Part 1: Mapeig de la interacció epigenòmica i transcriptòmica durant la formació de la memòria i el record en el conjunt d'engrames de l'hipocamp
Mar 15, 2022
Per a més information:ali.ma@wecistanche.com
Asaf Marco1,2,*, Hiruy S. Meharena1,2, Vishnu Dileep1,2, Ravikiran M. Raju1,4, Jose Davila- Velderrain3, Amy Zhang2, Chinnakkaruppan Adaikkan1,2, Jennie Z. Young1,2, Fan Gao1, Manolis Kellis3,5, Li-Huei Tsai1,2,5,*
1Picower Institute for Learning andMemòria, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, EUA.
2Departament de Ciències Cerebrals i Cognitives, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, EUA.
3 Laboratori de Ciència i Intel·ligència Artificial de l'empresa, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, EUA.
4Division of Newborn Medicine, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, EUA.
5Broad Institute de Harvard i MIT, Cambridge, Massachusetts, EUA.
Feu clic aBotiga de vitamines Cistanche i Cistanche per a la memòria
Abstracte
L'epigenoma i l'arquitectura genòmica tridimensional (3D) estan emergint com a factors clau en la regulació dinàmica dels diferents programes transcripcionals necessaris per a les funcions neuronals. Aquí utilitzem un sistema d'etiquetatge dependent de l'activitat en ratolins per determinar l'estat epigenètic, l'arquitectura del genoma 3D i el paisatge transcripcional de les cèl·lules d'engrama al llarg de la vida útil dememòriaFormació i record. Els nostres resultats revelen quememòriala codificació condueix a un esdeveniment d'imprimació epigenètica, marcat per una major accessibilitat dels potenciadors sense els canvis transcripcionals corresponents.Memòriala consolidació es tradueix posteriorment en una reorganització espacial de grans segments de cromatina i interaccions promotor-potenciador. Finalment, amb la reactivació, les neurones engrames utilitzen un subconjunt d'interaccions denovolong-range, on els potenciadors preparats van entrar en contacte amb els seus respectius promotors per regular els gens implicats en la traducció local de proteïnes en compartiments sinàptics. Col·lectivament, el nostre treball elucida el transcripcional complet i els Usuaris poden visualitzar, imprimir, copiar i descarregar text i extreure el contingut d'aquests documents, per a la investigació acadèmica, subjectes sempre a les condicions completes d'ús:http://www.nature.com/authors/editorial_policies/license.html#terms
*Correspondència amb: marcoa@mit.edu. lhtsai@mit.edu.
Contribucions de l'autor:
A.M. y L.-H.T. conceptualitzar i dissenyar el projecte. A.M i A.Z van realitzar experiments de comportament, ISH, immunostaining i anàlisi MARIS. C.A va realitzar injecció de virus i immunostainings. A.M i H.S.M van realitzar experiments ATAC-seq. A.M i A.Z van realitzar experiments nuclears d'ARN-seq. A.M, H.S.M i V.D van realitzar experiments pc-Hi-C i Hi-C. A.M, H.S.M, V.D, R.M.R i J.D.V. van realitzar anàlisis ATAC-seq. A.M, R.M.R, H.S.M, V.D i F.G. van realitzar anàlisis nuclears d'ARN-seq. A.M, V.D, H.S.M, i R.M.R van realitzar anàlisis pc-Hi-C i Hi-C. Tots els autors ajuden a interpretar les dades. A.M, H.S.M, V.D, R.M.R, J.Z.Y, M.K, i L.H.T van escriure el manuscrit amb aportacions de tots els autors. L.H.T. va proporcionar les eines i va supervisar el projecte.
Interessos en competència:
Els autors no declaren interessos en competència.
el paisatge epigenòmic al llarg de la vida útil dememòriaformació i record en el conjunt d'engrames de l'hipocamp.
La formació i conservació de memòries a llarg termini depèn de l'expressió gènica coordinada i la síntesi de proteïnes sinàptiques1. Aquests processos moleculars actuen dins d'una població específica de neurones, anomenades cèl·lules d'engrama2-4. Els enfocaments recents que utilitzen l'expressió dependent de l'activitat dels reporters van proporcionar un marc per explorar el conjunt d'engrames5-8, però els mecanismes moleculars que regeixenmemòrial'emmagatzematge i la recuperació segueixen sent poc entesos. En concret, les modificacions epigenètiques i l'arquitectura genòmica 3D estan emergint com un factor clau en la regulació dinàmica de l'expressió gènica9- 17, i cada vegada hi ha més apreciació de la seva importància en la funció neuronal, el desenvolupament i la malaltia14, 16, 18
Aquí, vam utilitzar el model de ratolí Trap de recombinació dirigida en poblacions actives (TRAP), en el qual les neurones activades que expressen el gen de citoesquelet associat al citoesquelet regulat d'activitat, (Arc), s'etiqueten permanentment d'una manera induïble. Neurones activades durantmemòriala codificació, consolidació i retirada van ser ordenades i sotmeses a seqüenciació d'ARN nuclear (nRNA-seq), Assay per a cromatina transposasa-accessible mitjançant seqüenciació (ATAC-seq) i captura de conformació cromosòmica (Hi-C). Les nostres dades demostren quememòriala codificació condueix a un augment de tot el genoma en l'accessibilitat de la cromatina, sense canvis esperats en l'expressió gènica. A més, demostrem que la fase tardana de consolidació de la memòria es va associar amb la relocalització de grans segments de cromatina (sub-compartiments) d'entorns inactius a permissius, i la reorganització del paisatge d'interacció promotor-potenciador. Finalment, la reactivació de les neurones durantmemòriala memòria s'associa amb interaccions de denovopromoter-potenciador, utilitzant un gran subconjunt dels potenciadors que es van preparar durantmemòriaCodificació. Aquestes interaccions promotor-potenciador s'associen amb un canvi robust en l'expressió de gens implicats en la síntesi local de proteïnes i la morfogènesi sinàptica.
Resultats
Identificació temporal i espacial de cèl·lules d'engrama activades i reactivades
El seguiment de l'activitat neuronal al llarg del temps ha estat un dels principals reptes a l'hora d'estudiar les cèl·lules d'engrama, ja que els marcadors de l'activitat neuronal, coneguts com a gens primerencs immediats (IEG), tornen a la línia de base poc després de la inducció1,2. Per superar aquesta limitació, vam aprofitar el model TRAP5,6, que requereix dos transgènere, un que expressa CreERT2 d'un promotor arc dependent de l'activitat i un altre que permet l'expressió de la proteïna fluorescent groga (eYFP), de manera dependent de Cre. L'administració de tamoxifè (TAM) als ratolins TRAP dóna lloc a una etiqueta eYFP permanent en les neurones Arc activades. Sense TAM, CreERT2 es conserva en el citoplasma i eYFP no s'expressa (Dades Ampliades Fig. 1a). Els ratolins TRAP van ser sotmesos al paradigma clàssic pavlovià de condicionament de la por contextual (CFC) (fig. 1a), un mètode comunament utilitzat per estudiar memòries aversives19. Aproximadament 1,5-2 hores després de l'exposició a la FS, es van recollir cervells per identificar i) proteïna d'unió a ARN fox-1 homolog 3 (Rbfox3) també conegudes com NeuN+ i eYFP+ etiquetades neurones que es van activar durant l'exposició inicial (Activada-primerenca), que es pot distingir de ii) NeuN +/eYFP- neurones d'estat basal no activades (Basal) (Fig. 1a). Després de cinc dies, en absència de recuperació, vam recollir iii) neurones NeuN+/eYFP+ que van ser etiquetades el dia de l'entrenament, denotant a llarg terminimemòriaconsolidació (Activada-tard). En un
diferents cohorts, els ratolins van ser reex exposats a l'estímul condicionat i la subsegüent expressió de la proteïna ARC endògena es va assaig 1,5-2 hores després de la reexposició. Això va permetre identificar les neurones d'engrama d'Arc+ doblement positius que es van activar durant l'entrenament i es van reactivar durantmemòriarecuperació (Reactivat). Notablement, tot i que la recombinació de l'ADN pot no ocórrer completament 1,5-2 h després de la FS, vam observar una alta co-localització (mitjana del 84%) entre la proteïna Arc endògena i el reporter Arc: eYFP (Extended Data Fig. 1b), que també era coherent amb informes anteriors20.
Per confirmarmemòriacodificació i retirada durant la CFC, el comportament de congelació es va registrar durant l'entrenament i la reexposició a senyals que indueixen la por (Extended Data Fig. 1c). D'acord amb les publicacions anteriors6,20, les nostres dades van mostrar un augment significatiu en el nombre de neurones eYFP + (Activades-primerenques i -tardanes) en l'hipocamp, en comparació amb els ratolins que van romandre ingenus a CFC a la seva gàbia domèstica (F (2, 70) = 240,3, P<0.0001, fig.="" 1b).="" activity-dependent="" tagging="" was="" also="" negligible="" (~1%)="" in="" the="" absence="" of="" tam="" induction="" (fig.="" 1c,="" extended="" data="" fig.="" 1d).="" with="" tamoxifen="" treatment,="" we="" observed="" a="" wide="" distribution="" of="" activity-labeled="" populations="" across="" all="" hippocampal="" sub-regions,="" where="" early="" activation="" was="" predominantly="" observed="" in="" the="" dg="" and="" late="" tagging="" was="" most="" abundant="" in="" the="" ca1="" (fig.="" 1d).="" to="" further="" interrogate="" the="" specificity="" of="" engram="" formation,="" we="" subjected="" trap="" mice="" to="" cfc="" learning="" in="" context="" a="" and="" then="" exposed="" them="" 5="" days="" later="" to="" the="" same="" context="" (a-a)="" or="" a="" novel="" neutral="" context="" b="" (a-b)="" (fig.="" 1e,="" extended="" data="" fig.="" 1e).="" we="" found="" comparable="" numbers="" of="" activated="" –late="" neurons="" in="" both="" groups="" (p="0.9)" and="" significantly="" fewer="" reactivated="" neurons="" in="" the="" a-b="" group=""><0.0001, fig.="" 1f;="" extended="" data="" fig.="" 1f),="" confirming="" that="" the="" reactivated="" cells="" play="" a="" key="" role="" in="" encoding="" prior="">
La formació de memòria s'associa amb una major accessibilitat a la cromatina, principalment en potenciadors
Per comprendre millor les forces moleculars que governen diferents programes transcripcionals, hem mesurat els canvis en tot el genoma de l'accessibilitat de la cromatina a través de diferents fases dememòria. Els teixits de l'hipocamp es van agrupar i els nuclis aïllats (Dades esteses fig. 2a, taula suplementària 1) van ser sotmesos a la preparació de la biblioteca ATAC-seq. L'anàlisi de regions d'accés diferencial (DAR) (mode Diffbind, DESeq2) entre totes les poblacions (fig. 2a) va revelar que la majoria dels canvis en l'estat de cromatina es produeixen durant la fase primerenca de la formació de memòria, on 7.862 regions de tot el genoma guanyen accessibilitat (Basal vs. Early, Supplementary Table 2). En canvi, vam observar canvis relativament mínims en l'estat de la cromatina en passar de Activat-primerenc a Activat-tardà (582 DARs) i entre neurones activades-tardanes i Reactivades (725 DARs), amb un 48% de superposició entre elles (Dades ampliades Fig. 2b). Sorprenentment, vam identificar un gran percentatge (52%) dels DARs guanyats de manera robusta que es van fer més accessibles a Activada-primerenca i es van mantenir accessibles tant en les neurones activades-tard com reactivades (fig. 2b,c; Taula complementària 2). Curiosament, mentre que tant els canvis primerencs (basal vs. early) com els DAR guanyats s'enriquien per a regions intergèniques, els canvis tardans de cromatina (Early vs. late and late vs. reactivats) es van enriquir principalment per als llocs promotors( fig. 2d).
La visió funcional es va permetre avaluant com els DAR estan marcats per diferents modificacions d'histones. Primer vam utilitzar ChromHMM per establir un model d'estat de cromatina a partir de dos estudis independents que utilitzaven teixit de l'hipocamp a granel abans i després del xoc del peu 21,22. A continuació, vam realitzar una anàlisi d'enriquiment de plecs (observat sobre la distribució esperada) dels DARs per a aquests diferents estats i vam revelar que els primers canvis en cromatina i DARs estables es van enriquir per a les marques de potenciadors (fig. 2e; Dades ampliades Fig. 2c, Taula complementària 3).
Aquests resultats estan en línia amb publicacions anteriors, el que demostra que estimular el cultiu neuronal primari indueix una activitat potenciador prolongada12,23. A continuació, vam analitzar la superposició de loci estable individual amb l'H3K4me1 i H3K27ac21. Aquestes dues marques d'histone delineen diferents poblacions de potenciadors, que poden ser "preparats" (només H3K4me1), "actius" (H3K4me1 i H3K27ac), o "latents" (sense marques)18. Els pics estables van mostrar una distribució entre potenciadors preparats i actius (Extended Data Fig. 2d), on es va predir que el 47% d'aquests llocs eren "latents" (no hi ha superposició entre DARs i marques d'histones21 obtingudes 1h després de FS). Per confirmar el nostre model, vam realitzar immunoprecipitació de cromatina (ChIP) per a marcadors d'histones H3K4me1 i H3K27ac, seguits de qPCR. Quatre llocs seleccionats van ser escollits de la nostra anàlisi de modelatge de potenciadors putatius (Extended Data Fig. 2d; Potenciador 1 - predit primer, potenciador 2- predit Actiu, Potenciador 3 i 4 - predit latent). D'acord amb el nostre model, vam identificar dos loci 'latents' en l'estat basal (Potenciadors 3 i 4) que es van transformar en un estat "actiu" durantmemòriaformació (fig. 2f). D'altra banda, es va trobar que el potenciador putatiu 1 estava "preparat" en l'estat basal i es va tornar actiu, on hi va haver un augment estable significatiu en els marcadors H3K27ac durant la fase tardana i la memòria (fig. 2f). En conjunt, aquestes dades indiquen que el repertori de potenciadors recentment accessibles es va ampliar en les neurones d'engrama potenciades, on les regions latents o primes van guanyar marques H3K4me1 i H3K27ac i, per tant, es van convertir en potenciadors actius.
Per entendre el paper funcional dels promotors i regions potenciadores accessibles, vam realitzar anàlisis d'enriquiment de motius (Taula suplementària 4). Les nostres dades indiquen que la majoria (70%) dels motius sobre promotors accessibles estan igualment enriquits i s'identifiquen en totes les fases dememòria(Dades ampliades fig. 2e). En canvi, la majoria dels llocs potenciadors van mostrar diferents patrons de motius d'unió de factors de transcripció (TF) en diferents fases de memòria. Curiosament, els motius expressats omnipresentment de la família jun proto-oncogena, subunitat del factor de transcripció Ap-1 (és a dir, Jun-Ap1), i la família de TFs del factor regulador X (Rfx), es van enriquir significativament només després de la fase inicial de codificació (Dades ampliades fig. 2e). Anteriorment es va informar que el complex Jun-Ap1 juga un paper central en la selecció de potenciadors i podria actuar com un TF pioner per definir llocs potenciadors durant el desenvolupament cerebral i l'activitat neuronal12,24. Aquestes troballes són consistents amb les nostres dades que van mostrar un alt percentatge de loci latent / primed en l'estat basal (Fig. 2f, Dades esteses fig. 2c,d). Per tant, sembla que l'activitat neuronal podria desencadenar la unió de Jun-Ap1 als potenciadors latents, que després recluta modificadors de cromatina que activen potenciadors latents. De la mateixa manera, l'enriquiment dels motius del factor de transcripció Yin Yang 1 (Yy1) només en potenciadors dels estats primerencs i tardans, suggereix que l'organització promotora-potenciadora és un procés actiu dememòriaformació, com es va informar recentment que Yy1 facilita la formació d'aquestes interaccions de llarg abast25. Col·lectivament, aquestes dades suggereixen que la fase inicial dememòriaLa formació altera el paisatge d'accessibilitat de la cromatina en neurones activades, amb canvis estables de llarga durada que es produeixen predominantment dins de les regions millorants.
Canvis dinàmics en l'arquitectura nuclear espacial i l'accessibilitat de la cromatina durant la inicialmemòriaformació es corresponen amb un augment de la freqüència d'interaccions promotor-potenciador durantmemòriarecordar
L'arquitectura 3D nuclear està emergint com un factor clau en la regulació dinàmica de l'expressió gènica, en moltes funcions neuronals26-28. Per tant, ens interessava delinear els canvis precisos que es produeixen en l'organització espacial de la cromatina durantmemòriaformació i consolidació. Hem produït dades Hi-C a partir de neurones d'estat basal i eYFP+ etiquetades (primerenc i -tardà, Taula suplementària 5). La cromatina està segregada en dos compartiments subnuclears espacialment diferents, 'A' i 'B', corresponents a la cromatina transcripcionalment activa i inactiva, respectivament15, 16,26. Les primeres evidències suggereixen que l'activitat neuronal i la senyalització extrínseca podrien induir una reorganització de l'arquitectura 3D -cromatina14,27,28. El nostre compartiment d'estat15, 16,26 (fig. 3a-c) va revelar la re-localització de grans segments de cromatina des d'inactius (B) fins a l'entorn permissiu (A) (i viceversa) durant la fase inicial i tardana dememòriaformació (212 segments van canviar d'A a B, 127 de B a A, mida mitjana de ~ 436Kbp). Curiosament, el 52% de les regions de la primera fase que van canviar de B a A van mantenir aquest estat en la fase final (és a dir, es va mantenir en l'estat A, fig. 3b,c; Taula complementària 6). A més, gairebé totes aquestes regions es van superposar amb els DARs guanyats de la nostra anàlisi ATAC-seq, confirmant la transició del sub-compartiment d'inactiu a l'entorn permissiu (Fig.3d). Aquestes dades indiquen que alguns loci experimenten un canvi de sub-compartiment a través de diferents fases de memòria, i per tant podria contribuir a canvis a llarg termini en les propietats neuronals i la funció després de l'activació inicial.
Tot i que les nostres dades hi-C suggerien una reorganització a gran escala, no estava clar si aquesta reorientació va permetre la interacció de nous repertoris promotor-potenciadors i l'afinació de diferents programes transcripcionals (fig. 3e). Mitjançant l'ús de la tècnica d'hi-C de captura promotora (pc-HiC), vam estudiar els canvis precisos que es produeixen en les interaccions promotor-potenciadors durant el procés dememòriaFormació i record. Per a aquest estudi, hem utilitzat "esquers" dissenyats a mida dirigits a ~ 5000 promotors29. D'acord amb publicacions anteriors29, hem detectat ~19.000 (per grup) promotors-potenciadors significatius (67,5%) i promotors-promotors (46,2%) interaccions (Dades ampliades fig. 3a,b).
Atès que els promotors del cervell dels mamífers podrien estar sota el control de múltiples elements reguladors14,30,31, vam analitzar la superposició entre tots els potenciadors que interactuen i els seus respectius promotors. Hem constatat que durant cadamemòriafase, els mateixos promotors interactuen amb més freqüència amb un subconjunt diferent de potenciadors (és a dir, únic, Basal - 3243, Early - 7602, Late - 7028, Reactivat – 7244; Fig. 4a,b; Dades ampliades Fig. 3c; Taula complementària 7). Aquest resultat és coherent amb publicacions anteriors que mostren que múltiples potenciadors que envolten diversos gens (c-Fos i Arc) són crucials per a la seva activació i la seva freqüència d'interacció amb els seus respectius promotors s'altera en resposta a diversos agents despolaritzants en neurones cultivades31. També vam identificar un subconjunt més petit d'interaccions en què els promotors interactuaven amb els mateixos potenciadors a través de diferentsmemòriafases (és a dir, comunes, ~ 31% de totes les interaccions; Taula complementària 7). A més, les neurones reactivades van presentar puntuacions d'interacció significativament més fortes (segons el càlcul de Chicago, fig. 4b; Fig.3d de dades esteses). Per tant, tot i que el nombre d'interaccions úniques va ser similar en els estats primerencs, tardans i reactivats, les puntuacions d'interacció més fortes indiquen que les interaccions específiques promotor-potenciador es produeixen amb més freqüència durant la memòria.
recordar. Aquesta noció va ser validada per experiments 3C, amb imprimacions dissenyades per mesurar la freqüència d'interacció entre el potenciador seleccionat (E) i els promotors de gens (P) que codifiquen per al factor d'iniciació de la traducció eucariota 3 subunitat D (Eif3d) o receptor de glutamat, ionotròpic, kainat 3 (Grik3) (Fig. 4c). Les nostres dades van mostrar que les neurones reactivades van tenir un augment significatiu en la freqüència d'interacció entre el promotor Eif3d i el potenciador seleccionat, en comparació amb les altres poblacions (fig. 4c). Col·lectivament, aquestes dades indiquen que les interaccions promotor-potenciador es produeixen amb més freqüència durantmemòriarecordar.
A continuació, ens vam preguntar si les interaccions dinàmiques de llarg abast identificades a través de pc-HiC corresponen a regions de cromatina que es fan més accessibles, tal com es determina a través d'ATAC-seq. Això confirmaria que l'augment de l'accessibilitat té una conseqüència funcional en provocar noves interaccions promotor-potenciador. Per aconseguir-ho, vam comparar la superposició entre potenciadors d'interacció en cada població cel·lular amb DARs (observats) o un conjunt aleatori de loci genòmic accessible (esperat). La nostra anàlisi va revelar una superposició significativa entre els DARs guanyats en neurones activades-primerenques i els DARs guanyats de manera significativa amb els potenciadors que interactuen, en totes les poblacions cel·lulars (Totes les Ps< 0.0001,="" extended="" data="" fig.="" 3e).="" in="" contrast,="" changes="" in="" chromatin="" accessibility="" that="" occurred="" during="" the="" late="" phase="" of="">memòriala consolidació i reactivació no es van superposar significativament amb els potenciadors que interactuen (Extended Data Fig. 3e). Junts, aquests resultats indiquen que el guany de l'accessibilitat durant la codificació de memòria és un esdeveniment d'imprimació i aquests locis preparats participen en interaccions funcionals promotor-potenciador des-novo durant les fases posteriors dememòriaformació. Aquest paisatge dinàmic s'il·lustra visualitzant les regions genòmiques al voltant del factor d'iniciació de la traducció eucariota 5 subunitat A (Eif5a) (fig. 4d). Aquesta dissecció molecular temporal de la vida útil de l'engrama posa de manifest com es coordina l'imprimació de l'estat epigenètic d'una cèl·lula durantmemòriala codificació i consolidació facilita les interaccions a llarg termini durant la reactivació.
