Part 1 Efectes semblants als antidepressius de l'extracte de Cistanche Tubulosa en rates d'estrès crònic impredictible mitjançant la restauració de l'homeòstasi de la microbiota intestinal

Yang Li1, Ying Peng1, Ping Ma1, Hanlin Yang1, Haiyan Xiong1, Mengyue Wang1, Chongsheng Peng1, Pengfei Tu2 i Xiaobo Li1*

1 Escola de Farmàcia, Universitat Jiao Tong de Xangai, Xangai, Xina, 2 Laboratori Estatal Clau de Medicaments Naturals i Biomimètics, Escola de Ciències Farmacèutiques, Universitat de Pequín, Pequín, Xina

L'evidència creixent mostra que els trastorns neuropsiquiàtrics, com la depressió, estan relacionats amb el microbioma intestinal a través de l'eix intestí-cervell.Cistanches Herbaés ben conegut per al tractament de la deficiència del "ronyó-yang" en la medicina tradicional xinesa (MTC) i s'ha utilitzat per al tractament de malalties neurodegeneratives en els darrers anys. En aquest estudi, es va establir el model de depressió induïda per l'estrès crònic impredictible (CUS) per explorar l'impacte deCistanche tubulosaextracte (CTE) en proves de comportament, neurotransmissors de monoamines i factors neurotròfics a l'hipocamp i el còlon, la composició de la microbiota intestinal i la producció d'àcids grassos de cadena curta (SCFA). A més, es va utilitzar l'anàlisi de correlació per avaluar la relació funcional entre la microbiota intestinal alterada, els neurotransmissors i les neurotrofines canviats a l'hipocamp i el còlon i la concentració alterada de SCFA. CTE va millorar significativament els comportaments semblants a la depressió en rates amb CUS. Els nivells cerebrals d'5-hidroxitriptamina (5-HT) i l'expressió del factor neurotròfic derivat del cervell (BDNF) en rates CUS es van restaurar mitjançant CTE. L'abundància relativa de microbiota intestinal i les concentracions d'acetat i àcid hexanoic també es podrien modular mitjançant el tractament CTE. A més, vam demostrar que l'aplicació de CTE a rates CUS va provocar una forta correlació entre la composició de la microbiota intestinal alterada, els nivells de neurotransmissors de l'hipocamp i la producció de SCFA de metabòlits neuroactius. En conjunt, aquests resultats identifiquen la CTE com un tractament potencial per als símptomes depressius restaurant l'homeòstasi de la microbiota intestinal per als trastorns de l'eix microbiota-intestí-cervell, obrint noves vies en el camp de la neuropsicofarmacologia.

Paraules clau: Cistanche tubulosa, antidepressiu, estrès crònic impredictible, microbiota intestinal, eix microbiota-intestí-cervell

Per a més informació poseu-vos en contacte amb:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola té molts efectes, feu clic aquí per saber-ne més

INTRODUCCIÓ

Cistanches Herba(Rou Cong-Rong en xinès) es registra oficialment com les tiges suculentes seques deCistanche deserticola(YC Ma) iCistanche tubulosa(Schrenk) a la Comissió de Farmacopea Xinesa (2015). És una medicina tradicional xinesa (MTC) coneguda per tractar la deficiència renal, la impotència, la infertilitat femenina, la leucorrea mòrbida, la metrorràgia profusa,

i restrenyiment senil (Comissió de la Farmacopea Xinesa, 2015). Estudis anteriors han revelat diversos components químics principals deCistanches Herba, incloent glicòsids feniletanoides (PhGs), iridoides i glicòsids iridoides, lignans, alditols, oligosacàrids i polisacàrids. L'anàlisi farmacològica ha demostrat que Cistanches Herba presenta una àmplia gamma d'activitats neuroprotectores, immunomoduladores, antiinflamatòries i hepatoprotectores (Jiang i Tu, 2009; Fu et al., 2017). Els PhG s'han considerat com els principals components actius de Cistanches Herba que posseeixen diverses activitats farmacològiques, com ara neuroprotectores, immunomoduladores, antiinflamatòries, hepatoprotectores, antioxidants, etc. (Jiang i Tu, 2009; Fu et al., 2017).Cistanches Herbaes va registrar originalment al Classic of Herbal Medicine ("Shennong Bencao Jing" en xinès), un llibre conegut sobre plantes medicinals escrit entre el 200 i el 250 dC, com una "herba alta" que pot regular "cinc soques (vísceres)". i set (menjar en excés, ira, humitat, fred, preocupació, vent i pluja i por) deficiències" (Huang, 1982). Avui en dia, Cistanches Herba és àmpliament acceptat com a tònic d'herbes per a la debilitat general (Fu et al., 2017).C. tubulosaLes càpsules de glucòsids (Memoregain®) s'utilitzen per al tractament de la malaltia d'Alzheimer (Guo et al., 2013). Un sistema dopaminèrgic disfuncional és una de les patogènesis clau de la hipòtesi monoamina de la depressió (Duman et al., 1997; Krishnan i Nestler, 2008). Echinacoside (un dels PhG) i PhG deSalsa de Cistanches'ha trobat que protegeixen les neurones dopaminèrgiques contra la neurotoxicitat de la dopamina (DA) induïda per la 1-metil-4-fenil{-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) que pot augmentar la DA nivells a l'estriat de ratolins C57 (Tian i Pu, 2005; Geng et al., 2007). A més, el catalpol i el genipòsid són dos iridoides representatius a Cistanches Herba, i s'ha trobat que milloren el comportament de la depressió induït per l'estrès crònic impredictible (CUS) mitjançant la restauració de les disfuncions de l'eix hipotàlem-hipofisi-adrenal (HPA) i el catalpol pot regular millor el cervell. expressió del factor neurotròfic derivat (BDNF) (Cai et al., 2015; Wang et al., 2015). A més, l'última publicació ofereix una nova evidència que la decocció de Cistanches Herba va reduir significativament el període d'immobilitat a la prova de suspensió de la cua del ratolí, cosa que suggereix fortament que Cistanches Herba té potencials qualitats semblants als antidepressius (WangD. et al., 2017).

La medicina tradicional xinesa atrau cada cop més l'atenció com a tractament de la depressió a causa dels seus efectes secundaris relativament moderats (Sarris et al., 2011; Feng et al., 2016). Diversos tipus de TCM, com ara compostos individuals del fàrmac brut (ginsenòsid Rb1, ginsenòsid Rg3 i Yuanzhi-1) (Jin et al., 2015; Kang et al., 2017; Wang GL et al., 2017; ), materials medicinals xinesos únics (arrel de Panax ginseng, rizoma Acorus tatarinowii i Morinda officinalis) (Dang et al., 2009; Han et al., 2013; Xu et al., 2016) i decoccions de TCM (Kai-Xin- San, Chaihu-Shu-Gan-San, Xiaoyaosan i Xiaochaihutang) (Dai et al., 2010; Su et al., 2011; Su et al., 2014; Yan et al., 2016) s'han estudiat i mostrat profundament per revertir o mitigar símptomes semblants a la depressió. Per exemple, es va trobar que Kai-Xin-San alleujava notablement els símptomes de les rates depressives induïdes per CUS augmentant la quantitat de neurotransmissors, factors neurotròfics i els seus receptors corresponents i promovent l'expressió de la sinaptotagmina i la densitat de la columna dendrítica (Yan et al. ., 2016).

No obstant això, estudis anteriors de TCM es basen en resultats en proves de comportament semblants a depressors i se centren en el mecanisme d'acció farmacològic convencional. La connexió entre l'eficàcia antidepressiva de la TCM administrada per via oral i la microbiota intestinal no s'entén bé. L'evidència creixent avala que la microbiota intestinal té un paper crucial en la regulació de les funcions cerebrals, especialment la depressió i altres trastorns relacionats amb l'estrès (Foster i Neufeld, 2013; Sherwin et al., 2017). Per exemple, l'estrès crònic provoca una desregulació de l'estructura microbiana intestinal de rata, amb una disminució de la relació Firmicutes/Bacteroidetes i, més concretament, una disminució de l'abundància relativa de Lactobacillus i un augment d'Oscillibacter (Meng et al., 2017). A més, el trasplantament fecal de microbiota desregulada de pacients deprimits a ratolins lliures de gèrmens va conferir un fenotip semblant a la depressió en aquests animals, cosa que indica que la microbiota intestinal desregulada provoca símptomes fisiològics i comportamentals de depressió i ansietat (Kelly et al., 2016; Zheng et al. ., 2016). En experiments amb animals, es va trobar que alguns moduladors de la microbiota com els probiòtics i els prebiòtics milloren el comportament semblant a la depressió en ratolins amb estrès crònic millorant la microbiota intestinal (Bravo et al., 2011; Bharwani et al., 2017; Burokas et al., 2017). ).

Atesa l'associació entre la microbiota intestinal i el desenvolupament de la malaltia, així com la plasticitat de l'estructura de la microbiota intestinal, vam decidir investigar els efectes de la microbiota intestinal per mediar la depressió ens va cridar l'atenció i es va investigar (Chang et al., 2017; Xu et al. ., 2017). Per aconseguir-ho, es va realitzar la seqüenciació del gen 16S rRNA combinada amb l'anàlisi d'estadístiques Meta (White et al., 2009) per analitzar la composició de la microbiota intestinal. En el present estudi,C. tubulosava ser seleccionat per avaluar els seus efectes semblants als antidepressius perquè té un nivell més elevat de PhG en comparació ambC. deserticola. Es va establir un model de depressió induïda per CUS de rata per explorar l'impacteC. tubulosaextracte (CTE, que consisteix en un 48,6 per cent de PhG, un 6,9 per cent de glicòsids iridoides i un 20,0 per cent de sacàrids totals) en proves de comportament, neurotransmissors de monoamines i factors neurotròfics a l'hipocamp i el còlon, la composició de la microbiota intestinal i els producció d'àcids grassos en cadena (SCFA). A més, la relació funcional entre la microbiota intestinal alterada va canviar els neurotransmissors i les neurotrofines tant a l'hipocamp com al còlon, i es va estudiar la concentració alterada de SCFA. L'anàlisi de correlacions es va utilitzar per corroborar l'evidència que la CTE s'adreça a la microbiota intestinal per al tractament de la depressió mitjançant la modulació de l'eix microbiota-intestí-cervell.

Cistanchepot millorar la immunitat

MATERIALS I MÈTODES

Materials

La fluoxetina (FLX) es va comprar a Aladdin Industrial Inc. (Xangai, Xina). 5-Hidroxitriptamina (5-HT), norepinefrina (NE) i kits d'ELISA BDNF es van comprar a l'Institut de Bioenginyeria de Nanjing Jiancheng (Nanjing, Xina). L'acetonitril de grau HPLC es va comprar a Merck (Darmstadt, Alemanya). L'aigua desionitzada es va preparar a partir d'aigua destil·lada mitjançant un sistema de purificació d'aigua Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, Estats Units). Tots els altres reactius i productes químics utilitzats eren de grau analític.

Tiges seques deC. tubulosaes van recollir al comtat d'Hetian (Xinjiang, Xina). Les mostres d'exemplars del val van ser autenticades pel professor Xiaobo Li i dipositades a l'herbari de l'Escola de Farmàcia de la Universitat Jiao Tong de Xangai (Xangai, Xina). La pols homogèniaC. tubulosaLes tiges es van suspendre en deu vegades d'etanol al 70 per cent i es van refluxar tres vegades, cadascuna durant 1 h a 100 graus. Els extractes es van filtrar amb gasa, es van evaporar al buit a 65 graus i es van liofilitzar. La mostra es va tornar a dissoldre i després es va separar per resina macroporosa D101. Després de l'adsorció, es va descartar la fracció eluïda amb aigua. El CTE es va obtenir després d'eluir amb etanol al 40 per cent, després es va evaporar al buit a 65 graus i es va liofilitzar.

Anàlisi de la composició química del CTE

El contingut relatiu de PhG en CTE es va determinar mitjançant espectrofotometria UV a 330 nm utilitzant echinacòsid com a estàndard. El contingut relatiu d'iridoides i glicòsids iridoides es va mesurar mitjançant espectrofotometria UV amb el mètode de doble longitud d'ona per evitar la interferència espectral dels PhG (es va utilitzar 237 nm per a la quantificació espectroscòpica, es va utilitzar un punt isosbèstic de 280 nm per a la longitud d'ona de referència), es va utilitzar genipòsid com a estàndard. El contingut total de carbohidrats de CTE es va determinar mitjançant el mètode colorimètric fenol-sulfúric amb glucosa com a estàndard (Chow i Landhausser, 2004).

Els principals constituents químics de CTE es van caracteritzar per UPLC-Q-TOF-MS. L'anàlisi UPLC-Q-TOF-MS es va realitzar en un sistema Waters ACQUITY UPLC (Waters Corp., Milford, MA, Estats Units) amb una columna ACQUITY UPLC BEH C18 (100 mm x 2,1 mm id, 1,7 段m, Waters Corp., Estats Units) mitjançant elució gradient utilitzant 0,1 per cent d'àcid fòrmic acetonitril (A) i 0,1 per cent d'àcid fòrmic en aigua (B) a un cabal de 0,4 ml/min. El perfil del gradient va ser: 0-5 min (A: 5-20 per cent ), 5-7,5 min (A: 20-30 per cent ), 7,5-10 min ( A: 30-70 per cent ), 10-11 min (A: 70-100 per cent ) i es manté durant 1,5 min. El gradient es va reciclar de nou al 5 per cent en 0,5 min i es va mantenir durant 2,5 minuts per a la següent carrera. El volum d'injecció era de 3 [il. La temperatura del forn de columna es va establir a 35 graus.

L'espectrometria de masses es va dur a terme mitjançant un espectròmetre de masses Waters Vion IMS (Waters Corp., Milford, MA, Estats Units). La ionització es va realitzar en el mode electrospray negatiu (ESI). Els paràmetres MS eren els següents: tensió capil·lar, 2.0 kV; tensió del con, 20 V; temperatura de la font, 120 graus; temperatura de desolvació, 500 graus; fluxos de gas de con i desolvació, 50 i 1,000 L/h, respectivament. Per a una mesura precisa de la massa, es va utilitzar la leucina-encefalina com a massa de bloqueig per generar un ió [MH]- (m/z 554,2615). Es va dur a terme un experiment MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) en dues funcions d'exploració de la següent manera: funció 1 (baixa energia): m/z 50-1,000, temps d'exploració de 0,25 s, retard entre exploració de 0,02 s , 6 eV energia de col·lisió; funció 2 (alta energia): m/z 50-1,000, temps d'exploració de 0,25 s, retard entre exploració de 0,02 s, rampa d'energia de col·lisió de 20-45 eV. Les dades es van processar mitjançant el programari UNIFI 1.8.1 (Waters Corp., Milford, MA, Estats Units).

Experiments amb animals

Les rates masculines Sprague-Dawley (200 土 20 g) es van adquirir de la Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Beijing, Xina) i es van allotjar al Laboratory Animal Center de la Universitat Jiao Tong de Xangai (Xangai, Xina). Els animals es van allotjar en grups a temperatura ambient controlada (25 土 2 graus, 55 土 10 per cent d'humitat relativa) amb un cicle de llum-foscor de 12:12 h. A les rates se'ls va permetre l'accés lliure a menjar i aigua de laboratori habituals durant 1 setmana. Les instal·lacions i els protocols dels animals van ser aprovats pel Comitè d'Ètica Animal de la Universitat Jiao Tong de Xangai (Xangai, Xina).

Després d'una setmana d'aclimatació, 40 rates ingènues van ser sotmeses a un període de 72 hores d'entrenament amb sacarosa i proves de base de sacarosa. Les rates es van dividir en cinc grups (n=8) en funció de la seva preferència de sacarosa a la prova inicial de sacarosa (figura suplementària S1). El grup control i el grup CUS van rebre solució salina (10 ml/kg). Per als altres tres grups, CTE a dosi alta (CTEH) (400 mg/kg), dosi baixa (CTEL) (200 mg/kg) i FLX (10 mg/kg) es van administrar per via intragàstrica 1 h abans del procediment de CUS (de 8:00 a 09:00) al llarg de 4 setmanes.

L'estrès crònic impredictible es va desenvolupar tal com es va descriure anteriorment (Willner, 1997; Xue et al., 2013), tret del grup de control no estressat, es van aplicar una sèrie d'estressors a les rates: il·luminació estroboscòpica de baixa intensitat durant la nit (120 flaixos/ min), soroll blanc (100 dB) durant 1 h, privació d'aigua durant 24 h, ampolles d'aigua buides durant 1 h (després de la privació d'aigua), privació d'aliments durant 24 h, natació forçada (5 min), contenció física ({{11 }} h), gàbia bruta durant 24 h (200 ml d'aigua en 100 g de serradures), pessic de cua (1 min), inclinació de la gàbia de 45 graus durant 24 h, xoc durant 30 min i il·luminació nocturna (12 h). Els estressants es van aplicar de manera contínua i aleatòria durant 4 setmanes, els detalls dels quals es descriuen a la taula complementària S1. El menjar i l'aigua estaven disponibles lliurement per a les rates de control no estressades, que es van mantenir tranquil·les a una altra habitació, excepte el període de privació de 14 hores abans de cada prova de sacarosa. Una rata va morir durant el procediment CUS. Després es va realitzar la prova de natació forçada (FST).

4 dies d'administració aguda i després de 28 dies d'estrès, es va realitzar la prova de preferència de sacarosa (SPT) (dia 29), prova de camp obert (OFT) (dia 31) i prova d'alimentació suprimida per novetats (NSFT) (dia 33). L'esquema d'un disseny per a CUS i proves de comportament es mostra a la figura complementària S2.

Es va realitzar una prova de natació forçada tal com es va descriure anteriorment (Porsolt et al., 1978). El procediment va consistir en sessions de pretest i proves, utilitzant els mateixos aparells i condicions (diàmetre 20 cm, alçada 45 cm, conté 25 cm d'aigua mantinguda a 26 graus). Durant la sessió de pretest, les rates es van veure obligades a nedar durant 15 minuts; 24 h després, les rates es van col·locar al mateix aparell durant una sessió de prova de natació de 5 minuts. El comportament de la natació dins

Es van observar 5 min amb una càmera de vídeo i es va mesurar i analitzar la durada de la immobilitat.

Per a SPT, les rates es van entrenar primer per consumir una solució de sacarosa a l'1 per cent (v/v) durant 72 h abans de l'SPT. La prova de base de sacarosa abans del procediment de CUS i la SPT al final de la CUS es van realitzar tal com es va descriure anteriorment (Xue et al., 2013).

La prova de camp obert es va dur a terme al final del procediment CUS, l'aparell i el mètode eren els mateixos que s'han detallat anteriorment (Xue et al., 2013). Es va utilitzar un sistema de seguiment de vídeo (Shanghai Mobile Datum Information Technology Co., Ltd.) per registrar la distància total recorreguda.

La prova d'alimentació suprimida per novetats es va avaluar tal com es va descriure anteriorment (Xue et al., 2013) i es va registrar i analitzar la latència per començar a menjar en 5 minuts.

Mesura de Neurotransmissors i Factors Neurotròfics

Després de proves de comportament, es van obtenir almenys quatre pellets fecals de cada rata, es van col·locar en tubs cònics estèrils i es van congelar immediatament a -80ºC per a l'anàlisi de la comunitat microbiana i els SCFA. Després d'això, es van sacrificar rates; l'hipocamp i el còlon es van aïllar i es van pesar immediatament. Les mostres de teixit es van rentar amb solució salina, es van congelar ràpidament en nitrogen líquid i es van mantenir a -80ºC per a l'emmagatzematge. Després de la descongelació seqüencial a -20ºC i 4ºC, les mostres de teixit es van homogeneïtzar en solució salina i es van centrifugar durant 25 min a 2.500 rpm / 4ºC. El sobrenedant resultant es va recollir i emmagatzemar a 4ºC fins al seu ús. Els nivells de 5-HT a l'hipocamp i al còlon, NE a l'hipocamp i BDNF a l'hipocamp es van determinar mitjançant kits ELISA comercials segons els protocols del fabricant (Hou et al., 2017).

Cistanchepot alleujarronyómalaltia

Anàlisi del perfil compositiu de la microbiota intestinal

L'ADN total de la microbiota intestinal de mostres fecals es va extreure tal com es va descriure anteriorment (Wei et al., 20{{20}}4). Cada mostra fecal (0,2 g) es va barrejar en 1 ml de PBS i es va homogenitzar completament dues vegades, després es va centrifugar a 200 g durant 6 min. El sobrenedant es va afegir amb un 20 x 20 per cent de PVP i es va centrifugar a 300 g durant 6 min. El sobrenedant resultant es va centrifugar a 12,000 g durant 6 min i es van recollir pellets cel·lulars. Els pellets de cèl·lules es van rentar amb PBS i després es van tornar a suspendre en 300 µl de lisats I (150 mM NaCl, 100 mM EDTA · Na2 · 2H2., pH 8, 0). La suspensió es va barrejar amb una solució de lisozima de 100 µg (100 mg/ml) i 20 µl de RNasa 1 per cent, banyada a 37 ºC durant 30 min, després es va afegir 300 µl de lisat II (NaCl 100 mM, base Tris 500 mM), pH 8. . La suspensió cel·lular es va barrejar suaument amb 50 x 20 per cent de SDS, banyada amb gel durant 5 min. A continuació, es va purificar l'ADN mitjançant extracció seqüencial amb un 1% de PVP, fenol equilibrat amb Tris i alcohol cloroform-isoamílic (vol/vol/vol/vol, 3,125:25:24:1) i alcohol cloroform-isoamílic (vol/vol, 24). : 1) seguit de precipitació a -20ºC durant 2 h amb dos volums d'etanol i 50 [il 3 M NaAc. L'ADN es va recollir per centrifugació, es va assecar a l'aire i es va dissoldre en 100 il·l d'aigua desionitzada estèril. La puresa de l'àcid nucleic es va provar amb un espectrofotòmetre NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Estats Units). A continuació, l'ADN genòmic total es va sotmetre a una amplificació per PCR utilitzant cebadors específics de les regions V3-V4 del gen de l'ARNr 16S: cebador directe 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') i cebador invers 806R (5 '-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3'). Els amplicons de PCR es van purificar amb perles Agencourt AMPure (Beckman Coulter, Indianapolis, IN, Estats Units) i es van quantificar mitjançant el kit d'assaig dsDNA PicoGreen (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estats Units). Després del pas de quantificació individual, els amplicons es van agrupar en quantitats iguals i es va realitzar una seqüenciació de 2 x 300 pb de parell mitjançant la plataforma Illumina MiSeq amb MiSeq Reagent Kit v3 a Shanghai Personal Biotechnology Co., Ltd (Xangai, Xina). Les lectures d'extrem aparellat es van reunir mitjançant el programari FLASH (versió 1.2.7), les lectures de seqüències en brut es van retallar de qualitat mitjançant el programari QIIME (versió 1.8.0) per eliminar codis de barres i seqüències no coincidents per sota dels llindars de longitud. Després, les seqüències filtrades es van agrupar en unitats taxonòmices operatives (OTU) amb un llindar del 97 per cent de similitud de seqüències mitjançant QIIME amb UCLUST. La diversitat beta es va realitzar a QIIME per a l'anàlisi de coordenades principals UniFrac ponderada (PCoA). Finalment, es va utilitzar el programari Meta stats per comparar les diferències en la composició taxonòmica microbiana intestinal entre diferents grups.

Anàlisi de la concentració de SCFA

La concentració de SCFA (incloent acetat, propionat, butirat, isobutirat, àcid valeric, àcid isovalèric i àcid hexanoic) en mostres fecals de rata es va determinar mitjançant un cromatògraf de gasos GC{{0}} (Shimadzu, Japó), equipat amb una columna DB-FFAP (30 mx 0,25 mm x {{10}},25 cm, Agilent, Estats Units). Es van preparar solucions estàndard d'acetat, propionat, butirat, isobutirat, àcid valeric, àcid isovalèric i àcid hexanoic a 1, 0.4, 0.2, 0.1, {{ 21}}.05, 0,01 i 0,005 mg/ml amb èter (incloent 2- àcid metil valeric 0,1 mg/ml com a estàndard intern), respectivament. Cada mostra fecal (0,2 g) es va barrejar amb 0,8 ml d'aigua desionitzada mitjançant vòrtex i centrifugació a 5,000 rpm durant 20 min a 4OC, es van afegir 450 il de sobrenedant amb 50 il 50 per cent d'H2SO4 i 500 il d'estàndard intern. solució, agitant-se amb vòrtex durant 1 min i centrifugant a 12,000 rpm durant 10 min, després la mescla es va col·locar a 4ºC durant 30 min. El sobrenedant es va prendre per a l'anàlisi GC. L'anàlisi dels SCFA es va dur a terme tal com es va descriure anteriorment (Wang et al., 2016).

Anàlisi estadística

Totes les dades es van presentar com a mitjans 土 SEM. L'anàlisi estadística es va realitzar mitjançant el programari SPSS 21.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, Estats Units) amb un ANOVA unidireccional seguit de la prova de Dunnett o la prova t de Student. Les dades es van excloure de les anàlisis si són superiors a dues desviacions estàndard de la mitjana. Els valors de p < 0,05="" es="" van="" considerar="" estadísticament="" significatius.="" l'anàlisi="" de="" correlació="" de="" pearson="" es="" va="" utilitzar="" per="" avaluar="" l'associació="" entre="" l'abundància="" relativa="" de="" microbiota="" intestinal,="" scfa,="" nivells="" d'hipocamp="" 5-ht,="" ne="" i="" bdnf="" i="" colon="">

Cistanchepot millorar la immunitat i reduir la pressió arterial

RESULTATS

Anàlisi de la composició química del CTE

La composició química del CTE es va analitzar per primera vegada de manera exhaustiva. Tal com es mostra a la taula 1, els PhG eren el component principal del CTE, amb un contingut relatiu del 48,6%, els iridoides i glicòsids iridoides eren el 6,9% i els sacàrids totals el 20,0%. Aquests

A continuació, es van caracteritzar els components de CTE mitjançant UPLC-Q-TOF-MS. Es van detectar i identificar un total de 27 constituents, inclosos 20 constituents de PhG, cinc iridoides i glicòsids iridoides i dos oligosacàrids. La informació detallada, inclòs el temps de retenció, la precisió de MS i els ions de fragments MS/MS, es mostra a la informació de suport (taula complementària S2). El cromatograma d'ions totals (TIC) UPLC-Q-TOF-MS de CTE es mostra a la figura complementària S3.

CTE va millorar els comportaments depressius en rates CUS

A les rates CUS, el temps total d'immobilitat a la FST i la latència per menjar en NSFT es va reduir significativament pel tractament CTE, i es va augmentar la preferència de sacarosa en SPT i la distància total coberta en OFT.

La figura 1A il·lustra els efectes aguts de CTE sobre el temps d'immobilitat en FST en rates CUS. En comparació amb el grup del model CUS, l'administració oral aguda de 3- dies de CTE va reduir significativament el temps total d'immobilitat en FST [ANOVA unidireccional, F(3,26)=4.983, p {{7} }.007]. Una anàlisi posthoc posterior va revelar aquesta administració

TAULA 1|La composició química de l'extracte de C. tubulosa. de CTE amb el grup de dosis altes (prova de Dunnett, p < 0.0="" 5)="" i="" el="" grup="" de="" dosis="" baixes="" (prova="" de="" dunnett,="" p="">< 0,05)="" va="" mostrar="" una="" reducció="" marcada="" de="" el="" temps="" total="" d'immobilitat="" al="">

A la figura 1B es mostren els efectes de CTE sobre la preferència de sacarosa en SPT en rates CUS. El procediment d'estrès de vint-i-vuit dies va provocar una disminució significativa de la preferència de la sacarosa en el grup del model CUS en comparació amb les rates control no estressades [ANOVA unidireccional, F(4,34)=3.993, p {{8 }}.{{10}}09; prova de Dunnett, p <0,05], que="" indica="" que="" el="" model="" cus="" es="" va="" desenvolupar="" amb="" èxit.="" com="" a="" control="" positiu,="" el="" grup="" flx="" va="" augmentar="" significativament="" la="" preferència="" de="" sacarosa="" en="" rates="" cus="" [anova="" unidireccional,="" f(4,34)="3.993," p="0.009;" prova="" de="" dunnett,="" p=""><0,05], que="" demostra="" la="" validesa="" predictiva="" del="" model="" cus.="" l'administració="" oral="" crònica="" de="" cte="" en="" el="" grup="" de="" dosis="" altes="" va="" mostrar="" efectes="" clau="" sobre="" la="" preferència="" de="" sacarosa="" [anova="" unidireccional,="" f(4,34)="3.993," p="0.009;" prova="" de="" dunnett,="" p=""><0,01], que="" la="" va="" restaurar="" als="" nivells="" normals="" en="" rates="" cus.="" la="" cte="" amb="" el="" grup="" de="" dosis="" baixes="" va="" mostrar="" una="" tendència="" creixent,="" però="" l'efecte="" no="" va="" ser="" estadísticament="" significatiu="" (prova="" de="" dunnett,="" p="">

Tal com es mostra a la figura 1C, la distància total coberta a OFT també es va utilitzar per avaluar els efectes de CTE en rates CUS. En comparació amb les rates sense estrès, el grup del model CUS va manifestar una distància total molt més curta [ANOVA unidireccional, F(4,34)=7.845, p=0.0{{ 19}01; La prova de Dunnett, p <0,001] després="" d'una="" 4-setmana="" d'exposició="" a="" cus,="" i="" el="" tractament="" amb="" control="" positiu="" amb="" flx="" van="" augmentar="" la="" distància="" total="" en="" rates="" cus="" [anova="" unidireccional,="" f(4,34)="7,845," p="0,0001;" prova="" de="" dunnett,="" p="">< 0,05].="" l'administració="" oral="" diària="" de="" cte="" amb="" dosis="" altes="" i="" dosis="" baixes="" va="" mostrar="" un="" efecte="" evident="" sobre="" la="" distància="" total="" en="" rates="" cus="" [anova="" unidireccional,="" f(4,34)="7.845," p="0.0001" ;="" prova="" de="" dunnett,="" p=""><0,01 per="" al="" grup="" de="" dosis="" altes,="" p=""><0,001 per="" al="" grup="" de="" dosis="" baixes,="" respectivament].="" la="" figura="" suplementària="" s4="" mostra="" el="" mapa="" de="" seguiment="" d'activitats="" a="">

La figura 1D mostra els efectes del CTE sobre la latència per menjar a la NSFT en rates CUS. El procediment d'estrès de vint-i-vuit dies va provocar un augment significatiu de la latència per començar a menjar al grup del model CUS en comparació amb les rates de control no estressades [ANOVA unidireccional, F(4,33)=3.434, p { {8}}.{{10}}19; prova de Dunnett, p <0,05], que="" indica="" que="" el="" model="" cus="" es="" va="" desenvolupar="" amb="" èxit.="" l'administració="" oral="" a="" llarg="" termini="" de="" cte="" amb="" una="" dosi="" alta="" va="" mostrar="" efectes="" evidents="" sobre="" la="" latència="" per="" començar="" a="" menjar="" en="" comparació="" amb="" el="" grup="" cus="" (test="" t="" de="" student,="" t="2.759," p=""><0.05), mentre="" que="" una="" dosi="" baixa="" de="" cte="" va="" mostrar="" cap="">

CTE va restaurar el nivell de neurotransmissors i factors neurotròfics en rates CUS

Els efectes de la CTE sobre els nivells de {{{{10}}}}HT i NE a l'hipocamp de rates CUS es mostren a les figures 2A, B. El procediment d'estrès de quatre setmanes va provocar una reducció significativa de 5-HT [ANOVA unidireccional, F(4,34)=17.13, p=0.0001; prova de Dunnett, p < 0,001]="" i="" ne="" [anova="" unidireccional,="" f(4,34)="6,376," p="0,0006;" la="" prova="" de="" dunnett,="" p="">< 0,001]="" concentració="" a="" l'hipocamp="" de="" rates="" cus="" en="" comparació="" amb="" la="" del="" grup="" control,="" i="" l'antidepressiu="" flx="" va="" restaurar="" significativament="" els="" nivells="" de="" 5-ht="" a="" l'hipocamp="" [anova="" unidireccional,="" f(4,34)="" {="" {25}}.13,="" p="0.0001;" prova="" de="" dunnett,="" p="">< 0,001].="" després="" de="" l'administració="" oral="" de="" cte="" al="" grup="" de="" dosis="" altes,="" es="" va="" observar="" un="" augment="" significatiu="" del="" nivell="" de="" 5-ht="">

ANOVA, F(4,34)=17.13, p=0.0001; prova de Dunnett, p < 0.001]="" mentre="" que="" les="" concentracions="" de="" ne="" no="" es="" van="" modificar.="" de="" la="" mateixa="" manera,="" l'expressió="" de="" bdnf="" es="" va="" reduir="" significativament="" al="" grup="" del="" model="" cus="" en="" comparació="" amb="" les="" rates="" no="" estressades="" (test="" t="" de="" student,="" t="4.171," p=""><0,01) (figura="" 2c).="" tant="" l'administració="" oral="" a="" llarg="" termini="" de="" cte="" amb="" dosis="" altes="" (test="" t="" de="" student,="" t="2,548," p=""><0,05) com="" flx="" (test="" t="" de="" student,="" t="2,263," p=""><0,05). )="" va="" augmentar="" l'expressió="" de="" bdnf="" en="" comparació="" amb="" el="" grup="" de="" models="" cus.="" cte="" amb="" dosis="" baixes="" no="" va="" mostrar="" cap="" efecte="" significatiu="" sobre="" l'expressió="" de="">

El nivell de {{0}}HT al còlon de les rates CUS era diferent del de l'hipocamp, i el procediment d'estrès 4-setmana no va tenir cap impacte en el colon 5-HT (figura 2D). ). Per contra, l'administració oral de CTE amb dosis altes va estimular els nivells de 5-HT al còlon en comparació amb el grup del model CUS (test t de Student, t=2,173, p <0,05). la="" cte="" amb="" una="" dosi="" baixa="" no="" va="" mostrar="" cap="" efecte="" sobre="" el="" nivell="" 5-ht="" de="">

El CTE va regular la composició microbiana intestinal de les rates CUS

L'efecte de CTE sobre la composició microbiana intestinal de rates CUS es va avaluar mitjançant el mètode basat en la seqüenciació del gen rRNA 16S. Es va trobar que 28 dies d'administració oral de CTE van alterar la composició microbiana intestinal de les rates CUS i van afectar diversos

nivells taxonòmics microbians entre grups de rates (nivell de classe 1, nivell d'ordre 1, nivell de família 1, nivell de gènere 8 i nivell d'espècie 2). Això suggereix que la comunitat microbiana intestinal podria tenir un paper en els efectes antidepressius de la CTE. A la taula 2 es mostra informació detallada dels tàxons microbians intestinals significativament alterats a diferents nivells taxonòmics.

La seqüenciació de MiSeq va produir un total de 2.132.980 lectures en brut, seguint el control de qualitat, la eliminació de sorolls i el procés d'eliminació de la quimera. A continuació, les lectures es van agrupar en OTU, que es van assignar a tàxons des del fílum fins a nivell d'espècie. L'estudi de l'anàlisi de la diversitat beta es va realitzar per explorar la similitud dels patrons de comunitats bacterianes entre els cinc grups de rates. La PCoA basada en les distàncies UniFrac ponderades de la microbiota intestinal dels cinc grups de rates d'estudi es mostra a la figura 3A. L'anàlisi de diversitat beta per PCoA va mostrar una clara separació de la comunitat microbiana del grup control i del grup model CUS, mentre que el grup CTE amb dosis altes va tendir a estar més a prop del grup control en comparació amb el grup CUS.

Metastatic analysis was used to investigate the differences in gut microbial taxonomic composition among different groups. At the phylum level, the most dominant microbial taxa in the five rat groups were Firmicutes and Bacteroidetes (Figure 3B). Lactobacillus, Ruminococcus, Blautia, Bacteroides, and Prevotella were the most highly abundant microbial taxa at the genus level (Figure 3C). The two dominant phyla, Firmicutes and Bacteroidetes, accounted for a combined relative abundance of >90 per cent. Tal com es mostra a les figures complementàries S5A, B, el procediment d'estrès de 4 setmanes va provocar una tendència no significativa cap a un augment del nivell de Firmicutes i una disminució no significativa de Bacteroidetes al grup del model CUS en comparació amb el grup control. Després de l'administració diària de CTE amb dosis altes i dosis baixes, l'abundància relativa de Firmicutes i Bacteroidetes va tornar a nivells similars del grup control, encara que sense significació estadística. I tot i que es van observar canvis similars per a la relació Firmicutes/Bacteroidetes entre els grups de rates, no es van mostrar diferències estadístiques (figura suplementària S5C). Es va trobar una tendència no significativa cap a una disminució del nivell de cianobacteris phyla al grup del model CUS en comparació amb les rates de control no estressades; mentre que l'administració de CTE amb una dosi elevada va donar lloc a un augment significatiu de l'abundància relativa de cianobacteris en comparació amb el grup CUS (figura suplementària S5D).

A nivell de gènere, Bacteroides i Ruminococcus eren dos dels tàxons microbians més abundants que representaven aproximadament un 30 per cent d'abundància relativa en els cinc grups de rates. El procediment d'estrès de quatre setmanes va provocar una reducció significativa de l'abundància relativa de Bacteroides i un augment significatiu de Ruminococcus al grup del model CUS en comparació amb les rates de control no estressades (figures 4A, B). L'administració a llarg termini de CTE va provocar un augment significatiu de l'abundància de Bacteroides, així com una disminució significativa de Ruminococcus en comparació amb les rates CUS. A més, sis gèneres de Parabacteroides, Butyricimonas, Deinococcus, Weissella, Trichococcus i Brachybacterium van mostrar diferències estadísticament significatives entre el grup model CUS i el grup control (figures 4C-H). Després de 28 dies de tractament de CTE, l'abundància relativa dels sis gèneres esmentats anteriorment es va canviar respectivament a nivells similars al grup control.

Es va detectar una baixa abundància de Deinococcus a diferents nivells taxonòmics, incloent el nivell de classe (Deinococcus), el nivell d'ordre (Deinococcales), el nivell familiar (Deinococcaceae) i el nivell de gènere (Deinococcus) al grup de rates CUS, mentre que no es va detectar en el control. grup i els grups d'administració (figures 5A-D).

A nivell d'espècie, Weissella beninensis va ser molt inferior al grup CUS que al grup control, i es va observar un augment significatiu de l'abundància relativa després de l'administració de CTE amb una dosi elevada (figura 5E). Per contra, l'administració de CTE va revertir l'augment significatiu de l'abundància relativa del conglomerat de Brachybacterium observat a les rates CUS (figura 5F).

SCFA modulats CTE en rates CUS

Les concentracions de SCFA (incloent acetat, propionat, butirat, isobutirat, àcid valeric, àcid isovalèric i àcid hexanoic) en mostres fecals de rata es van analitzar per GC i es mostren a la figura 6. Els nivells d'acetat [ANOVA unidireccional, F( 4,32)=2.721, p=0.0467; prova de Dunnett, p <0.05] i="" àcid="" hexanoic="" [anova="" unidireccional,="" f(4,30)="3.028," p="" {{15="" }}.0328;="" la="" prova="" de="" dunnett,="" p=""><0, 05]="" va="" augmentar="" significativament="" a="" les="" rates="" del="" grup="" model="" cus="" en="" comparació="" amb="" el="" grup="" control.="" després="" de="" l'administració="" a="" llarg="" termini="" de="" cte="" amb="" dosis="" altes,="" acetat="" (test="" t="" de="" student,="" t="2,182," p=""><0,05) i="" àcid="" hexanoic="" [anova="" unidireccional,="" f(4,30)="3" .028,="" pàg="0.0328;" les="" concentracions="" de="" la="" prova="" de="" dunnett,="" p=""><0, 05]="" es="" van="" reduir="" predominantment="" en="" comparació="" amb="" el="" grup="" cus,="" cosa="" que="" indica="" que="" cte="" podria="" exercir="" la="" seva="" activitat="" antidepressiva="" mitjançant="" la="" modulació="" dels="" scfa="" del="" metabòlit="" neuroactiu="" desordenat.="" l'administració="" de="" cte="" amb="" un="" grup="" de="" dosis="" baixes="" va="" mostrar="" una="" tendència="" a="" la="" disminució,="" però="" cap="" efecte="" notable="" sobre="" les="" concentracions="" d'acetat="" i="" àcid="">

Anàlisi de correlació de la microbiota intestinal, neurotransmissors i neurotrofines a l'hipocamp, 5-HT al còlon i SCFA

Per explorar la relació funcional de la microbiota intestinal alterada a nivell de gènere, neurotransmissors i neurotrofines canviats a l'hipocamp i el còlon i la concentració pertorbadora de SCFA, es van desenvolupar coeficients de correlació de Pearson (Meng et al., 2017). Les correlacions entre ells (r > 0.4 o r < -0.4,="" p="">< 0.05)="" es="" mostren="" a="" la="" figura="" 7.="" els="" coeficients="" van="" indicar="" fortes="" correlacions="" entre="" la="" composició="" alterada="" de="" la="" microbiota="" intestinal="" a="" nivell="" de="" gènere,="" la="" concentració="" de="" set="" tipus="" de="" scfa="" i="" neurotransmissors="" de="" monoamines="" relacionats="" amb="" la="" depressió="" (5-ht="" i="" ne).="" l'abundància="" de="" ruminococcus="" va="" mostrar="" una="" correlació="" negativa="" significativa="" amb="" una="" concentració="" de="" 5-ht="" a="" l'hipocamp,="" la="" qual="" cosa="" significa="" que="" el="" procediment="" cus="" condueix="" a="" un="" augment="" de="" l'abundància="" relativa="" de="" ruminococcus="" i="" un="" decrement="" de="" les="" concentracions="" de="" 5-ht.="" després="" del="" tractament="" amb="" cte,="" l'abundància="" relativa="" de="" ruminococcus="" es="" va="" reduir="" al="" nivell="" del="" grup="" control="" i="" es="" va="" trobar="" que="" els="" nivells="" de="" 5-ht="" havien="" millorat.="" a="" més,="" l'abundància="" relativa="" de="" bacteroides="" es="" va="" correlacionar="" positivament="" amb="" un="" nivell="" de="" 5-ht="" a="" l'hipocamp="" i="" associada="" negativament="" amb="" la="" concentració="" de="" butirat,="" isobutirat,="" àcid="" valeric,="" àcid="" isovalèric="" i="" àcid="" hexanoic;="" l'abundància="" de="" parabacteroides="" va="" mostrar="" una="" correlació="" positiva="" significativa="" amb="" un="" nivell="" de="" 5-ht="" a="" l'hipocamp="" i="" la="" concentració="" de="" propionat,="" mentre="" que="" va="" mostrar="" una="" correlació="" negativa="" amb="" les="" concentracions="" d'isobutirat="" i="" àcid="" isovalèric;="" també="" es="" va="" observar="" una="" associació="" significativament="" positiva="" entre="" l'abundància="" relativa="" de="" butyricimonas="" i="" el="" nivell="" de="" ne="" a="" l'hipocamp,="" i="" l'abundància="" relativa="" de="" deinococcus="" es="" va="" correlacionar="" positivament="" amb="" la="" concentració="" d'acetat.="" això="" va="" demostrar="" que="" la="" cte="" podria="" exercir="" la="" seva="" activitat="" antidepressiva="" canviant="" la="" composició="" de="" la="" microbiota="" intestinal,="" alterant="" els="" nivells="" de="" neurotransmissors="" de="" l'hipocamp="" i="" restaurant="" els="" metabòlits="" neuroactius="" scfa.="" les="" dades="" detallades="" de="" l'anàlisi="" de="" correlació="" es="" mostren="" a="" la="" taula="" complementària="">