionen. Un o ambdós socis de mescla es van "inocular" mitjançant la incubació amb una etiqueta d'ADN compatible amb les etiquetes de fusió a la superfície del liposoma, fent que les etiquetes de fusió siguin de doble cadena i, per tant, incompatibles amb la fusió. A la figura S28 es mostra un temps representatiu per a l'expressió de proteïnes. Els experiments de control sense cap etiqueta de fusió es troben a la figura S29, i els controls amb etiquetes de fusió incompatibles es proporcionen a la figura S30. La concentració d'oligo d'inoculació es va establir experimentalment, les dades es mostren a la figura S31. (c) Experiments d'infecció per paràsits. Un hoste que portava GFP es va fusionar amb un paràsit que portava mCherry, tal com es descriu a la figura 2. L'hoste i el paràsit es van barrejar amb una proporció variable de l'hoste al paràsit; les cèl·lules hoste es van inocular (amb etiquetes de fusió d'ADN de doble cadena no compatibles amb la fusió) o no es van inocular (per tant, susceptibles a la fusió amb el paràsit). La fluorescència de mCherry només s'informa per a mostres amb l'hoste no inoculat perquè no hi havia fluorescència de mCherry mesurable a les mostres d'hoste inoculades. Es va provar una inoculació invertida inoculant el paràsit en lloc de l'hoste, les dades es mostren a la figura S32. ( d ) Experiments d'infecció amb el genoma hoste susceptible al patogen que porta l'enzim de restricció MunI, tal com es descriu a la figura 3. La sèrie de dades infectades representa un hoste sense inoculació, i la sèrie de dades inoculades representa mostres amb l'hoste incubat amb oligos d'inoculació, per tant, no és susceptible de fusió amb el patogen. ( e ) Els experiments d'infecció amb el patogen portador del gen aHL, donen lloc a que els canals d'aHL surtin nutrients de les cèl·lules hoste després de la infecció, tal com es descriu a la figura 4. La sèrie de dades infectada representa l'hoste sense inoculació i la sèrie de dades inoculada representa mostres amb el hoste incubat amb oligos d'inoculació, per tant no susceptible de fusió amb el patogen. Les barres d'error de tots els panells indiquen SEM, n=3. Els valors de fluorescència en panells (c−e) es normalitzen a la fluorescència blava del colorant de membrana utilitzat per normalitzar els resultats a la concentració de les cèl·lules hoste. Algunes dades que es mostren en aquesta figura són experiments amb una configuració idèntica als experiments que es mostren a les figures anteriors (tal com s'indica a cada subtítol). Aquests experiments es van repetir per a aquesta figura per produir dades utilitzant el mateix lot de TxTl per comparar directament els resultats, eliminant la variabilitat lot a lot de les preparacions de TxTl.

La inoculació de cèl·lules sintètiques prevé la infecció.

A l'exemple descrit anteriorment, vam demostrar que l'hoste es defensava de la influència del genoma d'un patogen expressant una proteïna addicional. A continuació, vam preguntar si és possible modelar un escenari on alguna intervenció faci que un hoste prèviament susceptible sigui immune a la infecció en primer lloc. L'hem anomenat model d'inoculació. Tot i que reconèixer això està lluny de ser una analogia perfecta, l'aspecte en què ens hem centrat és que la cèl·lula sintètica hoste no gasta cap recurs per generar immunitat. En el nostre model d'immunització, vam dissenyar un tractament que converteix la cèl·lula sintètica hoste susceptible a la infecció en cèl·lules que no poden fusionar-se amb un patogen. El sistema de fusió cel·lular sintètica que s'utilitza al llarg d'aquest article es basa en etiquetes d'ADN monocatenari per induir la fusió de la membrana del liposome. Per inocular contra la fusió amb un patogen, vam incubar les cèl·lules amb un oligonucleòtid d'ADN complementari a l'oligo de fusió a la superfície de les cèl·lules (figura 6a). En primer lloc, calia confirmar que la inoculació per incubació amb oligo complementaris funciona per abolir la fusió. En els experiments de prova de principi, es van preparar dues poblacions de liposomes: una població tenia TxTl amb un plasmidi que codificava GFP sota el control del promotor T7 i l'altra població tenia TxTl i ARN polimerasa T7 però sense plasmidi. Després de la fusió d'aquestes dues poblacions, el plasmidi GFP es va barrejar amb l'ARN polimerasa T7 i va induir l'expressió GFP. Si les dues poblacions tenien etiquetes de fusió monocatenaris i complementàries, es va produir la fusió i es va detectar fluorescència GFP. Si una o ambdues poblacions es van incubar amb un oligonucleòtid complementari a l'etiqueta de fusió, no es va produir la fusió de liposomes i no es va expressar GFP (figura 6b). Un cop establert el sistema d'inoculació, es va procedir a introduir la inoculació per protegir les cèl·lules sintètiques hoste en tres dels escenaris d'infecció descrits anteriorment en aquest treball. Primer, vam utilitzar l'escenari paràsit descrit a la figura 2. Les cèl·lules hoste, que contenien un genoma GFP, es van inocular amb un oligo complementari a l'etiqueta de fusió a la superfície de l'hoste, i l'hoste es va barrejar amb el paràsit mCherry. Hem barrejat l'hoste amb el paràsit en diferents proporcions. En totes les condicions d'infecció, la fluorescència del paràsit mCherry era indetectable si l'hoste era inoculat i la fluorescència GFP de l'hoste inoculat no disminuïa. Els experiments de control amb l'hoste no inoculat van mostrar una disminució de l'expressió GFP de l'hoste i un augment del senyal mCherry del paràsit, com s'esperava (figura 6c). A continuació, vam aplicar el sistema d'inoculació al cas d'un hoste infectat amb un patogen portador d'un enzim de restricció MunI que codifica el genoma capaç de digerir el genoma GFP dels hostes, com en els experiments que es mostren a la figura 3. L'hoste inoculat no va mostrar una disminució. a la fluorescència de GFP després de barrejar-se amb quantitats creixents del patogen, mentre que l'hoste no inoculat estava infectat i la fluorescència de GFP de l'amfitrió va disminuir proporcionalment a la quantitat creixent de patogen (figura 6d). La inoculació també va ser eficaç contra el patogen aHL. Els hostes inoculats no van mostrar cap disminució de la fluorescència en barrejar-se amb el patogen, mentre que la fluorescència GFP de l'hoste no inoculat va disminuir significativament amb la infecció (figura 6e). En tots els casos, aquest senzill procediment d'inoculació, incubant l'hoste amb un oligo d'ADN complementari a l'oligo de fusió a la superfície de l'hoste, va ser suficient per abolir la capacitat de les cèl·lules sintètiques patògenes d'infectar les cèl·lules hoste. Per tant, vam demostrar un model d'intervenció fisicoquímic senzill que protegeix les cèl·lules hoste de la infecció.

Beneficis de cistanche per a homes que enforteixen el sistema immunitari

CONCLUSIONS

En aquest article, demostrem mètodes per utilitzar cèl·lules mínimes sintètiques per modelar infeccions per paràsits i patògens. La motivació darrere del nostre treball va ser doble. Volíem dissenyar un comportament complex i realista en cèl·lules sintètiques, facilitant l'objectiu d'enginyeria de cèl·lules sintètiques que s'assemblin més a les cèl·lules vives naturals. També hem volgut aprofitar el sistema de cèl·lules sintètiques senzill i controlable per modelar les propietats bàsiques dels processos d'infecció, inoculació i resistència. Tot i que les cèl·lules sintètiques no evolucionen ni s'autorepliquen, aquest sistema permet estudiar la dinàmica de la infecció en un model senzill i fàcil d'analitzar. Esperem que els principis d'infecció descrits aquí ajudin a crear models pràctics i aplicables per a diferents patògens i mitigació de la infecció. L'estudi d'aquest sistema cel·lular sintètic simplificat va destacar les interaccions fonamentals entre el paràsit i el patogen. Tot i que les cèl·lules sintètiques no estan (encara) vives, i no tenen la capacitat de patir l'evolució darwiniana, aquest sistema ens permet observar les interaccions entre patògens i hostes sense la capacitat de desenvolupar immunitat natural o canviar la virulència del patogen. Tot i que la dinàmica d'infecció de l'hoste que es presenta aquí utilitzen cèl·lules sintètiques basades en bacteris, aquest sistema no es limita de manera inherent a TxTl bacteriana. Fins i tot seria possible imaginar utilitzar el sistema que aquí es presenta per modelar la dinàmica d'infecció en poblacions semblants als ecosistemes naturals, aprofitant la simplicitat inherent a les cèl·lules sintètiques per controlar i estudiar completament les interaccions entre diferents membres de grans poblacions.

REFERÈNCIES

(1) Aplicacions. Mater. Avui 2016, 19, 516−532.

(2) Gaut, Nova Jersey; Adamala, KP Reconstituint elements cel·lulars naturals en cèl·lules sintètiques. Adv. Biol. 2021, 5, núm. 2000188.

(3) Tan, C.; Saurabh, S.; Bruchez, MP; Schwartz, R.; Leduc, P. Molecular Crowding Shapes Expression gènica en nanosistemes cel·lulars sintètics. Nat. Nanotecnologia. 2013, 8, 602−608.

(4) Glantz, ST; Berlew, EE; Chow, BY Synthetic Cell-like Membrane Interfaces for Probing Dynamic Protein-Lipid Interactions, 1a ed.; Elsevier Inc, 2019; Vol. 622.

(5) Zhao, J.; Zhang, Y.; Zhang, X.; Li, C.; Du, H.; Sønderskov, SM; Mu, W.; Dong, M.; Han, X. Imitació del metabolisme cel·lular en cèl·lules artificials: transport universal de molècules a través de la membrana mitjançant la fusió de vesícules. Anal. Chem. 2022, 94, 3811−3818.

(6) Damiano, L.; Stano, P. Sobre la "Life-Likeness" de les cèl·lules sintètiques. Davant. Bioeng. Biotecnologia. 2020, 8, núm. 953.

(7) Salehi-Reyhani, A.; Ces, O.; Elani, Y. Artificial Cell Mimics as Simplified Models for the Study of Cell Biology. Exp. Biol. Med. 2017, 242, 1309−1317.

(8) Chakraborty, T.; Wegner, SV Senyalització cèl·lula a cèl·lula a través de la llum en comunitats de cèl·lules artificials: un depredador brillant lures a les preses. ACS Nano 2021, 15, 9434−9444.

(9) Dupin, A.; Simmel, FC Senyalització i diferenciació en circuits gènics multicompartimentals basats en emulsió in vitro. Nat. Chem. 2019, 11, 32−39.

(10) Toparlak, OD; Zasso, J.; Bridi, S.; Serra, MD; Macchi, P.; Conti, L.; Baudet, M.-L.; Mansy, SS Les cèl·lules artificials impulsen la diferenciació neuronal. Ciència. Adv. 2020, 6, núm. eabb4920.

(11) Robinson, AO; Venero, OM; Adamala, KP Cap a la vida sintètica: comunicació cel·lular sintètica biomimètica. Curr. Opina. Chem. Biol. 2021, 64, 165−173.

(12) Smith, JM; Chowdhry, R.; Booth, MJ Controlant la comunicació cèl·lula-cèl·lula sintètica. Davant. Mol. Biosci. 2022, 8, núm. 1321.

(13) Elani, Y. Interfacing Living and Synthetic Cells as an Emerging Frontier in Synthetic Biology. Angew. Química, Int. Ed. 2021, 60, 5602− 5611.

(14) Rustad, M.; Eastlund, A.; Jardine, P.; Noireaux, V. Síntesi TXTL lliure de cèl·lules del bacteriòfag infecciós T4 en una reacció de proveta única. sintetitzador. Biol. 2018, 3, núm. ysy002.

(15) Marshall, R.; Noireaux, V. Modelització quantitativa de transcripció i traducció d'un All-E. coli Sistema lliure de cèl·lules. Ciència. Rep 2019, 9, núm 11980.

(16) Garamella, J.; Marshall, R.; Rustad, M.; Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. Sintetitzador ACS. Biol. 2016, 5, 344−355.

(17) Deich, C.; Efectiu, B.; Sato, W.; Sharon, J.; Aufdembrink, L.; Gaut, NJ; Heili, J.; Stokes, K.; Engelhart, AE; Adamala, Sistema de transcripció KP T7Max. 2021, 1−28.

(18) Gaut, Nova Jersey; Gómez-Garcia, J.; Heili, JM; Efectiu, B.; Han, Q.; Engelhart, AE; Adamala, KP Fusió programable i diferenciació de cèl·lules mínimes sintètiques. Sintetitzador ACS. Biol. 2022, 11, 855− 866.

(19) Stengel, G.; Zahn, R.; Höök, F. Fusió programable induïda per DNA de vesícules de fosfolípids. Melmelada. Chem. Soc. 2007, 129, 9584− 9585.

(20) Chizzolini, F.; Forlin, M.; Yeh Martín, N.; Berloffa, G.; Cecchi, D.; Mansy, SS La traducció lliure de cèl·lules és més variable que la transcripció. Sintetitzador ACS. Biol. 2017, 6, 638−647.

(21) Shin, J.; Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. Sintetitzador ACS. Biol. 2012, 1, 29−41.

(22) Noireaux, V.; Libchaber, A. Un bioreactor de vesícules com a pas cap a un conjunt de cèl·lules artificials. Proc. Natl. Acad. Ciència. EUA 2004, 101, 17669−17674.

(23) Adamala, KP; Martin-Alarcon, DA; Guthrie-Honea, KR; Boyden, ES Enginyeria Interaccions de circuits genètics dins i entre cèl·lules mínimes sintètiques. Nat. Chem. 2017, 9, 431−439.

(24) Noireaux, V.; Bar-Ziv, R.; Godefroy, J.; Salman, H.; Libchaber, A. Cap a una cèl·lula artificial basada en l'expressió gènica a les vesícules. Phys. Biol. 2005, 2, P1−P8.

(25) Krinsky, N.; Kaduri, M.; Zinger, A.; Shainsky-Roitman, J.; Goldfeder, M.; Benhar, I.; Hershkovitz, D.; Schroeder, A. Les cèl·lules sintètiques sintetitzen proteïnes terapèutiques dins dels tumors. Adv. Assistencial Mater. 2018, 7, núm. 1701163.

(26) Kwon, YC; Jewett, MC Mètodes de preparació d'alt rendiment d'extracte brut per a una síntesi robusta de proteïnes lliures de cèl·lules. Ciència. Rep. 2015, 5, núm. 8663.

(27) Sol, ZZ; Hayes, CA; Shin, J.; Caschera, F.; Murray, RM; Noireaux, V. Protocols for Implementing an Escherichia Coli Based TXTL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. J. Vis. Exp. 2013, 79, 1−15.

(28) Fujii, S.; Matsuura, T.; Sunami, T.; Nishikawa, T.; Kazuta, Y.; Yomo, T. Visualització de liposomes per a la selecció i evolució in vitro de proteïnes de membrana. Nat. Protoc. 2014, 9, 1578−1591.

(29) Löffler, PMG; Ries, O.; Rabe, A.; Okholm, AH; Thomsen, RP; Kjems, J.; Vogel, S. Una cascada de fusió de liposomes programada amb ADN. Angew. Química, Int. Ed. 2017, 56, 13228−13231.