PART 1 Echinacoside indueix la vasorelaxació de l'artèria pulmonar de rata obrint els canals NO-cGMP-PKG-BKCa i reduint els nivells intracel·lulars de Ca2+

Com indueix l'equiinacòsid la relaxació venosa?

Xiang-Yun GAI1, 2, 3, Yu-hai WEI4, Wei ZHANG2, Ta-na WUREN2, Ya-ping WANG2, Zhan-Qiang LI2, Shou LIU2, Lan MA2, Dian-Xiang LU2, Yi ZHOU1, 2, Ri-li GE1, 2, * 1 Departament de Farmacologia, Escola de Ciències de la Vida i Biofarmacèutica, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, Xina; 2 Centre de Recerca de Medicina d'Alta Altitud, Col·legi Mèdic de la Universitat de Qinghai, Xining 810001, Xina; 3 Escola de Farmàcia, Universitat Qinghai per a nacionalitats, Xining 810007, Xina; 4 Oficina d'Inspecció i Quarantena d'Entrada i Sortida de Qinghai, Xining 810001, Xina

Apuntar:La vasoconstricció pulmonar sostinguda tal com s'experimenta a gran altitud pot conduir a la hipertensió pulmonar (PH). L'objectiu principal d'aquest estudi és investigar l'efecte vasorelaxant deequiinacòsid(ECH), un glicòsid fenitontoïdal de l'herba tibetana Lagotis brevituba Maxim iCistanche tubulosa, sobre l'artèria pulmonar i el seu mecanisme potencial.

Mètodes:Els anells arterials pulmonars obtinguts de rates Wistar masculines es van suspendre en cambres d'òrgans plenes de solució Krebs-Henseleit, i la tensió isomètrica es va mesurar mitjançant un transductor de força. Els nivells intracel·lulars de Ca2+ es van mesurar en cèl·lules musculars arterials llises pulmonars de rata cultivada (PASMCs) utilitzant Fluo 4-AM.

Resultats: ECH(30-300 μmol/L) artèries pulmonars de rata relaxada precontractades per la noradrenalina (NE) d'una manera dependent de la concentració, i aquest efecte es podria observar tant en els anells intactes d'endoteli com en els anells denudats per endoteli, però amb una resposta màxima significativament menor i una EC50 més alta en anells denudats per endoteli. Aquest efecte va ser bloquejat significativament per L-NAME, TEA i BaCl2. No obstant això, IMT, 4-AP i Gli no van inhibirECHRelaxació induïda. En condicions extracel·lulars lliures de Ca2+, la contracció màxima es va reduir al 24,54% ±2,97% i al 10,60% ±2,07% en anells tractats amb 100 i 300 μmol/L d'ECH, respectivament. En condicions d'afluència de calci extracel·lular, la contracció màxima es va reduir a 112,42% ±7,30%, 100,29% ±8,66%, i 74,74% ±4,95% en anells tractats amb 30, 100 i 300 μmol/L d'ECH, respectivament. Després que les cèl·lules es carreguessin amb Fluo 4-AM, la intensitat mitjana de fluorescència va ser menor en les cèl·lules tractades ambECH(100 μmol/L) que amb NE.

Conclusió: ECHSuprimeix la contracció induïda per NE de l'artèria pulmonar de rata mitjançant la reducció dels nivells intracel·lulars de Ca2+, i indueix la seva relaxació a través de la via NO-cGMP i l'obertura dels canals K+ (BKCa i KIR).

Paraules clau:Herba tibetana;equiinacòsid; hipertensió pulmonar; gran altitud; vasorelaxació; NO; BKCa; KIR; anell de l'artèria; cèl·lules musculars llises arterials pulmonars.

Per a més informació poseu-vos en contacte amb:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola té molts efectes, feu clic aquí per saber-ne més

Introducció

La vasoconstricció pulmonar sostinguda tal com s'experimenta a gran altitud pot conduir a hipertensió pulmonar (PH) i hipertròfia medial, que s'han identificat com la principal causa d'hipertròfia ventricular dreta i insuficiència cardíaca. Els individus que viuen a gran altitud, ja sigui temporalment o permanentment, poden presentar hipertensió pulmonar lleu a moderada, i aquells amb major susceptibilitat a la hipòxia poden haver exagerat la vasoconstricció pulmonar, donant lloc a diverses malalties de gran altitud que s'associen amb una morbiditat i mortalitat significatives, com l'edema pulmonar a gran altitud i malalties del cor.Equiinacòsid(ECH) (Figura 1) és aglicòsid fenil·lanioidees troba en una varietat d'herbes xineses com l'herba tibetana Lagotis brevituba Maxim iCistanche tubulosa[4, 5]. Lagos brevituba Maxim és una espècie de Lagotis spp pertanyent a les Scrophulariaceae i creix àmpliament a una altitud de més de 3000 metres a l'altiplà Qinghai-Tibet.ECHTé diverses característiques farmacològiques desitjables, com ara propietats de carronyeig radical antioxidant, antiinflamatori, neuroprotector, hepatoprotector i òxid nítric (NO). També pot provocar una relaxació dependent de l'endoteli en anells aòrtics toràcics de rata i curar malalties cardiovasculars. No obstant això, pel que sabem, no hi ha hagut un estudi que investigui els seus efectes sobre el to vascular en les artèries pulmonars. Els propòsits d'aquest estudi són els següents: (1) explorar si ECH indueix vasorelaxació in vitro en artèries pulmonars de rata precontractades amb noradrenalina (NE), i si aquest efecte, si n'hi ha, depèn de l'endoteli o actua directament sobre el múscul llis vascular; (2) per investigar l'efecte de l'ECH sobre l'afluència de calci extracel·lular i l'alliberament de calci intracel·lular en les cèl·lules musculars llises arterials pulmonars de rata (PASMCs); i (3) identificar possibles vies i canals K+ implicats en la relaxació induïda per ECH.

Materials i mètodes

Reactius

Peng-fei TU de la Universitat de Pequín (Pequín, Xina), amb una puresa de més del 98% determinada per la cromatografia líquida d'alt rendiment. Dimetil sulfòxid (DMSO) es va comprar a Solar Science &Technology Co, Ltd (Pequín, Xina); NE, acetilcolina (ACh, ≥99%), indometacina (IMT), Nω -Clorhidrat d'èster metil nitro-L-arginina (L-NAME), clorur de tetraetimemoni (TEA), clorur de bari (BaCl2), 4-aminopiridarina (4-AP), i glibenclamida (Gli) de Sigma Chemical Co (St Louis, MO, EUA); Dulbecco d'alta glucosa modificat eagle's medium (DMEM), sèrum boví fetal (FBS), i tripsina de Gibco BRL Co, Ltd (Gaithersburg, MD, EUA); ratolí anti-rata primària α anticòs d'actina muscular llisa (α-SMA) i anticòs secundari anti-ratolí de cabra de Boshide Biotech Co, Ltd (Wuhan, Xina); Indicadors de calci fluo (Fluo 4-AM) d'Invitrogen Corp (Carlsbad, CA, EUA); i totes les sals inorgàniques de Beijing Chemical Reagent Co, Ltd (Pequín, Xina). IMT es va dissoldre en DMSO i el 5% NaH2PO4, Gli, Fluo 4-AM, i ECH es van dissoldre en DMSO, i tots els altres reactius es van dissoldre en krebs-henseleit (KH) o solució PBS. Els experiments preliminars van mostrar que el DMSO a menys del 0,1% (v / v) no va tenir cap efecte en el desenvolupament de tensió dels anells arterials pulmonars aïllats.

Animals d'experimentació

Tots els procediments i protocols van ser aprovats pel Comitè d'Atenció i Ús d'Animals del Col·legi Mèdic de la Universitat de Qinghai. Les rates Wistar masculines, de 6 a 8 setmanes d'edat, de 250 a 300 g de pes corporal, van ser adquirides al Centre Animal de la Universitat de Lanzhou (Lanzhou, Xina) i mantingudes en una dieta estàndard de laboratori i aigua de l'aixeta ad libitum a una temperatura ambient de 22±2 ° C i humitat relativa de 45% -55% durant els experiments.

Perfusió d'artèria pulmonar in vitro

Preparació d'anells arterials pulmonars de rata

Les rates que pesaven 250-300 g van ser anestesiades per injecció intraperitoneal de pentobarbital de sodi (40 mg/kg), i després els seus cors i pulmons van ser eliminats i immersos immediatament en solució KH gelada que contenia (en mmol / L): 118 NaCl, 4,7 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgSO4·7H2O, 1,2 KH2PO4, 25 NaHCO3 i 11,1 glucosa (pH 7,4). Les artèries intrapulmonars (0,7-1,5 mm de diàmetre) es disseccionaven lliures de teixit connectiu circumdant i adventitia i després es tallaven en anells d'aproximadament 2-3 mm de longitud. Els anells van ser suspesos en cambres d'òrgans plens amb 10 ml de solució KH a 37 °C i gasejats amb 95% O2-5% CO2[8], i la tensió isomètrica es va mesurar utilitzant un transductor de força (JH-2, Space Medico-Engineering Institute, Pequín, Xina)

Avaluació de l'activitat de l'anell de vaixells i avaluació de la funció endotelial

Es va permetre que els anells dels vasos s'equilibressin durant 2 h sota una tensió basal de 400 mg, temps durant el qual es va canviar la solució KH cada 15 min; a continuació, es va afegir 1 μmol / L de NE a la cambra per avaluar l'activitat de cada anell mitjançant la detecció del percentatge de contracció. Abans i després del protocol experimental, es va mesurar el percentatge de contracció (Figures 2A i 2B). L'endoteli es va eliminar en alguns anells fregant suaument la superfície intimal amb un filferro d'acer fi, i la integritat es va avaluar qualitativament pel grau de relaxació causat per ACh (10 μmol / L) en el percentatge de to contràctil induït per NE (1 μmol / L). Si la relaxació amb ACh era superior al 80%, l'endoteli es va mantenir en bones condicions; si la relaxació era inferior al 30%, l'endoteli va ser destruït (Figura 2A i 2B).

Aïllament i cultura dels PASMCs de rata

Les artèries pulmonars distals van ser aïllades dels lòbuls pulmonars de rates, i l'endoteli i l'adventitia es van eliminar acuradament. Després que els teixits van ser picats en trossos de 2 mm, es van afegir als matràs immediatament, es van mantenir a 37 °C i 5% de CO2 en una incubadora humidificada durant aproximadament quatre hores, i després es van cultivar amb DMEM d'alta glucosa complementat amb 20% FBS, 100 U / ml de penicil·lina i 100 U / ml d'estreptomicina durant aproximadament cinc dies. La meitat dels mitjans de cultiu van ser substituïts per mitjans frescos quan van sorgir les cèl·lules. Quan les cèl·lules van arribar al 80% de confluència, es van collir amb un 0,125% de tripsina i es van sembrar als flascons (relació 1:2) que contenien DMEM d'alta glucosa complementat amb 10% FBS, 100 U / ml de penicil·lina i 100 U / ml d'estreptomicina. Les cèl·lules de tres a vuit passatges es van utilitzar per a tots els experiments.

Identificació de PASMCs per immunohistoquímica

Els PASMCs van ser positius per a la tinció immunoquímica quan es van observar característiques típiques de "turó i vall". Les cèl·lules es van sembrar en plaques de 6 pous amb cobertes de vidre. Quan les cèl·lules van arribar al 80% de confluència, es van fixar en un 4% de paraformaldehid, es van bloquejar amb un 3% de peròxid d'hidrogen durant 15 minuts i després es van incubar amb anticòs primari anti-rata de ratolí α-SMA durant la nit a 4 °C. Després de ser rentades tres vegades en PBS durant 10 min, les cèl·lules van ser incubades amb anticòs secundari anti-ratolí de cabra a temperatura ambient durant 45 min, rentades de nou tres vegades en PBS durant 10 min i visualitzades amb diaminobenzidina.

Detecció de la concentració intracel·lular de calci en PAGA de rata

Els PASMCs es van sembrar en plaques de 6 pous amb cobertes de vidre. Quan les cèl·lules van arribar al 80% de confluència, els mitjans de cultiu van ser reemplaçats per DMEM sense sèrum. Vint-i-quatre hores més tard, les cèl·lules es van carregar amb 7 μmol / L Fluo 4-AM a 37 °C durant 30 minuts en una atmosfera humidificada del 5% de CO2. El colorant residual es va rentar amb la solució de sal equilibrada (HBSS) de Hanks que conté la següent (en mmol / L): 1.26 CaCl2, 0,49 MgCl2·6H2O, 0,41 MgSO4·7H2O, 5,33 KCl, 0,44 KH2PO4, 4,17 NaHCO3, 137,93 NaCl, 0,34 Na2HPO4 i 5,56 D-Glucosa, sense fenol vermell. Les cèl·lules carregades amb Fluo 4-AM van ser exposades a una de les tres condicions de tractament: (1) el grup de control (grup amb), en el qual les cèl·lules s'incubaven amb DMEM sense sèrum; (2) el grup NE, en el qual les cèl·lules es van incubar amb DMEM lliure de sèrum complementat amb 1 μmol /L de NE durant 10 min; i (3) el grup NE+ECH (100 μmol/L) (grup NE+ECH100), en el qual les cèl·lules s'incubaven amb DMEM lliure de sèrum complementat amb 1 μmol/L de NE durant 10 min i 100 μmol/L d'ECH durant 20 min. La intensitat de fluorescència va ser observada i fotografiada per microscòpia de fluorescència (IX71, Olympus, Tòquio, Japó). Es van recollir sis camps de visió (200×) per a cada mostra. La concentració de calci intracel·lular es va quantificar mesurant la intensitat mitjana de fluorescència mitjançant el programari Image Pro-Plus 6.0.

Anàlisi estadística

Les dades es van expressar com la mitjana±SD. Quan es va avaluar una diferència adequada i significativa per la prova de Dunnett o la prova Student-Newman-Keuls per a múltiples comparacions després de l'anàlisi unireccional de la variància (ANOVA). Nivell de probabilitat de P<0.05 was="" considered="">

Resultats Efectes vasorelaxants de l'ECH sobre l'artèria pulmonar aïllada

Al començament de l'experiment, l'addició acumulada d'ECH de 30 a 300 μmol / L no va tenir cap efecte significatiu sobre la tensió basal de l'artèria pulmonar. Després que la vasoconstricció induïda per NE arribés a un altiplà, l'ECH es va afegir acumulativament (30-300 μmol/L) a l'endoteli intacte (E+, Figura 2C) o anells denudats per endoteli (E– , Figura 2C). En anells d'endoteli intactes, l'addició acumulada d'ECH va dilar els vasos d'una manera dependent de la concentració, amb un maxi-

percentatge de relaxació de la mare del 89,22% ±0,32% a 300 μmol/L i un EC50 de 51,60±0,57 μmol/L (Figura 2A i 2C). De la mateixa manera, en els anells denudats per endoteli, l'ECH també va dlatar els vasos de manera dependent de la concentració, però amb una resposta màxima significativament menor del 67,72% ±1,69% (P<0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings)="" and="" a="" higher="" ec50="" of="" 108.51±2.8="" μmol/l=""><0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings,="" figure="" 2b="" and="" 2c).="" the="" sustained="" plateau="" of="" the="" high-contraction="" percentage="" induced="" by="" ne="" (1="" μmol/l)="" after="" the="" experimental="" protocol="" indicated="" that="" the="" rings="" pretreated="" with="" ech="" (30–300="" μmol/l)="" had="" good="" activity="" (figure="" 2a="" and="">

Efectes de l'ECH sobre l'alliberament intracel·lular de calci i l'afluència de calci extracel·lular

Els anells denudats per endoteli van ser exposats a 1 μmol/L de NE fins que es va aconseguir la màxima contracció. Sota condicions extracel·lulars lliures de Ca2+, els anells es van equilibrar en la solució KH lliure de Ca2+que contenia 0,2 mmol/L d'EGTA abans de l'inici dels experiments. Després de tres rentats amb solució KH lliure de Ca2+i EGTA, els anells es van preincubar amb ECH (30, 100 i 300 μmol / L) durant 20 min i després es van tornar a exposar a 1 μmol / L de NE. Els anells produïts

contraccions no tacades que van tornar ràpidament a la línia de base, en comparació amb les contraccions inicials induïdes per NE, que van servir de referència. La contracció màxima del control va ser del 33,27% ±2,94% (Figura 3A i 3E) però es va reduir significativament al 24,54% ±2,97% i 10,60% ±2,07% en anelles pretractades amb 100 i 300 μmol/L d'ECH, respectivament (P<0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3c–3e).="" under="" extracellular="" calcium="" influx="" conditions,="" 2.5="" mmol/l="" cacl2="" was="" added="" to="" the="" chamber="" when="" the="" curve="" reached="" a="" plateau.="" the="" control="" group="" produced="" sustained="" contractions,="" with="" a="" maximum="" contraction="" of="" 139.89%±7.38%="" (figure="" 3a="" and="" 3e);="" but="" the="" maximum="" contraction="" was="" significantly="" reduced="" to="" 112.42%±7.30%,="" 100.29%±8.66%,="" and="" 74.74%±4.95%="" in="" rings="" pretreated="" with="" 30,="" 100,="" and="" 300="" μmol/l="" of="" ech,="" respectively=""><0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3b–3e).="" under="" these="" conditions,="" the="" maximal="" effect="" caused="" by="" ech="" was="" more="" pronounced="" with="" 300="" μmol/l="" than="" with="" 100="" or="" 30="" μmol/l=""><0.01 vs="" 30="" or="" 100="" μmol/l="" ech="" group).="" different="" concentrations="" of="" ech="" all="" shortened="" the="" platform="" of="" sustained="" contraction,="" which="" was="" induced="" by="" extracellular="" calcium="" influx="" at="" different="" levels="" (figure="">

Rols de diferents inhibidors en la vasorelaxació de l'artèria pulmonar induïda per ECH

Es va investigar la vasorelaxació de l'artèria pulmonar de rata induïda per ECH en presència o absència dels següents inhibidors: L-NAME (inhibidor d'eNOS), IMT (inhibidor de la ciclooxigenasa), TEA (inhibidor del canal K + activat per la gran conductància), BaCl2 (inhibidor del canal K + rectificador intern), 4-AP (inhibidor del canal K + dependent de voltatge) i Gli (inhibidor del canal K + sensible a l'ATP). Els anells es van contreure al màxim amb 1 μmol/L de NE, i després L-NAME (100 μmol/L), IMT (10 μmol/L), TEA (1 mmol/L), BaCl2 (1 mmol/L), 4-AP (1 mmol/L) o Gli (10 μmol/L), respectivament. Una vegada que es va arribar a un nou altiplà, es va afegir ECH de manera acumulativa de 30 a 300 μmol / L. Les corbes concentració-resposta en presència de diferents inhibidors es mostren a la Figura 4. L'efecte vasorelaxant de l'ECH sobre els anells arterials pulmonars contrets amb 1 μmol/L de NE va ser bloquejat significativament per L-NAME (100 μmol/L), TEA (1 mmol/L) i BaCl2 (1 mmol/L), amb relaxacions màximes del 64,41%±3,20%, 84,38% ±0,70%, i 75,27% ±0,93%, respectivament (P<0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 89.22%±0.32%),="" and="" the="" values="" of="" ec50="" were="" increased="" to="" 197.32±2.75="" μmol/l,="" 91.42±2.11="" μmol/l,="" and="" 115.49±1.75="" μmol/l,="" respectively=""><0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 51.60±0.57="" μmol/l)="" (table="" 1).="" however,="" imt="" (10="" μmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l)="" did="" not="" inhibit="" the="" ech-induced="" relaxation="" (figure="" 4="" and="" table="" 1).="" to="" validate="" the="" effects="" of="" these="" inhibitors="" on="" ech-induced="" relaxation,="" the="" rings="" precontracted="" with="" 1="" μmol/l="" of="" ne="" were="" treated="" with="" l-name="" (100="" μmol/l),="" imt="" (10="" μmol/l),="" tea="" (1="" mmol/l),="" bacl2="" (1="" mmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l).="" after="" a="" new="" plateau="" was="" reached,="" ech="" was="" added="" to="" the="" chamber="" at="" a="" single="" concentration="" of="" 300="" μmol/l="" rather="" than="" in="" a="" cumulative="" manner.="" the="" maximum="" relaxation="" was="" reduced="" to="" 56.33%±0.90%,="" 82.21%±0.92%,="" and="" 72.16%±0.76%="" following="" the="" addition="" of="" l-name,="" tea,="" and="" bacl2,="">

Identificació de trinxes PASMCs

A baixa ampliació, les cèl·lules del fus estaven densament empaquetades, i gairebé totes les cèl·lules es tenyia positivament per als PASMCs (la puresa pasmc era >95%) (Figura 6A). Els miofilaments tacats de marró es van observar clarament en el citoplasma a alta ampliació (Figura 6B).

CistancheequiinacòsidEs pot resistirapoptosi

Efecte de l'ECH sobre la concentració de calci intracel·lular en pasmcs de rata

NE (1 μmol/L) va augmentar significativament la concentració de calci intracel·lular (n = 6, P<0.01 vs="" the="" control="" group)="" in="" rat="" pasmcs,="" and="" ech="" could="" decrease="" the="" mean="" fluorescence="" intensity="" (n="6,"><0.01 vs="" the="" ne="" group)="" (figure="">