Part 1|L'extracte d'Herba Cistanche millora la generació d'ATP mitocondrial en cors de rates i cèl·lules H9c2

Contacte: emily.li@wecistanche.com

Hoi Yan Leung i Kam Ming Ko

Departament de Bioquímica, Universitat de Ciència i Tecnologia de Hong Kong, Clear Water Bay, RAE de Hong Kong, Xina

Paraules clau: ATP,Cistanche deserticola, cèl·lules H9c2, cor, mitocondris

Resum

Investigar les bases farmacològiques de la "Yang- vigoritzant"acció de Herbal Cistanche [la planta sencera deCistanche deserticolaYC Ma (Orobanchaceae)], a la medicina xinesa, es van examinar els efectes de l'extracte de metanol d'Herba Cistanche sobre la capacitat de generació d'ATP mitocondrial mitjançant un model de cor de rata ex vivo i un assaig de cèl·lules H9c2 in situ. El tractament amb extracte d'Herba Cistanche va augmentar la capacitat de generació d'ATP mitocondrial del miocardi de manera dependent de la dosi en rates, tal com es va avaluar mitjançant mesura in vitro. L'estimulació de la capacitat de generació d'ATP es va associar amb una millora paral·lela del transport d'electrons mitocondrials suportat pel piruvat però no pel succinat. El tractament amb Herba Cistanche també va augmentar les activitats del complex mitocondrial miocardial I i del complex III, sent més gran l'extensió d'estimulació de l'activitat del complex I. El tractament amb Herba Cistanche va produir un augment depenent de la dosi i del temps de la capacitat de generació d'ATP mitocondrial a les cèl·lules H9c2. Els resultats indiquen que el tractament amb Herba Cistanche potaugmenta la generació d'ATP mitocondrialen cors de rates ex vivo i cèl·lules H9c2 in situ, possiblement a travésmillora la fosforilació oxidativa.

Cistanche pot millorar la funció cardíaca, reduir la pressió arterial i reduir els lípids a la sang

Introducció

"La dinamització del yang", que encarna la millora generalitzada de la funció corporal a la medicina xinesa, implica l'ús d'energia per impulsar diversos processos bioquímics.

En aquest sentit, l'ATP, que és la moneda universal de l'energia per alimentar la funció cel·lular, es genera principalment mitjançant la fosforilació oxidativa als mitocondris. Hem postulat que "Yang vigoritzant" les herbestenen la capacitat d'augmentar la capacitat de generació d'ATP mitocondrial(Ko et al., 2004). Això està recolzat per la nostra recent descoberta que les herbes tonificants xineses "vigoritzants de Yang", però no "nutrients de Yin" podrien millorar la capacitat de generació d'ATP del miocardi als cors de ratolí ex vivo (Ko et al., 2006). Herba Cistanche, la planta parasitària seca sencera (excloent la flor) de Cistanche deserticola YC Ma (Orobanchaceae), es classifica com a'"L'herba tonificant de la medicina tradicional xinesa, estimulant el yang" (Chen, 1998), i apareix com l'ingredient més popular en una sèrie de formulacions de patents xineses utilitzades per a la dinamització del Yang". A la Xina i el Japó, Herba Cistanche s'utilitza àmpliament per al tractament d'una sèrie de símptomes de deficiència de Yang. Els estudis farmacològics van indicar que Herba Cistanche podriaeliminar els radicals lliures(Xiong et al., 1996),produir sedant(Lu, 1998),anti edat(Lee et al., 1990),efectes antinociceptius i antiinflamatoris(Lin et al., 2002) imillorar la funció immune(Wu et al., 2005). El principal ingredient actiu d'Herba Cistanche ésglicòsids feniletanoides(Ouyang et al., 2003), que s'ha trobatantibacterià, antiestrès i antioxidantpropietats (Xiong et al., 1998), així com els efectes anti-apoptòtics sobre les neurones cultivades (Tian i Pu, 2005). En l'estudi actual, per investigar les bases farmacològiques de l'acció estimulant del Yang d'Herba Cistanche, es van examinar els efectes del tractament amb Herba Cistanche sobre la capacitat de generació d'ATP en mitocondris aïllats de cors de rates ex vivo i cardiomiòcits H9c2 cultivats in situ. Per explorar el mecanisme bioquímic subjacent a l'acció de millora de la generació d'ATP, també es van examinar els efectes del tractament amb Herba Cistanche sobre el transport d'electrons mitocondrials i les activitats complexes I-IV en cors de rates.

Els ingredients efectius de Cistanche poden eliminar diversos radicals lliures d'oxigen actius

Materials i mètodes

Productes químics, cultius cel·lulars i materials vegetals

L'ATP, l'ADP i el 3-[4,5-dimetiltiozol-2-il]-2,5-bromur de difeniltetrazoli (MTT) es van comprar a Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, EUA). La solució de luciferasa (ATPlite) es va obtenir de PerkinElmer (Boston, MA, EUA). El medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM) i el sèrum boví fetal (FBS) es van comprar a GIBCO BRL Life Technologies (Grand Island, NY, EUA). La línia cel·lular H9c2 es va comprar a ATTC (Rockville, MD, EUA). Herba Cistanche va ser subministrada per un distribuïdor d'herbes local (Lee Hoong Kee). L'herba va ser autenticada pel proveïdor i es va dipositar un exemplar de val (HKUSTY00301) al Departament de Bioquímica de la Universitat de Ciència i Tecnologia de Hong Kong (HKUST).

Extracció d'herbes

Herba Cistanche (100g) es va tallar en trossos petits i després es va extreure escalfant a reflux en 300 ml de metanol a 65 ◦ C durant 2 h. El procediment es va repetir dues vegades. L'extracte combinat es va assecar evaporant el dissolvent a pressió reduïda i l'extracte de metanol d'Herba Cistanche es va obtenir amb un rendiment del 39 per cent (p/p). L'anàlisi química va indicar que l'extracte de metanol d'Herba Cistanche contenia saponines totals, flavonoides totals, lignans totals i polisacàrids a concentracions de l'1,62 per cent (p/p), 0,08 per cent, 0,15 per cent i 75,6 per cent, respectivament.

Cura dels animals

Les rates Sprague-Dawley mascles adults (8-10 setmanes; 250-300 g) es van mantenir sota un cicle fosc/llum de 12-h en una habitació controlada per aire/humitat a uns 22◦C i es van permetre menjar i aigua ad libitum a les instal·lacions de cura d'animals de HKUST. Els protocols experimentals van ser aprovats pel Comitè de pràctiques de recerca de HKUST.

Tractament farmacològic

Els animals es van dividir aleatòriament en grups, amb de cinc a sis animals cadascun. Als grups de tractament, les rates es van administrar per via intragàstrica amb l'extracte de metanol d'Herba Cistanche (dissolt/suspès en aigua) a dosis diàries creixents ({{0}},031-0,5 g/kg) durant 3 dies. Els animals de control només rebien aigua. Vint-i-quatre hores després de l'última dosificació, el cor es va obtenir d'animals anestesiats amb fenobarbital i es va sotmetre a anàlisi bioquímica.

Preparació de fraccions mitocondrials i mesura de la capacitat de generació d'ATP (ATP-GC) ex vivo

Es van extirpar mostres de teixit ventricular esquerre del cor i es van esbandir amb tampó isotònic fred amb gel (0, 32 M sacarosa, 1 mM EDTA, 50 mM Tris/HCl, pH 7, 4). Les fraccions mitocondrials cardíaques es van preparar mitjançant centrifugació diferencial en tampó isotònic a 4 ◦ C. Es va preparar un homogeneïtat cardíac del 10 per cent (p/v) homogeneïtzant el teixit ventricular picat amb un homogeneïtzador de vidre de tefló a 4000 rpm durant 20-30 cops complets. L'homogeneïtat es va centrifugar a 600 × g durant 10 min per eliminar els nuclis i les restes cel·lulars. A continuació, el sobrenedant es va centrifugar a 8000 × g durant 30 min per sedimentar els mitocondris (Evan, 1992). Els pellets es van tornar a suspendre en 1 ml de tampó isotònic i es van reconstituir les fraccions mitocondrials. L'ATP-GC mitocondrial dels animals no tractats es va mesurar pel mètode de Leung et al. (2005)

Els polisacàrids de Cistanche poden retardar la degeneració fisiològica dels òrgans i la degeneració de la morfologia cel·lular

Mesura del transport d'electrons mitocondrials

La mesura del transport d'electrons en mitocondris aïllats, que es basa en la reducció de MTT, tal com es fa [1] tal com descriu Cohen et al. (1997). Els mitocondris es van preparar a una concentració de proteïnes d'1 mg/ml amb un tampó d'incubació (sacarosa 250 mM, HEPES 50 mM, KH2PO4 10 mM, MgCl2 2 mM, EGTA 1 mM, pH 7,4) . Es va barrejar una alíquota (40 µL) dels mitocondris amb 100 µL cadascun de 15 mM de piruvat o 0,5 mM de succinat i 0,42 mg/mL de MTT. La mescla de reacció es va incubar a 37 ◦ C durant 10 min amb agitació suau. Després de la incubació, la barreja de reacció es va acabar amb l'addició de 100 µL de tampó de lisi (10 per cent, p/v, dodecil sulfat de sodi i 45 per cent de dimetilformamida, ajustat a pH 4,7 amb àcid acètic glacial). Després de reposar durant 5 min, es van prendre lectures d'absorbància de la barreja de reacció amb un lector de plaques de microtitulació (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) i es van informar com la diferència entre 570 nm i 630 nm. Les dades es van expressar com a percentatge del valor mitjà del grup control (és a dir, Herba Cistanche sense tractar).

Cultiu cel·lular

Les cèl·lules H9c2, una línia cel·lular permanent derivada de mioblasts cardíacs (Hescheler et al., 1991), es van cultivar com a monocapes en DMEM complementat amb un 10 per cent (v/v) de FBS. El medi contenia glucosa (4,5 g/L) i glutamina (4,5 mM), complementades amb NaHCO3 (17 mM), penicil·lina (100 UI/mL) i estreptomicina (100µg/mL). Totes les cèl·lules es van cultivar sota una atmosfera de 5% (v/v) de CO2 a l'aire a 37 ◦ C. El medi es va substituir per mitjà fresc cada 2 o 3 dies. Es va cultivar un estoc de cèl·lules en un matràs de cultiu de 75 cm2 i es va dividir abans de la confluència amb una proporció de subcultiu d'1:10. Per a l'assaig ATP-GC, les cèl·lules H9c2 es van sembrar a una densitat de 2,5 × 104 cèl·lules/pou en una placa 24-pou. Després de la fixació cel·lular, es va aplicar extracte d'Herba Cistanche (dissolt en solució salina tamponada amb fosfat; PBS) al medi i les cèl·lules es van incubar durant períodes creixents (2-16 h) de temps. Les cèl·lules de control (no tractades) només van rebre el PBS.

Mesurament d'ATP-GC in situ

Després dels períodes d'incubació indicats amb extracte d'HerbaCistanche a concentracions creixents (5{{10}}-300µg/mL), es va realitzar l'assaig ATP-GC. El medi es va aspirar i les cèl·lules es van tractar amb digitonina (50 µg/mL) en un tampó d'incubació (120 mM KCl, 5 mMKH2PO4, 2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 0,1 mM MgCl2, 0,5 per cent de BSA, pH 7,4) durant 3 min. ◦C. Després d'aspirar la digitonina, es van afegir glutamat (5 mM), malat (5 mM) i ADP (60 µM) a les cèl·lules per a la generació d'ATP mitocondrial, que es va controlar a intervals de temps creixents que van de 0 a 15 min. La reacció es va acabar amb l'addició de 60 µL d'àcid perclòric (30 per cent, p/v) i les mescles de reacció es van centrifugar a 600 × g durant 10 min a 4 ◦ C. Es va barrejar una alíquota (120 µL) del sobrenedant amb 90 µL de KHCO3 1,4 M per a la neutralització. Les mescles es van centrifugar de nou a 600 × g a 4 ◦ C, i es va mesurar el contingut d'ATP dels sobrenedants tal com s'ha descrit anteriorment. L'ATP-GC de les cèl·lules no tractades es va estimar calculant l'àrea sota la corba del gràfic (AUC1) que representa l'ATP generat (nmol/mg de proteïna) en funció del temps (0-15 min) i expressat en unitats arbitràries. Per a les cèl·lules tractades amb HerbaCistanche, els valors AUC1 dels temps d'incubació creixents (3, 5, 7, 10 i 15 min) es van normalitzar a un valor de control mitjà respectiu de les mostres no tractades i es van expressar com a percentatge de control. A continuació, es va calcular l'àrea sota la corba (AUC2) del gràfic que representava el percentatge dels valors de control en relació al temps d'incubació (3-15 min) i es va expressar en unitats arbitràries. Les dades dels grups tractats amb Herba Cistanche es van expressar com a percentatge del control de l'equació:

[AUC2(tractat amb HerbaCistanche)/AUC2(sense tractar)]×100 per cent

Mesures de les activitats del complex I–IV i de la citrat sintasa

Les activitats del complex I-III de la cadena de transport d'electrons mitocondrials (ETC) es van mesurar mitjançant mètodes espectrofotomètrics utilitzant substrats específics del complex (NADH per al complex I, succinat per al complex II i decilubiquinol per al complex III) tal com es descriu (Grad i Lemire, 2004; Hsu et al. , 2005;Mark et al., 2001). L'activitat del complex IV es va mesurar mitjançant un kit d'assaig de citocrom c oxidasa de Sigma. L'activitat de la citrat sintasa mitocondrial es va mesurar pel mètode de Srere (1969).

Assaig de proteïnes

Les concentracions de proteïnes de les fraccions mitocondrials i els cel·litzats es van determinar mitjançant un kit d'assaig de proteïnes BioRad utilitzant albúmina sèrica bovina com a estàndard ({{0}}, 038-0, 600 mg/mL).

Anàlisi estadística

Totes les dades es van expressar com a mitjana ± error estàndard de la mitjana temàtica (SEM). Es van analitzar mitjançant anàlisi de variància unidireccional (ANOVA). Es van fer múltiples comparacions post hoc amb LSD. Valors P<0.05 were="" regarded="" as="" statistically="">

Resultats

Efectes del tractament amb Herba Cistanche sobre l'ATP-GC miocardialmitocondrial en rates

Com es mostra a la figura 1, el tractament amb extracte d'Herba Cistanche a dosis de fins a 0,5 g/kg va augmentar l'ATP-GC mitocondrial del miocardi de manera dependent de la dosi en rates, amb un grau d'estimulació del 89 per cent a una dosi. de 0,5 g/kg.

Efectes del tractament amb Herba Cistanche al transport d'electrons mitocondrials en cors de rates

L'extensió del transport d'electrons en mitocondris aïllats es va mesurar mitjançant el seguiment de la reducció de MTT. El substrat utilitzat per a l'assaig era piruvat o succinat.

Figura 1. L'efecte del tractament amb Herba Cistanche sobre la capacitat de generació d'ATP mitocondrial en cors de rates ex vivo

Cada barra representa la temàtica ± SEM, amb n {{0}}. Els animals van ser tractats oralment amb HerbaCistanche a les dosis diàries indicades durant 3 dies. La capacitat de generació d'ATP es va mesurar tal com es descriu a "Materials i mètodes". Les dades es van expressar en percentatge de control respecte als valors (AUC2) del grup control no tractat respectiu. ∗Significativament diferent del grup control no tractat; significativament diferent del grup tractat amb Herba Cistanche a 0,5 g/kg.

Figura 2. Efectes del tractament amb Herba Cistanche sobre el transport d'electrons mitocondrials en cors de rates

Cada barra representa la mitjana ± SEM, amb n {{0}}. ( a ) El transport d'electrons mitocondrials suportat per piruvat (b) es va mesurar mitjançant la reducció de MTT, tal com es descriu a "Materials i mètodes". Les dades es van expressar en el percentatge de valors de control no tractats [admesos amb piruvat: OD570nm− OD630nm =0.{0206 ± 0,0001 (SEM), n {{ 10}}; suportat per succinat: mascle, 0,255 ± 0,015, n=5]. ∗Significativament diferent del grup de control no tractat respectiu; una diferència significativa del grup de 0,5 g/kg.

Com es mostra a la figura 2a, el tractament amb Herba Cistanche va augmentar depenent de la dosi l'extensió del transport d'electrons mitocondrials suportat pel piruvat als cors de rates, amb l'estimulació òptima observable a dosis de 0, 5 g/kg. Tanmateix, no es van detectar canvis significatius en l'extensió del transport d'electrons mitocondrials recolzats per succinat en cors de rates tractats amb Herba Cistanche (Fig. 2b).

Per a la part 2,feu clic aquí.