Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Imane Bensaada, Blaise Robin3,Joeille Perez, Yann Salemkour, Anna Chipont, Marine Camus, Mathilde Lemoine, Lea Guyonnet, Helene Lazareth, Emmanuel Letavernier, Carole Henique, Pierre-Louis Tharaux i Olivia Lenoir

'Université de Paris, PARCC, Inserm, París, França; i Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cite, París, França

El fort valor predictiu de la proteinúria en les glomerulopaties cròniques està fermament establert, així com el paper patogènic de l'angiotensina ll que promou la progressió de la malaltia glomerular amb una barrera de filtració glomerular alterada, lesió dels podòcits i cicatrització dels glomèruls. Aquí vam trobar que la hipertensió crònica induïda per l'angiotensina Il inhibia el flux d'autofàgia als glomèruls del ratolí. La supressió d'Atg5 (un gen que codifica una proteïna implicada en l'autofàgia) específicament al podòcit va donar lloc a una podocitopatia accelerada induïda per l'angiotensina I, una albuminúria accentuada i una glomeruloesclerosi. Això indica que l'autofàgia és un mecanisme protector clau en el podòcit en aquesta condició. L'activitat de la calpaïna induïda per l'angiotensina Il als podòcits inhibeix el flux d'autofàgia. Els podòcits de ratolins amb expressió transgènica de l'inhibidor endògen de la calpaïna calpastatina mostraven una autofàgia de podòcits més alta a la línia de base que era resistent a la inhibició depenent de l'angiotensina Il. A més, l'autofàgia sostinguda amb calpastatina limitava el dany dels podòcits i l'albuminúria. Aquestes troballes suggereixen que la hipertensió té efectes patògens sobre l'estructura i la funció glomerular, en part a través de l'activació de calpains que condueix al bloqueig de l'autofàgia dels podòcits. Aquestes troballes descobreixen un mecanisme original pel qual la hipertensió mediada per l'angiotensina Il inhibeix l'autofàgia mitjançant el reclutament de calpaina induït pel calci amb conseqüències patògenes en cas de desequilibri per l'activitat de la calpastatina. Així, prevenir una disminució de l'autofàgia mediada per la calpaina pot ser una nova estratègia terapèutica prometedora per a les nefropaties associades a una alta activitat del sistema renina-angiotensina.

Cistanchedeserticola prevéronyómalaltia

Declaració translacional

Donat el paper crucial de l'autofàgia en el desenvolupament deronyómalalties, la modulació farmacològica de l'autofàgia podria ser una estratègia prometedora per a la prevenció i el tractament de diverses malalties renals. Paral·lelament, es va trobar que la sobreactivació de l'activitat de la calpaïna en els podòcits té efectes perjudicials en la funció dels podòcits, mentre que no es van identificar els seus mecanismes d'acció nocius. Aquí, proporcionem proves que la calpaina vincula l'acció perjudicial de l'angiotensina Il amb el bloqueig perjudicial de l'autofàgia en els podòcits i suggereix que la inhibició de la calpaïna podria ser un objectiu terapèutic prometedor per a les malalties dels podòcits parcialment mitjançant el manteniment de l'autofàgia dels podòcits.

La hipertensió és la segona, després de la diabetis, com a principal causa de progressiócrònicaronyómalaltia-i fins i tot una elevació modesta de la pressió arterial és un factor de risc independent per a la malaltia renal en fase terminal. Un nombre creixent d'estudis experimentals han posat de manifest la importància dels podòcits en el desenvolupament deronyólesió. La pèrdua progressiva de podòcits i les alteracions microvasculars apareixen precoçment amb la disminució funcional del ronyó en la nefropatia hipertensiva experimental. En pacients, es va demostrar que l'excreció urinària de podòcits viables era un marcador sensible i específic per a la preeclampsia, i els pacients amb nefrosclerosi tenien una densitat de podòcits glomerulars significativament menor que els donants de ronyó. A més, el paper patogènic de l'angiotensina II (Angel) que promou la progressió de la malaltia glomerular està ben establert, no només en condicions hipertensives sinó també en diverses malalties glomerulars.

La hipertensió glomerular provoca un estirament capil·lar glomerular, dany endotelial i una filtració elevada de proteïnes glomerulars que provoca col·lapse glomerular i glomeruloesclerosi. També exerceix una acció directa sobre les estructures glomerulars, provocant respostes reguladores de senyalització destinades a compensar. Un sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAAS) sistèmic i local activat fomenta la hiperplàsia mesangial i la síntesi de factors de permeabilitat vascular. Simultàniament, els podòcits mostren senyals de calci i modifiquen la seva forma amb el receptor AnglI tipus 1 (AT1)-28Aquests mecanismes adaptatius que depenen de l'estimulació.24-28 es tornen inadaptats a llarg termini, i finalment condueixen a la glomeruloesclerosi. AT1 media la implicació destacada del RAAS per a la pressió arterial i l'homeòstasi de l'aigua i la sal. Els inhibidors de l'enzim convertidor d'angiotensina i els bloquejadors AT1 s'utilitzen clínicament per al tractament de la hipertensió i la insuficiència cardíaca en pacients. Curiosament, ambdós bloquejadors també mostren un efecte protectorronyófunció.

S'ha demostrat que l'autofàgia és essencial per al manteniment de l'homeòstasi cel·lular, especialment en els postmitòtics i sobretot en els podòcits.1- L'autofàgia és un sistema de degradació associat a cl9olisosomals per a proteïnes citoplasmàtiques de llarga vida i orgànuls disfuncionals55 i implica el segrest de proteïnes i orgànuls. en autofagosomes. La formació d'autofagosomes depèn de la inducció de diversos gens, inclosos Mapllc3a/b, Berlin 1 i Atgs. Hi ha proves creixents que la desregulació de la via autofàgica està implicada en la patogènesi deronyóenvelliment i diversosronyómalalties com la lesió renal aguda, la malaltia renal poliquística, l'envelliment i la nefropatia diabètica.

La regulació de l'autofàgia en podòcits, fisiològica i, sobretot, en un context patològic, és poc coneguda. Recentment hem demostrat que l'autofàgia dels podòcits és independent de l'objectiu mecanicista de la regulació de la rapamicina (mTOR) en condicions fisiològiques, fent d'aquest tipus de cèl·lules una excepció. L'activació d'AT1 estimula la síntesi de proteïnes i el recanvi de proteïnes a les cèl·lules. Així, vam raonar que l'activació del RAAS també pot influir en l'estimulació de la rotació de proteïnes i la proteòstasi.

En el present estudi, ens hem centrat en el paper de la senyalització AnglI en la regulació de l'autofàgia dels podòcits. Es van identificar les proteases calpaïnes activades per calci que mediaven un efecte de bloqueig crònic d'AnlI sobre l'autofàgia dels podòcits. A més, vam trobar que l'inhibidor endògen de la calpaïna, la calpastatina, era capaç de prevenir la inhibició de l'autofàgia depenent d'AnI i la lesió dels podòcits durant la hipertensió.

Aquestes troballes descobreixen un mecanisme original pel qual la hipertensió mediada per AnglI inhibeix l'autofàgia mitjançant el reclutament de calpaina induït pel calci amb conseqüències patògenes en cas de desequilibri per l'activitat de la calpastatina.

MÈTODES

Animals

Els ratolins transgènics de calpastatina (CST18) van ser amablement proporcionats pel Dr. E. Letavernier. Els ratolins amb una interrupció específica del podòcit de l'Atg5) es van generar tal com es va descriure anteriorment (Nphs2.cre Atg5'o encreuant ratolins Nphs2.cre amb Ag5lxlomice5 al fons C57BL6/J. Nphs2.cre Atg5'oxlox ratolins i controlen els mascles de camada). En aquest estudi es van utilitzar , d'entre 10 i 12 setmanes. El model hipertensiu es va induir per infusió sc d'Angli (Sigma-Aldrich, A9525) a una dosi d'1 ug/kg/min durant 4 a 6 setmanes mitjançant minibombes osmòtiques (Alzet Corp, model 2006). Es van implantar bombes a l'esquena entre els omòplats i els malucs. Els ratolins van rebre suplements de sal (3 per cent de NaCl) als aliments. Es van utilitzar ratolins Atgsloxilox (de tipus salvatge [WT]) com a controls en tots els estudis. Per a la sal d'acetat de desoxicorticosterona (DOCA) amb el model de reducció de nefrona, els ratolins mascles adults es van sotmetre a una nefrectomia esquerra unilateral. Dues setmanes després de la nefrectomia, van rebre pastilles de DOCA amb el llançament de 21-dia (Innovative Research of America) implantat sc Es va implantar un segon pellet 3 setmanes després del primer implant.Tots els ratolins es van tornar va rebre un 0,9 per cent de NaCl a l'aigua potable ad libitum i es van matar després de 6 setmanes d'administració de DOC.6 Els experiments es van dur a terme d'acord amb les directrius veterinàries franceses i les formulades per la Comunitat Europea per a l'ús d'animals d'experimentació (L358-86/609EEC) i van ser aprovats pel Ministeri de Recerca francès i el comitè d'ètica de la recerca de la universitat local (APAFIS-7646 i -22373).

Experiment de cultiu primari de podòcits

Els podòcits primaris diferenciats es van cultivar tal com es va descriure anteriorment./En breu, l'escorça renal acabada d'aïllar es va barrejar i digerir per col·lagenasa I (Gibco, {{0}}) al Roswell Park Memorial Institute 1640 (Life Technologies,{{2} }}). A continuació, els teixits es van passar per coladors cel·lulars de 70 μm i 40 μm (BD Falcon, 352340 i 352350). Els glomèruls, que s'adhereixen al colador de cèl·lules de 40 um, es van eliminar amb solució salina tamponada amb fosfat (PBS; Life Technologies, 10010023) més un 0,5 per cent d'albúmina sèrica bovina (Eurobio, HALALB07-65) injectada a pressió i després es van rentar dues vegades. en PBS. Els glomèruls acabats d'aïllar es van placar en 6-plats de pou a Roswell Park Memorial Institute 1640 (Gibco, 61870036) complementats amb un 10% de sèrum fetal de vedella i un 1% de penicil·lina/estreptomicina (Life Technologies, 15140122) per permetre que els podòcits surtin dels glòmers. i créixer. L'enriquiment dels podòcits es va verificar mitjançant l'anàlisi Western blot com anteriorment (figura suplementària S1). Els podòcits es van cultivar en absència o presència de bafilomicina Al (100 nmol/, Sigma-Aldrich, B1793) durant 4 hores. Per als experiments d'immunofluorescència, els podòcits primaris es van xapar en etiquetes de 4 plats (Dutcher, 055071). Els podòcits es van fixar en paraformaldehid al 4% durant 10 minuts i es van processar per a la immunofluorescència.

Assaig d'activitat de Calpain

L'activitat intracel·lular de la calpaïna es va determinar en podòcits primaris, tal com es va descriure anteriorment. Es van cultivar un total de 100000 cèl·lules en 24-plats de cultiu de teixits de pou al Roswell Park Memorial Institute 1640 complementades amb un 10% de sèrum fetal de vedella i un 1% de penicil·lina/estreptomicina. Després del període de cultiu indicat, el medi es va substituir per una solució de bicarbonat HEPES (KRH) de Krebs-Ringer (pH 7,4) que contenia 4 mM de CaCl2, amb o sense inhibidor de calpaïna 10 uM-1, i es va incubar durant 10 minuts abans de l'addició. de substrat de calpaïna 50 mM N-succinil-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amino-4-metilcumarina (Sigma-Aldrich, S6510). Després d'un 90-període d'incubació de minut, es va determinar l'activitat del cal-dolor com la diferència entre la fluorescència (mesurada a 360 nm d'excitació i 430 nm d'emissió) amb i sense inhibidor de calpaïna-1.

Western blot

Els podòcits primaris es van ratllar amb 80 ul de tampó d'assaig de radioimmunoprecipitació que contenia fosfatasa i inhibidor de proteasa. La concentració de proteïnes es va mesurar amb el kit d'assaig de proteïnes BCA (Merck Biochemistry, 71285). Es van electroforitzar vint micrograms de proteïnes en gel prefabricat Criterion XT (12 per cent de Bis-Tris, Bio-Rad, 3450124). Les proteïnes es van transferir a la membrana de difluorur de polivinilidè (Thermo Fischer Scientific, 88518). Després de bloquejar el 5% de llet en Tris Buffer Saline 0,1% Tween (TBS-T), les membranes es van incubar amb anti-LC3 policlonal de conill (1:1000, Cell Signaling Technology, 2575), anti-ATG5 policlonal de conill. (1:2000, Cell Signaling Technology, 2630), anti-sequestosoma policlonal de conillet d'Índies 1 (SQSTM1)/P62 (1:10.000, PROGEN, GP62), domini policlonal de conill 1 anticalpaïna IV (1:1000, Abcam, ab39170 ), conill policlonal anti-calpaina 2 amino-terminal final del domini I (1:1000, Abcam, ab39165), ratolí monoclonal IgG1 anti-calpaina 4 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, sc-32325), conill antipodocina (1:1000, Abcam, ab50339), anticossos antinefrina de conillet d'índies (1:500, PROGEN, GP-N2) i anticòs monoclonal antitubulina de rata (1:5000, Abcam, ab6160). Després del rentat, les membranes es van incubar amb anticossos lligats a la peroxidasa de rave picant (1:2000, Cell Signaling Technology, 7074,7076,7077). La detecció de senyals específics es va realitzar mitjançant el kit quimioluminiscent ECL (Bio-Rad, 170-5070) en un dispositiu LAS 4000 (Fuji). Per a la quantificació es va utilitzar l'anàlisi de densitometria amb el programari ImageJ (Instituts Nacionals de Salut).

Mesures de pressió arterial i valoracions fisiològiques

La pressió arterial sistòlica dels ratolins es va registrar mitjançant el mètode del puny de la cua (Visitech Systems Inc., BP-2000). Es van prendre deu mesures de cada ratolí i després es va determinar un valor mitjà. La pressió arterial sistòlica es va mesurar al principi (12 setmanes d'edat) i després setmanalment fins al final del període de tractament. Tots els ratolins es van col·locar en gàbies metabòliques amb accés lliure a l'aigua durant una recollida d'orina de 6-hores. Les concentracions de creatinina urinària i urea plasmàtica es van analitzar espectrofotomètricament mitjançant un mètode colorimètric (Olympus, AU400). L'excreció d'albúmina urinària es va mesurar mitjançant un assaig immunoabsorbent lligat a enzims específics per a la determinació quantitativa de l'albúmina a l'orina del ratolí (Crystal Chem, 80630).

Histologia

Els ronyons es van recol·lectar i es van fixar en formalina tamponada amb PBS al 4%. Les seccions incrustades en parafina (3-um gruixudes) es van tacar amb el tricrom de Masson per avaluar la morfologia renal. Les anomalies als ronyons es van classificar en funció de la presència i la gravetat de les anomalies dels components, com ara la glomeruloesclerosi, l'expansió mesangial, l'atròfia o els guisos tubulars i la fibrosi. La proporció de glomèruls escleròtics es va avaluar mitjançant un examen cec d'almenys 50 glomèruls per secció de ronyó.

Tinció d'immunofluorescència de seccions de ronyó i podòcits primaris

Els podòcits primaris fixos es van bloquejar en TBS-T al 3% d'albúmina sèrica bovina i es van incubar durant la nit a 4 graus amb anticossos primaris de conillet d'índies anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C) i conill anti-verd proteïna fluorescent (GFP; 1:500, Abcam, ab290). Després dels esbandits de TBS-T, anticossos secundaris conjugats amb fluoròfors d'ase anti-conill d'Índies IgG AF594-anticossos conjugats (Jackson ImmunoResearch,{706-585-148) i anticossos conjugats de ruc anti-conill IgG AF{488-( Es va aplicar Invitrogen, A21206). Les imatges es van prendre amb un microscopi fluorescent Zeiss 2, una càmera AxioCam HRc i el programari Axiovision 4.3.

Per als ronyons incrustats en parafina fixats en formalina (FFPE), es van desparafinar i hidratar seccions (3 um) i es va realitzar la recuperació d'antigen en tampó de citrat escalfat (pH 6). A continuació, es van permeabilitzar les seccions amb Triton 0, 1 per cent (Euromedex) i es van bloquejar en TBS-T3 per cent d'albúmina sèrica bovina abans de la incubació d'anticossos durant la nit a 4 graus. Hem utilitzat antinefrina de cabra (1:100, PROGEN, GP-N2), conillet d'índies anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C), conill anti-GFP (1:1000, Abcam, ab290), anticòs anti-Podocalyxin de cabra (PODXL; 1:1000, Bio-Techne, AF-1556) i anticòs anti-Wilm's Tumor 1 (WT1; 1:100, Abcam, ab192). Els anticossos secundaris eren els anticossos conjugats Alexa 488- i Alexa 568-d'Invitrogen. Els nuclis es van tenyir de blau amb Hoechst. Les diapositives es van muntar amb un mitjà de muntatge fluorescent (Dako, S3023). Les microfotografies es van fer amb un fotomicroscopi Zeiss Axiophot i el programari Axiovision. Es van utilitzar quantificacions semiautomàtiques a Fiji per a quantificacions de nefrina positiva i PODXL més àrees per secció glomerular en almenys 30 glomèruls per ratolí. El nombre de podòcits es va comptar com el nombre de WT1 més nuclis per secció glomerular en almenys 30 glomèruls per ratolí.

Procediment de microscòpia electrònica de transmissió

Petits trossos de l'escorça renal (1 mm) es van fixar en un grau EM de glutaraldehid al 3 per cent (ciències de la microscòpia electrònica) durant 1 a 3 0 dies i es van rentar tres vegades en PBS. Les mostres es van fixar posteriorment en tetròxid d'osmi a l'1 per cent 0, 1 M (Electron Microscopy Science) en 0, 1 M PBS (pH 7, 4) i es van rentar amb aigua. Les mostres es van deshidratar en graus d'alcohol i òxid de propilè al 100% (ciència de microscòpia electrònica). La infiltració de resina es va realitzar de la següent manera: barrejar Epikote 812 i òxid de propilè en una proporció d'1:1 durant 30 minuts, seguit de barrejar Epikote 812 i òxid de propilè en una proporció d'1:2 a temperatura ambient durant la nit. Les mostres es van incrustar en càpsules de gelatina de 4 mm en Epikote 812 al 100% i es van polimeritzar en un forn escalfat a 60 graus C. Es van tallar seccions ultrafines amb un ultramicròtom UFC7 (Leica Microsystems GmbH) i es van dipositar a Gilder Grids 200 mesh (Electron Microscopy Science). Es van tacar amb acetat d'uranil al 7% (distribució LFG) i citrat de plom de Reynold (LFG). Les mostres es van examinar al microscopi electrònic de transmissió JEM1011 (JEOL) amb la càmera CCD Orius SC1000 (Gatan), operada amb el programari Digi-talMicrograph (Gatan) per a l'adquisició.

Matriu de reacció en cadena de la polimerasa quantitativa

Els glomèruls acabats d'aïllar es van congelar en el reactiu QIAzol Lysis (Qiagen) a -80 graus. L'extracció total d'ARN mitjançant el mètode basat en fenols es va processar d'acord amb les recomanacions del fabricant. Els ADNc es van sintetitzar mitjançant el kit RT²First Strand (Qiagen, 330401) i la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) en temps real es va realitzar mitjançant una matriu personalitzada de PCR RT²Profiler （ Qiagen, CLAM36771C) amb RT'SYBR Green qPCR Mastermix (Qiagen, 330502). Les plaques quantitatives de PCR es van executar en un ciclador StepOnePlus Applied Bio-systems. Cada matriu conté control de qualitat per a l'eficiència de la transcripció inversa i la contaminació de l'ADN genòmic. L'anàlisi quantitativa de PCR es va realitzar mitjançant el mètode 2-△△CT amb l'ajuda del Centre d'anàlisi de dades GeneGlobe (www.Qiagen.com/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page) i expressat com el canvi del plec Log2 en l'expressió gènica.

Anàlisi proteòmica in silico

La predicció in silico del lloc d'escissió de la calpaina es va fer amb DeepCalpain (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php), GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org) i CaMPDB (http:// calpain.org/)eines en línia. La seqüència d'aminoàcids de la proteïna del ratolí es va obtenir d'Uniprot (https://www.uniprot.org). Els resultats es resumeixen a les taules complementàries S1 i S2.

Anàlisis estadístics

Tots els gràfics representen valors individuals i mitjana ± SEM. Les anàlisis estadístiques es van realitzar mitjançant el programari GraphPad Prism, versió 9. La comparació entre 2 grups es va realitzar mitjançant una prova t de Student paramètrica quan les mostres passaven les proves de normalitat d'Anderson-Darling i D'Agostino i la prova F d'igualtat de variància. En cas contrari, es va utilitzar una prova de Mann-Whitney no paramètrica. La comparació entre diversos grups es va realitzar mitjançant l'anàlisi de la variància 1-manera o 2-manera seguida d'una prova de comparació múltiple amb la correcció de Sidak. Valors de P<0.05 were="" considered="" significant.=""><><><>

Figura 1| L'angiotensina I (Àngel) més la hipertensió induïda per la dieta alta en sal (HSD) inhibeix l'autofàgia glomerular. (AC)

Immunofluorescència de Podocalyxin (PODXL; vermell) i P62 (verd) en glomèruls (a, a') de ratolins de tipus salvatge (WT), (b, B) de ratolins WT després de 6 setmanes d'Angel més HSD i (c) de ratolins Nphs2.cre Atgsl/ox que mostren l'acumulació de P62 en podòcits durant la hipertensió i en ratolins amb deficiència d'ATG5-podòcits específics. Les puntes de fletxa indiquen P62 més punts en WT a (a'). Els nuclis es van tacar amb Hoechst (blau). Les subparts de la figura amb primer indiquen un augment més elevat. Barres =50 μm. （d）La quantificació associada del P62 plus s'expressa com el percentatge de l'àrea glomerular.n =4 ratolins WT i n=5 WT amb Angel més HSD i Nphs2.cre ratolins Atgsoxlo. Els valors es presenten com a diagrames individuals i la mitjana ± SEM. Prova de Mann-Whitney:*P= 0.0159.

L'àngel més la hipertensió induïda per la dieta alta en sal van inhibir l'autofàgia dels podòcits

Els podòcits presenten un alt nivell d'autofàgia in vivo, tal com mostra una forta expressió de GFP en ratolins transgènics amb fusió de GFP a LC3 (ratolins GFP-LC3), un marcador clau de l'autofàgia (figura suplementària S2A). L'autofàgia és un procés dinàmic amb formació constant d'autofagosomes i degradació d'autofagolisosomes. El bloqueig de la degradació autofagosòmica amb cloroquina va donar lloc a l'acumulació de GFP més punts, cosa que indica un alt flux autofàgic als podòcits (figures suplementàries S2A i B). La confirmació que els punts GFP més eren autofagosomes es va demostrar mitjançant una doble immunofluorescència per a GFP i SQSTM1/P62, una proteïna de chaperona degradada per autofàgia (figura suplementària S2C i D). De nou, el tractament amb cloroquina va induir l'acumulació de GFP més P62 més punts, demostrant un flux autofàgic important als podòcits. Finalment, es va conservar un alt flux autofàgic in vitro, tal com es mostra amb l'expressió GFP i P62 en podòcits primaris aïllats de ratolins GFP-LC3 i una forta acumulació de punts GFP plus i P62 plus sota tractament amb bafilomicina Al, un altre bloquejador de la degradació autofagosòmica (figura suplementària S2E-). H).

A continuació, es va avaluar la capacitat de la hipertensió per modular les respostes autofàgiques dels podòcits en ratolins infusionats amb AngII amb una dieta alta en sal (HSD) durant 6 setmanes i en controls no hipertensos. Tal com es mostra a la figura l, AnglI més HSD van induir l'acumulació de P62 als glomèruls amb una forta acumulació en podòcits, cosa que suggereix que Angl més HSD era responsable del bloqueig de l'autofàgia dels podòcits (Figura terra). Curiosament, l'acumulació de P62 als podòcits va ser similar a l'observada en ratolins amb deficiència d'autofàgia de podòcits (ratolins Nphs2.cre Atg5'olox). En un altre model d'hipertensió, el model DOCA-sal, també vam observar una acumulació progressiva de P62 en podòcits al llarg del curs temporal de la malaltia (figura suplementària S3).

La supressió d'Atg5 específicament als podòcits provoca un augment de l'albuminúria, pèrdua de podòcits i lesió glomerular en el model Angel plus HSD

A continuació, vam examinar si el bloqueig de l'autofàgia només en podòcits (ratolins Nphs2.cre Atg5laxlox) afecta la lesió glomerular en el model AnglI plus HSD. Primer vam confirmar que Nphs2. Els ratolins cre Atg5 tenien pressió arterial normal, funció renal normal i sense lesions histològiques glomerulars fins als 10 mesos d'edat, tal com es va informar anteriorment (lox suplementari (WT) i Nphs2.cre Atgslox Figura S4). AngII amb HSD durant 6 setmanes. És important destacar que la pressió arterial sistòlica va ser similar als 2 grups després de la infusió d'Angli durant l'estudi (figura 2a), tot i que el mètode del puny de la cua utilitzat per mesurar la pressió arterial podria no tenir la capacitat de resoldre petites diferències de pressió arterial. La infusió d'angl amb HSD va augmentar notablement la proporció d'albúmina urinària a creatinina en ratolins WT, i aquest efecte es va augmentar encara més significativament en els ratolins (figura 2b). Els ratolins hipertensos Nphs2.cre Atg5lox/lox Nphs2.cre Atgsoxlox també van mostrar un augment significatiu de l'esclerosi glomerular en comparació amb els companys WT (figura 2c-e). D'acord amb la proteinúria mesurada, els motlles proteïnes i la dilatació tubular eren significativament més freqüents en ratolins amb deficiència de podòcits a ATG5 (figura 2f-h).

El nombre de podòcits per glomèrul va disminuir significativament a Nphs2.cre Atg5loxlox (figura 2i-k). La lesió de podòcits en ratolins Nphs2.cre Atgsoxlo amb infusió d'AngII més HSD fins i tot va progressar cap a la glomeruloesclerosi focal i segmentària, tal com es mostra amb l'expressió de la cèl·lula epitelial parietal (PEC). ) marcador d'activació CD44 als glomèruls (figura 2l i m). L'anàlisi de microscòpia electrònica va identificar canvis significatius associats a la deficiència d'ATG5 després de la infusió crònica d'AngII amb HSD, inclosa l'esborrament del procés del peu en... ratolins. Per contra, pocs Nphs ultrahipertensius. Es van trobar defectes estructurals d'Atg5'oxlx en podòcits de ratolins WT fins i tot després de 10 setmanes d'infusió d'AngII amb HSD (figura 2n i o), cosa que indica que l'activitat autofàgica dels podòcits és necessària per a la seva resistència a l'Angel més el dany induït per HSD. En conjunt, els nostres resultats van indicar que en el model AnglIl plus HSD, la inhibició de l'autofàgia agreuja la lesió i la pèrdua dels podòcits i indueix una glomeruloesclerosi focal i segmentària posterior.

Figura 2|La supressió d'Atg5 específicament als podòcits provoca un augment significatiu de l'albuminúria, lesions renals i pèrdua de podòcits després de 6 setmanes d'infusió d'angiotensina Il(Angel) més dieta alta en sal (HSD). ( a ) Pressió arterial sistòlica en ratolins Atgslo/b i Nphs2.cre Ataslo durant 36 dies de ratolins Angel més HSD.n =9 per genotip. Els valors es presenten com a mitjana ± SEM. Anàlisi bidireccional de la variància (ANOVA): ns. En (bm), n =10 ratolins per genotip. A (b, g, h, k), els valors es presenten com a gràfics individuals i la mitjana ± SEM. (b) Àngel més HSD (continuació

Figura 3| Expressió i activitat de la calpaïna en podòcits. (a) Anàlisi Western blot de l'expressió de calpain-1.calpain-2 i calpain-4 en podòcits primaris. L'expressió de tubulina serveix com a normalització. ( b ) L'activitat de la calpaïna es va mesurar en podòcits primaris tractats o no tractats amb angiotensina ll (Angel; 100 nM) durant 24 hores amb o sense calpeptina (10 uM), n =5 experiments independents. Els valors es presenten com a diagrames individuals i la mitjana ± SEM. Anàlisi unidireccional de la variància (ANOVA): tractament, P=0.0035.Prova de comparació múltiple de Sidak:*P{=0.0128 per a Angll versus línia de base", P=0.0056 per Angll més calpeptina versus Angll. (c) L'activitat de calpaina es va mesurar en podòcits primaris de ratolins de tipus salvatge (WT) o transgènics de calpastatina (CST') tractats o no tractats amb Angel (100 nM) durant 24 hores. n {{18} } experiments independents. Els valors es presenten com a gràfics individuals i mitjana ± SEM. ANOVA bidireccional aparellat per al genotip de tractament. P= 0.0483. Prova de comparació múltiple de Sidak:**P=0.0009 per a WT Angll versus línia de base,*P=0,0420 per a CST'9 Angll versus línia de base, *P=0,0424 per a WT versus CST9 Angll.

Si us plau, feu clic aquí per a la part 2