Part 1: Farmacologia de xarxa integrada i model de peix zebra per investigar els components de doble efecte de Cistanche Tubulosa per tractar tant l'osteoporosi com la malaltia d'Alzheimer
Mar 30, 2022
Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Ying-Qi Li 1, Yi Chen 1, Jia-Yi Fang 1, Si-Qi Jiang 1, Ping Li 1, * i Fei Li 1, 2, *
RESUM
Rellevància etnofarmacològica:L'osteoporosi (OP) i la malaltia d'Alzheimer (MA) són malalties concurrents geriàtriques comunes, i molts estudis indiquen la connexió de la seva patogènesi. Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) és una medicina tradicional xinesa àmpliament utilitzada i s'ha aplicat àmpliament per tractar OP i AD, respectivament. Tanmateix, els ingredients actius per a malalties concurrents simultàniament i els mecanismes subjacents són limitats.
Objectiu de l'estudi:Aquest treball tenia com a objectiu establir un mètode de cribratge de xarxa eficaç i fiable per trobar compostos de doble efecte en TC que puguin protegir simultàniament l'AD i l'OP. I proporcionarà noves perspectives de la vinculació entre OP i AD sobre els mecanismes moleculars.
Material i mètodes:Els efectes duals de la TC es van analitzar sistemàticament mitjançant la integració de múltiples bases de dades i una anàlisi extensa a nivell de farmacologia de xarxa. Es va construir una xarxa d'interacció medicament-objectiu classificada per revelar diferències d'efectes entre diferents tipus de compostos. Per demostrar l'eficàcia d'aquesta xarxa, es van seleccionar alguns compostos per verificar-los en el model OP preinduït i el model AD induït amb AlCl3-de peix zebra segons els paràmetres topològics.
Paraules clau:Farmacologia en xarxa; osteoporosi;Malaltia d'Alzheimer; Cistanche tubulosa; Peix zebra.
Cistanche té una funció anti-Alzheimer.
1. Introducció
La tendència a l'envelliment de la població provoca un augment de la prevalença d'osteoporosi (OP) i malaltia d'Alzheimer (AD) al llarg dels anys (Parnetti et al., 2019; Rizzoli, 2018). Avui en dia, tant l'OP com l'AD s'han reconegut com a grans amenaces per a la salut pública, ja que poden progressar sense símptomes i comportar grans càrregues socials (Erkkinen et al., 2018; Jonsson et al., 2018). Com a malalties relacionades amb l'edat, sovint es veu que es produeixen conjuntament en la pràctica clínica amb una alta taxa de discapacitat i mortalitat (Dengler-Crish i Elefteriou, 2019). L'OP és una malaltia esquelètica sistèmica caracteritzada per una massa òssia baixa i una microarquitectura deteriorada del teixit ossi, amb una major fragilitat òssia i un major risc de fractures (Rizzoli, 2018). La MA és la degeneració cerebral més comuna caracteritzada per una pèrdua progressiva de memòria i altres funcions cognitives (Bondi et al., 2017). Fins ara, encara no hi ha opcions prou potents per prevenir o curar les dues malalties de la seva complexa etiologia i patogènesi. I el pitjor és que el pacient té més sovint efectes secundaris (Brown, 2017; Huang i Mucke, 2012).
Sobre la base teòrica de la diferenciació de la síndrome (Sucher, 2013), les medicines tradicionals xineses (MTC) amb múltiples components dirigits a més d'un mecanisme fisiopatològic tenen una superioritat única en el tractament d'algunes malalties complexes familiars. Com a herba tònica renal, Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) s'utilitza àmpliament contra la pèrdua de memòria i la debilitat atròfica dels ossos pels metges tradicionals xinesos (Fu et al., 2018). A més de la seva eficàcia tradicional, una investigació considerable va demostrar que tenia diverses activitats farmacològiques, com ara millorar els dèficits cognitius i de comportament (Wu et al., 2014), antiinflamatoris (Fu et al., 2018), promoure la formació òssia i suprimir l'os. reabsorció (Li et al., 2013; Li et al., 2012), així com l'activitat antioxidant (Zhang et al., 2016). Però la complicació dels seus ingredients actius i el procés metabòlic va plantejar dificultats tant per explorar objectius en teixits humans com per exposar el mecanisme d'acció.
Sobretot, és necessària una discussió fiable sobre els objectius terapèutics de l'OP/AD. Especialment basant-se en el pensament del "mateix tractament per a diferents malalties" en les MTC, i en les metodologies de la farmacologia a la xarxa "terapèutica multicomponent, xarxa biològica", els intents de cercar dianes comunes significatives entre ambdues malalties poden tenir un efecte especialment pràctic. significat en proporcionar orientació per a la prevenció i el control de la PO i la DA. Els peixos zebra tenen fortes similituds en la seva fisiologia esquelètica amb els mamífers i gens altament homòlegs amb els humans. És un model animal disponible i atractiu in vivo per a la investigació d'OP i AD (Bergen et al., 2019; Newman et al., 2014). Així, aquesta investigació de farmacologia en xarxa va tenir com a objectiu el cribratge de components actius de doble efecte de la TC, explorant els objectius potencials comuns d'OP i AD, així com descobrint la possibilitat d'utilitzar la TC per tractar dues malalties simultàniament. En aquest estudi, la informació dels objectius dels ingredients actius de la TC, els genomes i la informació de proteòmica d'OP i AD es va recollir respectivament de diferents bases de dades per establir una xarxa interactiva i es va construir una anàlisi d'enriquiment per descobrir mecanismes sinèrgics de TC per tractar OP i AD. . A més, vam induir models de peix zebra OP i AD respectivament i vam capturar els compostos clau de la xarxa per verificar la seva eficàcia i objectius per a dues malalties.
Cistanche augmenta el creixement de l'esclerotina.
2. Materials i mètodes
2.1 Reactius
Els estàndards químics de genisteïna (GE), quercetina (QU), àcid abiètic (AA), -sitosterol (BSS) (puresa superior o igual al 98 per cent) es van comprar a Chroma Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, Xina). Les plaques de cultiu es van obtenir de Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. (Wuxi, Xina). Prednisolona (Pre), Etidronate Disodium (Ed), Donepezil HCL (DPZ), AlCl3·6H2O es va comprar a Aladdin Reagent Inc. Fosfatasa alcalina de peix zebra (ALP), fosfatasa àcida resistent al tartrat (TRAP), acetilcolinesterasa (AChE) i colina Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Xangai, Xina) va subministrar el kit d'assaig immunoabsorbent lligat a enzims (ELISA) acetiltransferasa (ChAT). Trizol es va obtenir de Nanjing KeyGen Biotech. Co., Ltd. (Nanjing, Xina). Transtar Top Green qPCR SuperMix es va comprar a TransGen Biotech. Co., Ltd. (Beijing, Xina).
extracte de cistanche
2.2 Animals
Els peixos zebra adults (soca AB, 4 mesos d'edat) es van mantenir a 28 graus sota un cicle de llum/foscor de 14/10 h en un aquari subministrat amb l'intercanvi d'aigua dolça. Es van mantenir dues vegades al dia amb una dieta de gambes de salmorra acabada d'eclosionar (Chen et al., 2018). Els embrions fecundats normalment es van seleccionar i es van cultivar fins a 3 dies després de la fecundació (dpf) en una incubadora de creixement lleuger. Tots els experiments amb animals estaven d'acord amb les directrius de la institució i el govern per a experiments amb animals.
2.3 Procés farmacològic en xarxa
2.3.1 Càlcul de l'espai químic i selecció de compostos candidats
Totes les dades d'ingredients químics de la TC es van recollir de la plataforma d'anàlisi i base de dades de farmacologia dels sistemes de medicina tradicional xinesa. TCMSP és una plataforma de farmacologia de sistemes de plantes medicinals xineses que captura les relacions entre fàrmacs, dianes i malalties (Ru et al., 2014). Mentrestant, es van adquirir quatre paràmetres essencials relacionats amb la farmacologia en TCMSP per a l'anàlisi de components principals (PCA), inclòs el pes molecular (MW), el coeficient de partició entre octanol i aigua (AlogP), el recompte de donants d'hidrogen (Hdon) i el recompte d'acceptants d'hidrogen. Hacc). La distribució química de la TC es va construir amb els paràmetres anteriors mitjançant el programari SIMCA (versió 14.1, Umetrics). I els fàrmacs de molècules petites aprovats per AD/OP de DrugBank es van processar en el mateix curs. Els ingredients de la TC es van filtrar per semblança de fàrmacs (DL). DL és un concepte qualitatiu que s'utilitza en el disseny de fàrmacs per a una estimació de com és "semblant a un fàrmac" un compost potencial. Aquesta propietat vital s'utilitza com a criteri de selecció dels compostos "semblants a fàrmacs" de les herbes tradicionals xineses i ajuda a optimitzar la farmacocinètica i les propietats farmacèutiques (Tao et al., 2013). A partir dels suggeriments de la literatura i del TCMSP, vam seleccionar DL Major que o igual a 0.18 com a condicions de filtre. Els ingredients conformes a la condició es van exportar per a una anàlisi posterior. Les seves estructures 2-dimensionals (2D) i 3D van ser pintades pel programari ChemDraw Professional 16.0. I les estructures 3D es van optimitzar mitjançant la funció de minimitzar l'energia a Chem3D 16.0.
2.3.2 Col·lecció d'objectius associats a OP i AD
Totes les associacions de gens per a OP i AD es van recollir de manera independent de DisGeNET i GeneCards. La base de dades DisGeNET és una de les majors plataformes de descobriment de gens i variants associades a malalties humanes (Pinero et al., 2017). GeneCards és una base de dades integrada de gens humans que inclou informació genòmica, transcriptòmica, proteòmica, genètica, clínica i funcional (Safran et al., 2010).
2.3.3 Recollida d'objectius composts i predicció d'acoblament invers
La base de dades GeneCards i la base de dades Swiss TargetPrediction es van combinar per predir objectius rellevants d'ingredients actius a la TC. GeneCards indica els objectius actius coneguts dels compostos, mentre que la base de dades Swiss TargetPrediction pot estimar els objectius macromoleculars més probables de molècules petites (Daina et al., 2019). Abans de la predicció, les estructures de les molècules candidates es van convertir del format mol2 al format SMILES mitjançant Open Babel (versió 2.4.1).
2.3.4 Anàlisi de la interacció proteïna-proteïna
La base de dades STRING es va aplicar per descobrir les interaccions entre un grup d'objectius compartits CT-OP-AD. Després de buscar sota el patró d'"Homo sapiens", el programari Cytoscape (versió 3.7.2) va visualitzar la xarxa d'interacció proteïna-proteïna (PPI). STRING és una base de dades de PPI conegut i previst, derivada de prediccions del context genòmic, experiments de laboratori d'alt rendiment, coexpressió (conservada), extracció automatitzada de textos i coneixements previs en bases de dades (Szklarczyk et al., 2017).
Cistanche és bo per a la malaltia d'Alzheimer.
2.3.5 Anàlisi d'enriquiment de la via GO i KEGG
L'anàlisi d'enriquiment de Gene Ontologia (GO) es va realitzar amb el programari Funrich. FunRich (versió 3.1.3) és un programari funcional utilitzat principalment per a l'anàlisi d'enriquiment de gens i proteïnes (Pathan et al., 2015). Es va utilitzar la base de dades ConsensusPathDB-human per dur a terme l'anàlisi d'enriquiment de la via. La llista de gens obtinguda es va enviar a la base de dades amb la configuració de "tall del valor p" com a 0,01. Després d'obtenir els resultats, només es van seleccionar aquestes vies relacionades amb OP i/o AD i es van dividir en grups segons les categories de funció KEGG. CPDB és una xarxa d'interacció perfecta que conté interaccions binàries i complexes proteïna-proteïna, genètiques, metabòliques, de senyalització, reguladores de gens i medicaments-objectiu, així com vies bioquímiques en Homo sapiens (Kamburov et al., 2013).
2.4 Procediments experimentals per al model de peix zebra OP
2.4.1 Agrupació de models
Les larves de peix zebra es van dividir en diversos grups: grup control, grup model, grup model més Ed, grups model més compostos, cadascun dels quals contenia 30 larves. El grup control es va mantenir al medi amb un 0,2 per cent de DMSO. El grup model es va tractar amb Pre (25 µM) de 3 dpf a 8 dpf. El grup model més Ed es va cotractar amb Pre i Ed (30 µg/mL).
2.4.2 Tinció vermella d'alizarina
Després de 5 dies de cultiu amb diferents compostos, les larves van ser anestesiades, fixades i blanquejades al seu torn. El vermell d'alizarina s'utilitzava per tacar els ossos del cap dels peixos zebra. Es van aplicar 1 per cent de KOH i glicerol (proporcions de 3:1, 1:1 i 1:3) respectivament per eliminar l'excés. Finalment, es va utilitzar un estereomicroscopi (Olympus SZX16) per capturar les imatges de tinció de peix zebra sota la posició prona. L'àrea de tinció i la densitat òptica integrada (IOD) es van calcular mitjançant Image-Pro Plus 6.0.
2.4.3 Determinació de l'activitat ALP i TRAP
Les larves de peix zebra a 3 dpf es van subcultivar en plaques 6-pous i es van incubar amb Pre en presència o absència de compostos durant 5 dies. Després es van recollir per mesurar l'activitat ALP. L'activitat ALP es va determinar mitjançant el kit ALP ELISA de peix zebra basat en el protocol del fabricant. El mètode per avaluar l'activitat del TRAP va ser el mateix que l'ALP.
2.5 Procediments experimentals per al model AD zebrafish
2.5.1 Agrupació de models
Les larves de peix zebra es van dividir en diversos grups: grup control, grup model, grup model més DPZ, grups model més compostos, cadascun dels quals contenia 30 larves. El grup control es va mantenir al medi amb un 0,2 per cent de DMSO. El grup model es va tractar amb AlCl3 (150 µM, pH 5,8) de 3 dpf a 6 dpf. El grup model més DPZ es va cotractar amb AlCl3 i DPZ (8 µM).
2.5.2 Anàlisi del comportament
Després de 3 dies de lliurament de fàrmacs, l'analitzador de comportament ViewPoint va registrar el moviment de larves (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.). Tots els experiments es van completar en 60 min a 28 °C, que contenien 3 cicles de fase llum/fosca (10 min cadascun per a la llum i la foscor). Segons els mètodes de l'informe anterior, la velocitat mitjana (AS), el canvi de velocitat (∆S), la taxa de recuperació de discinesia (DRR, equació a) i l'eficiència de resposta (RE, equació b) es seleccionen com a eficiència del fàrmac anti-AD. índex d'avaluació en aquest model (Pan et al., 2019; Wenhai et al., 2016).
AS (mm/s)=D / T, DRR (percentatge)=100 × (ASDrug - ASModel) / (ASControl - ASModel), a
on D és la distància de moviment del peix zebra durant 60 min, T és el temps experimental.
RE ( percentatge )=100 × (∆SDroga - ∆SModel) / (∆SControl - ∆SModel), b
on ∆S és el canvi de velocitat del peix zebra en cicles llum/fosc.
2.5.3 Mesura de l'activitat AChE i XAT
Les larves de peix zebra a 3 dpf es van subcultivar en plaques 6-pous i es van incubar amb AlCl3 en presència o absència de compostos durant 3 dies. Després es van recollir per a l'activitat AChE. L'activitat AChE es va detectar mitjançant el kit ELISA AChE de peix zebra basat en el protocol del fabricant. El mètode per avaluar l'activitat de ChAT va ser el mateix que l'AChE.
2.6 Anàlisi quantitativa de PCR en temps real
Les larves de peix zebra es van dividir en grups OP i AD. Els grups OP estaven formats pel grup control, el grup Pre i els grups de compostos Pre plus, cultivats de 3 dpf a 8 dpf. Els grups AD incloïen el grup control, el grup AlCl3 i els grups de compostos AlCl3 més, cultivats de 3 dpf a 5 dpf. Cada grup contenia 30 larves. L'ARN total es va extreure respectivament d'aquestes mostres de larves de peix zebra mitjançant Trizol. Les mostres d'ARN es van transcriure inversament a l'ADNc segons les instruccions del fabricant del kit d'ADNc. El nivell d'expressió d'ARNm es va detectar mitjançant PCR quantitativa fluorescent en temps real (Roche LightCycler96). Els resultats es van normalitzar a l'expressió -actina i es van quantificar mitjançant el mètode comparatiu (2−∆∆Ct). Sangon Biotech (Xangai, Xina) va sintetitzar els imprimadors directes i inversos utilitzats i es van enumerar a la taula complementària S1.
cistanche i Tongkat ali en polsajuda a millorar la immunitat.
Per a més informació, feu clic aquí.
2.7 Anàlisi estadística
GraphPad Prism versió 8.00 es va utilitzar per a anàlisis estadístiques descriptives. Les dades es van expressar com a mitjana ± SD i es van analitzar mitjançant el mètode ANOVA per comprovar la variabilitat entre cada assaig considerant P inferior o igual a 0,05 com a significatiu.
