Part 1 La malaltia renal crònica i l'envelliment disminueixen de manera diferent el material ossi i la microarquitectura en ratolins C57Bl/6

Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

La malaltia renal crònica i l'envelliment disminueixen de manera diferent el material ossi i la microarquitectura en ratolins C57Bl/6

Chelsea M. Heveran1, Charles Schurman2,*, Claire Acevedo3, Eric W. Livingston4, Danielle Howe5, Eric G. Schaible6, Heather Hunt7, Adam Rauff8, Eve Donnelly7,#, R. Dana Carpenter9, Moshe Levi10, Anthony Lau5, Ted Bateman4 , Tamara Alliston2,*, Karen B. King11, Virginia L. Ferguson1

1Departament d'Enginyeria Mecànica, Universitat de Colorado, Boulder, CO

2Departament de Cirurgia Ortopèdica, Universitat de Califòrnia, San Francisco, CA

3Departament d'Enginyeria Mecànica, Universitat d'Utah, Salt Lake City, UT

4Departament d'Enginyeria Biomèdica, Universitat de Carolina del Nord, Chapel Hill, Carolina del Nord

5Departament d'Enginyeria Biomèdica, The College of New Jersey, Ewing, NJ

6Font de llum avançada, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA

7Departament de Ciència i Enginyeria de Materials, Universitat de Cornell, Ithaca, Nova York

8Departament de Bioenginyeria, Universitat de Colorado, Denver, CO

9Departament d'Enginyeria Mecànica, Universitat de Colorado, Denver, CO

10Departament de Bioquímica i Biologia Molecular i Cel·lular, Universitat de Georgetown, Washington DC

11Departament d'Ortopèdia, Facultat de Medicina de la Universitat de Colorado, Aurora, CO *Universitat de Califòrnia Berkeley – Programa de postgrau en Bioenginyeria de la Universitat de Califòrnia San Francisco, San Francisco, CA

# Divisió de Recerca, Hospital de Cirurgia Especial, Nova York, Nova York

Cistanche pot ajudar amb la malaltia renal

Resum

La malaltia renal crònica (ERC) és una malaltia comuna de l'envelliment i augmenta el risc de fractura només amb l'edat avançada. L'envelliment i la CKD afecten de manera diferent la renovació i la mineralització òssies. Per tant, plantejam la hipòtesi que la pèrdua de qualitat òssia seria més gran amb la combinació d'edat avançada i ERC. Es va avaluar l'os dels ratolins C57Bl/6 d'adults joves (6 mesos), de mitjana edat (18 mesos) i vells (24 mesos) tres mesos després de la nefrectomia 5/6, per induir procediments de CKD o simulats. La CKD va exacerbar les pèrdues de microarquitectura cortical i trabecular associades a l'envelliment. L'envelliment i la ERC van donar lloc a escorces més primes i poroses i a menys trabècules i més primes. La qualitat del material ossi també es va reduir amb la CKD, i aquests canvis en el material ossi eren diferents dels deguts a l'edat. L'envelliment va reduir la resistència a la flexió i el mòdul de l'os sencer, el mòdul de nanoindentació a escala micromètrica i la tensió de teixit i col·lagen a escala nanomètrica (dispersió de raigs X d'angle petit (SAXS)). Per contra, la CKD va reduir el treball a la fractura i la variació en el mòdul i la composició del teixit ossi (espectroscòpia Raman) i va augmentar el percentatge de soca de col·lagen. L'augment de la càrrega de soca de col·lagen es va associar amb la pèrdua de duresa en la CKD. A més, les llacunes d'osteòcits es van fer més petites, més disperses i més desordenades amb l'edat per als ratolins Sham, però aquests canvis relacionats amb l'edat no es van observar clarament en la CKD. Tanmateix, per a la CKD, les llacunes més grans es correlacionen positivament amb l'augment dels nivells de fosfat sèric, cosa que suggereix que els osteòcits tenen un paper en l'homeòstasi mineral sistèmica. Aquest treball demostra que la CKD redueix la qualitat òssia, incloses la microarquitectura i les propietats del material ossi, i que la pèrdua de qualitat òssia amb l'edat s'agreuja amb la CKD. Aquestes troballes poden ajudar a conciliar per què la massa òssia no prediu de manera consistent la fractura a la població de CKD, així com per què les persones grans amb CKD tenen un alt risc de fragilitat.

Paraules clau: ERC; envelliment; qualitat òssia; fragilitat òssia; col·lagen

1. Introducció

La malaltia renal crònica (ERC) afecta entre el 23 i el 36% de la població d'edat avançada i s'associa amb un major risc de fractura i mortalitat relacionada amb fractures (1,2). Tot i que la pèrdua de massa òssia (mesurada per absorciometria de raigs X d'energia dual) prediu fractures futures en totes les etapes de l'ERC, les persones grans amb massa òssia baixa i ERC tenen més probabilitats de fracturar-se en comparació amb aquelles amb massa òssia baixa i ronyó sans. funció (3). El risc de fractura òssia s'incrementa generalment amb la CKD per sobre dels efectes de l'envelliment (4,5). Per exemple, en un estudi de tres anys, els individus d'entre 40 i 65 anys amb ERC de moderada a terminal van tenir un augment de la prevalença de fractures entre 1,7 i 5,1 vegades en comparació amb els controls de l'edat, mentre que per als més de 65 anys, la CKD va continuar augmentant la incidència. de fractura 1,8 – 4,3 vegades sobre els controls (4).

microarquitectura de l'os trabecular (10, 13), mentre que altres no informen cap canvi en comparació amb el control (9). Tot i que aquests estudis varien en l'espècie i la soca dels rosegadors, el mètode d'inducció de la CKD i els resultats mesurats, aquests treballs previs proporcionen proves substancials que la CKD altera la qualitat òssia.

Queden diverses preguntes clau sobre com la CKD disminueix la qualitat òssia, fins a quin punt la disminució de la qualitat òssia es deu a defectes en la fase mineral vs orgànica, així com sobre com els canvis en la qualitat òssia influeixen en la pèrdua de duresa del teixit ossi. En particular, tot i que alguns estudis han identificat canvis en els enllaços de col·lagen i la maduresa dels teixits (és a dir, el temps des de la formació òssia) en la CKD, es desconeix si les interaccions a nanoescala de les fibres de col·lagen durant la càrrega mecànica es veuen alterades per la CKD i si aquests canvis en la nanomecànica influeixen en el conjunt. -duresa òssia (11, 12). De manera més àmplia, encara no s'ha informat d'una avaluació dels canvis en la qualitat i la mecànica òssia en resposta a la CKD des d'escales de longitud nano fins a l'os sencer.

El paper de l'osteòcit a l'hora d'influir en la qualitat òssia en la CKD i l'envelliment també és incert. Aquestes cèl·lules es comporten de manera anormal augmentant substancialment l'expressió de FGF23 al principi de la progressió de la CKD (7, 14). L'osteòcit és essencial per mantenir la qualitat del material ossi i per regular la resistència a la fractura òssia (15-17). La salut dels osteòcits està indicada, en part, per la morfologia lacunar. Les morfologies lacunars dels osteòcits es veuen alterades quan l'osteòcit participa en l'homeòstasi mineral, com en la lactància (18, 19) i la hipofosfatèmia lligada a X (20). Les geometries lacunars també poden esdevenir més petites, més disperses i més desordenades tant amb l'envelliment com amb el desús (21–23). Els canvis en la morfologia lacunar dels osteòcits amb CKD tenen el potencial d'afectar les soques del teixit ossi, la integritat estructural i la mecanosensibilitat dels osteòcits (24). Encara no se sap si la CKD afecta les morfologies lacunars dels osteòcits i si aquesta relació pot canviar amb l'envelliment.

Tot i que les poblacions d'ERC més freqüents inclouen adults grans, encara s'han d'explorar els efectes combinats de l'envelliment i la CKD sobre la qualitat òssia. El treball anterior ha establert que l'envelliment disminueix el mòdul, la força i el treball de l'os sencer per fracturar-se a la flexió (25), la duresa a la fractura (26), la microarquitectura òssia cortical i trabecular (27-29) i augmenta el contingut i la maduresa de minerals (30, 31). Aquests canvis a l'os amb l'envelliment són confusos i es produeixen en múltiples escales de longitud, amb la mecànica de l'os sencer influenciada pels canvis en el material del teixit ossi, així com en l'estructura. Els canvis relacionats amb l'edat en el material ossi i el volum ossi estan en part influenciats per la disminució de la rotació del teixit ossi (és a dir, una major maduresa del teixit) i un balanç negatiu a la unitat multicel·lular òssia, respectivament (30,32). Aquests canvis relacionats amb l'edat contrasten amb la renovació òssia anormal i la mineralització que sovint es produeix amb la CKD. La pèrdua de microarquitectura està relacionada amb un balanç negatiu, que s'espera amb l'envelliment i que es pot produir en la CKD (9, 10, 13). No obstant això, la maduresa dels teixits augmenta amb l'envelliment i disminueix en el context d'ERC d'alta rotació. Hi ha llacunes substancials a l'hora d'entendre les bases de la fragilitat òssia en la ERC, així com com l'envelliment i la ERC, quan es combinen, redueixen la qualitat òssia i la resistència a la fractura. Elucidar els efectes combinats de l'envelliment i la CKD sobre la qualitat òssia ompliria aquests buits de coneixement.

L'objectiu d'aquest estudi va ser investigar les influències combinades de l'envelliment i la CKD sobre la qualitat òssia, des d'escales de longitud de nano-a través d'os sencers, en un model quirúrgic de CKD en ratolins envellits. Vam plantejar la hipòtesi que la CKD i l'envelliment redueixen la qualitat òssia, però que aquests dos factors influirien de manera diferent i negativa en les propietats del material del teixit ossi. A més, vam plantejar la hipòtesi que els efectes combinats de la vellesa i la CKD són els més perjudicials per a la qualitat òssia. Per avaluar aquestes hipòtesis, es va avaluar la qualitat òssia, inclosa la microarquitectura cortical i trabecular i les propietats del material ossi cortical, en adults joves a través de ratolins vells amb ERC induïda per nefrectomia 5/6 (5/6 Nx) o cirurgies de simulació.

Sobre cistanche

2. Mètodes

2.1 Model animal i preparació de mostres

Els ratolins mascles C57Bl/6 es van obtenir d'una colònia de l'Institut Nacional d'envelliment als 3, 15 i 21 mesos. Els ratolins es van mantenir en un cicle de 12-h llum / 12-h fosc, allotjats individualment en gàbies de policarbonat amb roba de llit estàndard, alimentats amb Harlan Teklad 2920X Chow i van permetre l'accés lliure a l'aigua. Per a cadascuna de les tres edats, els ratolins van ser assignats aleatòriament a grups CKD o Sham. El grup d'ERC es va sotmetre a una nefrectomia en dues etapes. Aquests procediments es van descriure anteriorment (33). Breument, es va accedir al ronyó esquerre mitjançant una incisió de la línia mitjana, es va decapsular per evitar danys a l'urètre i les glàndules suprarenals, i després es va retirar. Una setmana després, es va decapsular el ronyó dret i es van resecar parcialment els pols superior i inferior per aconseguir una reducció de 2/3 del volum del ronyó. El grup de control va rebre procediments simulats (és a dir, una incisió de la línia mitjana sense danys als ronyons) en el mateix període de temps. Els ratolins van ser anestesiats amb un 1,5 per cent d'isoflurà durant els procediments. Es va administrar una dosi postoperatòria de buprenorfina (0,5 mg/kg) després d'aquests procediments i abans de la recuperació, així com cada 12 hores durant els dos dies següents. Els ratolins van ser sacrificats després de tres mesos mitjançant CO2 i luxació cervical. Al punt final de l'estudi, els ratolins eren 6 (adult jove; simulador: n=6, ERC: n=7), 18 (edat mitjana; simulador: n=8; ERC: n=8 {25}}) i 24 (antic; Sham: n=8; CKD: n=8) mesos d'edat. Tots els procediments amb animals van ser aprovats pel Comitè Institucional d'Ús i Cura d'Animals de la Universitat de Colorado Denver.

El fèmur esquerre, la tíbia, l'húmer, el radi i el cúbit es van reservar per a anàlisis de qualitat òssia. La tíbia esquerra es va conservar en etanol al 70 per cent a 4 graus C. Tots els altres ossos es van embolicar amb una gasa humitejada amb fosfat i es van emmagatzemar a -20 graus C fins a l'anàlisi.

2.2 Química sèrica i orina

Es van realitzar anàlisis de bioquímica sèrica a la sang i l'orina recollides al punt final de l'estudi. La urea sèrica i l'orina, així com les concentracions sèriques de fosfat, calci i PTH, es van mesurar segons les indicacions del fabricant (BioAssays Systems i Immunotropics, respectivament).

2.3 microCT

Es va avaluar la microarquitectura per a l'os cortical del fèmur mitjà i l'os trabecular de la tíbia proximal mitjançant microCT per a tots els ratolins d'estudi (μCT, Scanco 80, Scanco AG, Basserdorf, Suïssa). Els fèmurs es van descongelar durant la nit a 4 graus C abans de l'exploració. L'escaneig es va realitzar amb una mida de voxel de 10 µm, seguint els mètodes d'adquisició i anàlisi descrits anteriorment (10). Els paràmetres corticals inclouen volum ossi / volum total (BV/TV), àrea òssia / àrea total (BA/TA), porositat cortical (Ct. Po), gruix cortical (Ct. Th), densitat mineral total (TMD), un moment d'inèrcia sobre l'eix medial-lateral (IML), la distància entre el centroide i la superfície òssia en la direcció anterior-posterior (C) i el moment polar d'inèrcia (pMOI) (34). Els paràmetres trabeculars inclouen nombre trabecular (Tb.N), espai trabecular (Tb.Sp), gruix trabecular (Tb.Th), volum ossi (BV), volum total (TV), volum ossi / volum total (BV/TV), densitat mineral òssia volumètrica (vBMD) i densitat de connectivitat (Conn.D). Després de la microCT, els fèmurs es van tornar a embolicar amb gasa humitejada amb fosfat i es van emmagatzemar a -20 graus C per a la posterior caracterització mecànica de l'os sencer.

2.4 Propietats mecàniques i materials de l'os sencer

Després del microCT, els fèmurs esquerres van patir una flexió de tres punts (Insight II Material Testing System, cèl·lula de càrrega de 250 N, MTS Systems Corporation, Eden Prairie MN). Els fèmurs es van treure de la gasa humitejada amb solució salina tamponada amb fosfat i es van provar fins a fallar amb una velocitat de deflexió de 5 mm/min en una enclusa personalitzada amb un abast de 8 mm. Les corbes de càrrega-desplaçament es van analitzar per a les propietats mecàniques que inclouen rigidesa, càrrega màxima, desplaçament a la càrrega màxima, energia a càrrega màxima, càrrega al rendiment, desplaçament al rendiment, energia al rendiment, desplaçament després del rendiment, càrrega a la fractura, desplaçament a la fractura, i energia a la fractura. El punt de fluència es va definir com la intersecció d'una línia secant dibuixada amb una reducció del pendent del 10 per cent de la rigidesa tangent inicial i la corba de càrrega-desplaçament. Utilitzant IML i C de µCT, vam estimar les propietats del material incloent el mòdul de flexió, la tensió de fluència, l'esforç final i la tenacitat a partir de les dades de flexió de tres punts mitjançant equacions estàndard de flexió del feix aplicades al fèmur del ratolí (35).

2.5 Anàlisi d'elements finits de la rigidesa de la tíbia proximal

Per investigar el comportament mecànic de l'os, es va utilitzar el modelatge computacional d'elements finits (FE) per simular la compressió axial de la tíbia proximal en cada model. La tíbia proximal es va escollir perquè la tíbia és una estructura de càrrega en ratolins i és un lloc comú d'anàlisi de les propietats òssies mitjançant microCT. Les dades d'imatge MicroCT de la tíbia proximal (os cortical i trabecular) es van exportar com a rodanxes d'imatge DICOM de 16-bits per a una segmentació i construcció addicionals dels models d'elements finits específics del tema. Les dades d'imatge DICOM es van importar a Mimics Innovation Suite 18 (Materialise, Leuven, Bèlgica) per al processament i la segmentació d'imatges per crear un model FE corresponent per a la mateixa regió de tíbia proximal de l'os analitzat amb microCT. El teixit ossi es va separar d'altres teixits de la imatge mitjançant un llindar de segmentació de 313 mg/cm3 (36,37). Un cop segmentada la regió òssia, es va exportar la malla FE específica del tema, que contenia tant els compartiments corticals com trabeculars. El model FE va utilitzar una malla FE hexaèdrica amb una mida d'element isòtrop de 10 µm.

Les malles FE exportades des de Mimics es van importar a ABAQUS CAE 6.9 per a l'assignació de propietats del material, aplicació de condicions de límit i simulació de càrrega mecànica axial. Es va especificar que les propietats del material de l'os fossin homogènies, isòtropes i elàstiques lineals (Mòdul de Young, E= 10 GPa i relació de Poisson, v= 0.3). Per simular la compressió axial, es va aplicar una condició de límit fixa als nodes de la superfície inferior de l'os i es va aplicar un desplaçament cap avall de 5 μm (0,5 per cent de l'alçada del segment ossi) als nodes de la superfície superior de l'os. La rigidesa estructural òssia es va calcular com la força de reacció (N) sobre el desplaçament aplicat.

2.6 Dispersió de raigs X en petit angle

La deformació de la fibril·la de col·lagen durant les proves de tensió uniaxial de cubits i radis combinats es va mesurar mitjançant la dispersió de raigs X d'angle petit de sincrotró (SAXS) a la línia de llum 7.3.3 a la font de llum avançada (LBNL, Berkeley, CA) (38). Els ossos es van assegurar amb cola i paper de vidre entre les pinces als seus extrems distals i proximals. Les proves insitutensiles es van realitzar amb una etapa de prova de tracció TST350 (Linkam Scientific Inc.) en mostres hidratades a una velocitat de desplaçament de 2,5 µm/s. Durant la prova, la diàfisi òssia es va exposar a raigs X d'10 keV durant 0,1 s cada 5 s. La radiació total es va limitar a 30 kGy per mitigar qualsevol efecte de l'exposició sobre el rendiment mecànic (39). L'espaiat del col·lagen, representatiu de les regions de buits repetits dins de la superestructura del col·lagen, apareix com un pic de difracció de Bragg destacat en el patró SAXS. La deformació específica del col·lagen durant les proves de tracció es va mesurar mitjançant el seguiment del canvi de les posicions del pic de Bragg a quantitats creixents de càrrega. Utilitzant un programa LabVIEW personalitzat, aquest canvi progressiu en el patró de dispersió es va convertir en una soca de fibril·la de col·lagen normalitzant-se a l'espai d a càrregues zero, tal com es va comentar anteriorment (40). L'estrès del teixit es va calcular a partir de les forces registrades a l'etapa de prova dividides per les mesures de l'àrea de la secció transversal dels ossos provats. Les àrees de secció transversal sumades del cúbit i el radi es van mesurar des del punt mitjà de la longitud cubital mitjançant imatges reflectants de camp clar (Leica DM, objectiu 20x) i es van quantificar amb ImageJ (41). Les soques de teixit ossi sencer es van obtenir amb un paquet MATLAB personalitzat de correlació d'imatges digitals (DIC) que va fer un seguiment i mesurar les distàncies entre una graella de punts superposats a l'exemplar d'os durant les proves. Les soques DIC obtingudes es van combinar amb tensions a nivell de teixit per generar corbes de tensió-tensió estàndard. El mòdul elàstic lineal es va extreure d'aquestes corbes, així com la tensió de rendiment i la tensió de rendiment tal com es defineix pel punt de rendiment compensat del 0,2 per cent. La soca del teixit es va combinar en el temps amb les soques de col·lagen de SAXS a rendiment i tensió màxima per tal de produir comparacions de components que suporten l'estrès amb l'os durant la deformació.

L'anàlisi controlada del compost cúbit/radi durant la prova de tracció es va realitzar fent coincidir la soca a nivell de teixit de les imatges de la càmera digital amb les soques calculades a partir dels patrons de dispersió de raigs X. Els vídeos digitals van ser revisats de manera independent per dos observadors entrenats per a la fractura i el lliscament de teixit (p. ex., lliscament entre el cúbit i el radi). Aquests esdeveniments es van combinar en temps amb les corbes de tensió i totes les dades de tensió-tensió es van truncar a la primera fractura. En l'anàlisi només es van tenir en compte les dades fins a la primera fractura. Es van excloure els exemplars si hi havia un lliscament entre les pinces de tracció i els ossos, o si hi havia lliscament entre el radi que es produïa abans de la primera fractura. També es van excloure els exemplars si hi havia una correspondència deficient entre el teixit i les corbes de tensió SAXS, cosa que indica que el punt del feix es va centrar en el cúbit, però la majoria de la soca es va transferir al radi.

2.7 Avaluació de la composició i del mòdul del teixit ossi a microescala

Després de la flexió de tres punts, els fèmurs es van deshidratar histològicament en una sèrie graduada d'etanol, es van netejar en acetona i es van incrustar en PMMA. Els ossos incrustats es van seccionar a l'eix mitjà femoral mitjançant una serra de diamant de baixa velocitat (Isomet, Buehler, Lake Bluff, IL). Les mostres es van triturar amb paper de carbur de silici humit (60{{10}} i 1200 gra), i després es van polir amb pastes d'alúmina (9, 5, 3, 1, 0,1, 0,05 µm) i roba fina de Rayon (South Bay Technologies, San Clemente, CA) amb un acabat final de 0,05 µm. Les mostres es van sonicar entre cada pas de polit.

L'espectroscòpia Raman es va realitzar en mapes que abasten el gruix cortical amb un sistema personalitzat: un sistema de microscòpia confocal Renishaw inVia (Renishaw, Wotton-under-Edge, Gloucestershire, Regne Unit) utilitzant llum làser de 785 nm de longitud d'ona que es va encaminar a través de cables de fibra òptica a un 5{ Objectiu {4}}x (NA 0,75) muntat en una etapa Z de nanoindentador (TI 950, Hysitron, Minneapolis, MN). Per a cada ubicació, es van recollir 10 acumulacions d'exposicions de 10-segons. Fileres de tres sagnies separades 15 µm s'estenen cada 10 µm pel gruix cortical.

La línia de base fluorescent es va restar amb un ajustament polinomial d'ordre 11 i es van eliminar els raigs còsmics mitjançant el programari Renishaw WIRE. Es va restar un espectre de PMMA de referència de cada punt mitjançant codi MATLAB personalitzat. A continuació, es van analitzar aquests espectres corregits per a prolina (855 cm−1), ν1 fosfat (961 cm−1) i ν1 carbonat (1071 cm−1). A continuació, es van calcular les proporcions d'àrea per a mineral: matriu (fosfat: prolina),

carbonat: fosfat i cristal·linitat (inversa de la mitja amplada a una alçada màxima completa del pic de fosfat v1).

A continuació, es va realitzar la nanoindentació en llocs coincidents amb els llocs avaluats amb espectroscòpia Raman. Una punta esfèrica de 5 µm va sagnar l'os a 30 nm/s fins que es va obtenir una profunditat màxima de 500 nm. Aquesta profunditat es va mantenir durant 120 s per permetre la dissipació de l'energia viscoelàstica. El mòdul reduït (Er) es va calcular mitjançant l'anàlisi d'Oliver-Pharr, tenint en compte el primer 45 per cent de la corba de descàrrega (42,43).

2.8 Cromatografia líquida d'alt rendiment

Es va disseccionar l'húmer de tot el teixit tou i es va extreure la medul·la òssia amb aigua. Els humeris van ser C i després es van centrifugar per evaporar l'excés de HCl. Les mostres filtrades es van diluir 1:5 en 10 per cent d'acetonitril i 0.05 per cent d'àcid heptafluorobutíric (HFBA), carregat en un Gemini-NX C de fase inversa{{7} } (Phenomenex, Torrance, CA) i es va analitzar per enllaços entre hidroxilisilpiridinolina (HP), lisilpiridinolina (LP) i pentosidina d'acord amb els mètodes descrits per Bank et al (44). Els detalls del sistema HPLC (model 126, Beckman-Coulter, Fullerton, CA) es descriuen extensament a Oren et al(45). La separació dels enllaços de col·lagen va implicar el protocol següent: 15 min. del dissolvent que conté 24 per cent de metanol i 0,15 per cent de HFBA, 10 min. del dissolvent que conté un 40 per cent de metanol i un 0,05 per cent de HFBA, i 10 min. del dissolvent que conté un 75 per cent d'acetonitril i un 0,1 per cent de HFBA. La columna es va equilibrar en un 24 per cent de metanol i un 0, 15 per cent d'HFBA durant almenys 10 min. entre tirades de mostra. Els pics d'enllaç de col·lagen es van mesurar amb un detector de fluorescència (FP1520, JASCO; Easton, ML). Les longituds d'ona d'excitació i emissió eren de 295 nm i 400 nm, respectivament, per a HP i LP. La pentosidina es va detectar amb una excitació de 328 nm i una emissió de 378 nm. Les corbes de calibratge es van generar a partir de les intensitats mesurades de cinc dilucions d'un calibrador que contenia HP i LP purificats (Quidel Corporation) i pentosidina (L. Sayre, Case Western Reserve University, Cleveland, OH).

Les concentracions de crosslink es van normalitzar a la concentració de col·lagen. El col·lagen es va estimar a partir de la concentració d'hidroxiprolina dins de la mostra analitzada per enllaços creuats. Una alíquota de la mostra analitzada per a enllaços es va diluir 1:50 i es va derivatitzar amb 9-cloroformiat de fluoronilmetil (46). Les solucions següents es van utilitzar per al protocol d'aminoàcids (1) àcid cítric 20 mM, clorur de tetrametilamoni 5 mM i 0,01 per cent d'azida de sodi, pH 2,85; (2) acetat de sodi 20 mM, clorur de tetrametilamoni 5 mM i azida de sodi al 0,01 per cent, pH 4,5 i (3) acetonitril al 100 per cent. El perfil d'elució del gradient és el següent: de 0 a 11,5 min. un gradient del 75 per cent (1) / 25 per cent (3) al 60 per cent (1)/40 per cent (3), als 13 min. canviar al 64 per cent (2) / 36 per cent (1), de 13,1 a 18 min. un gradient del 64 per cent (2) / 36 per cent (3) fins al 62 per cent (2) / 38 per cent (3), després als 18 min. un canvi al 25 per cent (2) / 75 per cent (3) fins al final de la prova als 23 min. La columna es va equilibrar al 75 per cent (1) / 25 per cent (3) durant almenys 10 min. entre tirades de mostra. Els pics d'aminoàcids es van controlar a 254 nm d'excitació i 630 nm d'emissió. Es va generar una corba de calibratge a partir de cinc dilucions d'un estàndard d'aminoàcids preparat a partir d'hidrolitzat de col·lagen (Sigma-Aldrich # A9531, St. Louis, Missouri). El col·lagen té una concentració constant d'hidroxiprolina, per tant la concentració d'hidroxiprolina es va convertir en una concentració de col·lagen (285 mol d'hidroxiprolina per mol de col·lagen).

2.9 Mesura d'AGEs fluorescents

Els AGE fluorescents de cada mostra es van determinar mitjançant un assaig fluoromètric que compara la fluorescència endògena a granel del teixit ossi amb un estàndard de quinina. Es va diluir una alíquota de l'os hidrolitzat resuspès amb l'estàndard intern per a HPLC amb aigua DI a una concentració d'1,6 ug de solució d'os/ml. La fluorescència de l'hidrolitzat diluït i una solució de quinina diluïda en sèrie (estoc: 10 ug de quinina/ml 0,1 N H2SO4) es va mesurar en una placa de 96-pous (Producte #3370, Corning) mitjançant un Lector de microplaques multimode (Synergy H1, BioTek) a una excitació de 360 ​​nm i una emissió de 460 nm.

Els AGE fluorescents a granel es van normalitzar al contingut de col·lagen del teixit ossi mitjançant un assaig colorimètric d'hidroxiprolina. Breument, l'hidrolitzat es va diluir encara més amb una solució d'hidroxiprolina acc μ / ed (200 µg L-hidroxiprolina/ml 0,001 N HCl). Es va afegir cloramina-T a l'hidrolitzat diluït per iniciar la reacció i les solucions es van incubar durant 20 min. a temperatura ambient. La reacció es va aturar mitjançant l'addició d'àcid perclòric 3,15 M, i després d'un 5-min. període d'incubació a temperatura ambient, es va afegir p-dimetilaminobenzaldehid. A continuació, la solució es va incubar en un bany d'aigua de 60 graus durant 20 minuts, després es va refredar en aigua freda a la foscor a temperatura ambient. L'absorbància de les mostres i estàndards es va mesurar a una longitud d'ona de 570 nm mitjançant un lector de microplaques. Els AGE fluorescents es mostren en unitats de fluorescència de quinina ng/mg de col·lagen.

2.10 3Geometries lacunars d'osteòcits

La tíbia esquerra es va deshidratar histològicament en una sèrie graduada d'etanol i es va tacar amb un 1% de fucsina bàsica (47). A continuació, es van netejar les tíbies amb acetona i es van incrustar en poli (metil) metacrilat (PMMA). Les mostres incrustades es van seccionar transversalment 1 mm proximal a la unió tíbia-peroné amb una serra de baixa velocitat (Buehler Isomet, Buehler, Lake Bluff, IL). Es va preparar una secció de terra a partir de la secció distal amb un gruix objectiu de 200 um (Exakt 400 CS, Exakt Technologies Inc, Oklahoma City, OK).

La imatge de les seccions terrestres es va realitzar en transmissió amb un microscopi d'exploració làser confocal Zeiss LSM 710, amb excitació de 555 nm, filtre de pas de banda de 568–1{000 nm i objectiu d'immersió en oli de 40x. La resolució en les direccions x, y i z va ser de 0,447 i 0,493 µm, respectivament. Les piles z verticals es van obtenir a través del rang visible de les llacunes d'osteòcits (50-100 µm de profunditat d'imatge). Les imatges 3D de les llacunes d'osteòcits es van construir i analitzar per a geometries lacunars mitjançant el programa d'anàlisi de llacunes d'osteòcits 3D de codi obert i MATLAB v17 (21). ). Breument, cada imatge 2D dins d'una pila z es va segmentar automàticament per definir les llacunes, que després es van reconstruir en 3D. A partir dels el·lipsoides que s'ajusten millor, es van analitzar les llacunes pel volum, l'àrea de superfície, el centre de massa més proper, l'esfericitat (proporció del radi lacunar més petit al més gran, on esfera 1 =), abast theta (valor absolut de la diferència de la Vector 3D que descriu la direcció de l'eix principal des de la direcció mitjana de totes les llacunes), l'oblat (−1=perfectament prolat, 1=perfectament oblat) i la densitat numèrica lacunar (nombre d'osteòcits/volum d'imatge).

2.11 Anàlisi de dades

Les dades es presenten com a mitjana ± error estàndard de la mitjana. Per a cada matriu de l'espectroscòpia Raman i la nanoindentació es va fer una mitjana de manera que cada os tingués un valor per a cada mesura a microescala. De la mateixa manera, es va calcular una desviació estàndard per a cada matriu per estimar la variabilitat espacial del teixit ossi a microescala. Els efectes de l'envelliment i la CKD, així com la seva interacció, es van provar amb ANOVA bidireccional per a tots els paràmetres. Les variables dependents es van transformar si calia per satisfer els supòsits de normalitat residual i homoscedasticitat. La importància dels efectes principals es va establir a priori a p < 0.05.="" en="" el="" cas="" d'una="" interacció="" significativa="" entre="" l'edat="" i="" la="" ckd,="" es="" van="" realitzar="" proves="" post-hoc="" per="" provar="" l'efecte="" de="" la="" ckd="" dins="" de="" cada="" edat.="" es="" va="" controlar="" un="" error="" familiar="" per="" a="" aquestes="" anàlisis="" post-hoc="" mitjançant="" l'alfa="" ajustat="" per="" bonferroni,="" que="" va="" donar="" lloc="" a="" un="" alfa="" crític="" de="" 0.05="" 3="0,017." els="" resultats,="" on="" les="" comparacions="" d'efectes="" simples="" tenien="" valors="" p="" entre="" 0,017="" i="" 0,05,="" es="" van="" interpretar="" com="" a="" no="">

Es va realitzar una regressió lineal per provar si les mesures de qualitat òssia a nanomicroescala prediuen la duresa mecànica de l'os sencer. Com que les propietats mecàniques de l'os sencer mostren una forta dependència de l'edat, aquesta regressió lineal va incloure l'edat com a covariable. També es van avaluar les correlacions de Spearman per a les geometries lacunars d'osteòcits i les mesures de la química del sèrum i l'orina, i per a la PTH i les mesures de la qualitat òssia a microescala. La importància de les regressions i correlacions lineals es va establir a p <0,05. es="" va="" utilitzar="" minitab="" (v17)="" per="" a="" totes="" les="">

Els valors atípics es van identificar mitjançant la prova de Grubbs (nivell de significació=0.05). Es van excloure diversos valors atípics de les anàlisis de calci sèric i urea. Es va excloure un valor atípic per a cada 24-mes Sham i CKD per a totes les anàlisis de microarquitectura cortical i trabecular, així com per a l'anàlisi FEA. Es va excloure un valor atípic del grup CKD de 24-mes per a l'anàlisi de LP i un valor atípic del grup Sham de 24-mes per a la tenacitat, el treball fins a la fractura i el desplaçament posterior al rendiment. Es va trobar un valor atípic de 24-mes per a la desviació estàndard del mòdul de nanoindentació i la desviació estàndard de la cristalinitat.