Part 1 Efectes preventius dels glucòsids de feniletanol de Cistanche Tubulosa sobre la fibrosi hepàtica induïda per l'albúmina sèrica bovina en rates

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

Resum

Antecedents:Cistanche tubulosa és una medicina herbal tradicional xinesa que s'utilitza àmpliament per regular la immunitat.Glicòsids de feniletanol de cistanche(CPhG) d'aquesta planta són els materials principalment eficaços. L'objectiu d'aquest estudi era avaluar els efectes preventius i terapèutics dels CPhG sobre la fibrosi hepàtica induïda per BSA en rates i els mecanismes moleculars relacionats que impliquen cèl·lules estelades hepàtiques. Biejiarangan (BJRG), una altra medicina tradicional xinesa a base d'herbes, es va utilitzar com a control positiu. Mètodes: en experiments in vivo, 75 rates SD es van dividir aleatòriament en 6 grups: normal (tractat amb aigua destil·lada), model (tractat amb BSA), fàrmac positiu (tractat amb BSA més BJRG 60{{29} } mg/kg/dia), i els grups tractats amb BSA més CPhG (125, 250 i 500 mg/kg/dia). Els índexs de fetge i melsa, nivells sèrics d'aspartat aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT), àcid hexadecenoic (HA), laminina (LN), procol·lagen tipus III (PCIII), col·lagen tipus IV (IV-C), hidroxiprolina ( Hyp) i el factor de creixement transformant 1 (TGF- 1) es van mesurar en fetges de rata. Es van avaluar els graus histopatològics de la fibrosi hepàtica per a cada grup mitjançant la tinció de tricrom de H&E i Masson. L'expressió de TGF- 1, col·lagen I (Col-I) i col·lagen III (Col-III) es va determinar mitjançant un mètode de tinció immunohistoquímica. Aquests efectes es van avaluar més in vitro determinant els nivells d'expressió de NF-κB p65 i Col-I mitjançant anàlisis quantitatives de PCR en temps real. L'expressió de la proteïna Col-I també es va examinar mitjançant western blotting. Resultats: tots els grups de dosis (125, 250 i 500 mg/kg/dia) de CPhG van reduir significativament l'índex de fetge i melsa, van disminuir els nivells sèrics d'ALT, AST, HA, LN, PCIII, IV-C, Contingut TGF- 1 (P <0,01, p=""><0,01 i="" p=""><0,01) i="" contingut="" hyp.="" els="" cphg="" també="" van="" alleujar="" notablement="" la="" inflamació="" de="" les="" cèl·lules="" hepàtiques="" i="" van="" prevenir="" eficaçment="" la="" necrosi="" dels="" hepatòcits="" i="" la="" infiltració="" de="" cèl·lules="" inflamatòries.="" els="" resultats="" immunohistoquímics="" van="" mostrar="" que="" els="" cphg="" van="" reduir="" significativament="" l'expressió="" de="" tgf-="" 1="" (p=""><0, 01,="" p="">< 0,="" 01="" i="" p="">< 0,="" 01),="" col-i="" i="" col-iii.="" els="" efectes="" in="" vitro="" dels="" cphgs="" (100,="" 75,="" 50="" i="" 25="" ug/ml)="" sobre="" hsc-t6="" van="" demostrar="" que="" els="" cphg="" van="" reduir="" significativament="" l'expressió="" d'arnm="" de="" nf-κb="" p65="" i="" col-i,="" i="" els="" cphg="" també="" van="" reduir="" l'expressió="" de="" la="" proteïna="" col-i.="" conclusions:="" els="" cphg="" tenen="" un="" efecte="" anti-fibrosi="" hepàtic="" important="" i="" es="" poden="" utilitzar="" com="" a="" agents="" hepatoprotectors="" per="" al="" tractament="" de="" la="" fibrosi="">

Paraules clau: fibrosi hepàtica, Cistanche tubulosa, glucòsid de feniletanol, quimiocina BSA, prevenció i teràpia.

Fons

La fibrosi hepàtica és una resposta de cicatrització de ferides a una lesió hepàtica greu que es produeix en la patogènesi de l'hepatitis crònica induïda per diversos factors. Aquests factors són la infecció viral, l'abús d'alcohol, la colèstasi i les malalties metabòliques i autoimmunes [1–3]. L'acumulació progressiva de la matriu extracel·lular (ECM) i la reducció de la remodelació altera l'arquitectura normal del fetge, donant lloc a fibrosi hepàtica [4]. La fibrosi hepàtica és fonamental en la malaltia hepàtica crònica i sovint es converteix en cirrosi i carcinogènesi irreversibles. Actualment, no hi ha mètodes ni fàrmacs efectius per al tractament de la fibrosi hepàtica. Per tant, és urgent trobar un fàrmac contra la fibrosi hepàtica que atenui la progressió de la lesió hepàtica a fibrosi i càncer.Cistanche tubulosaW (de la família Orobanchaceae) és una planta parasitària que es cultiva àmpliament a la regió sud de Xinjiang a la Xina [5]. Les persones solen utilitzar-lo per vigoritzar els ronyons, nodrir la sang, relaxar l'intestí i retardar la senescència. Està catalogat oficialment a la Farmacopea Xinesa [6]. C. tubulosa conté una varietat de components actius. Això inclouGlicòsids de feniletanol de cistanche(CPhGs), iridoides i polisacàrids. Com un dels molts components actius deC. tubulosa, els CPhG han mostrat efectes convincents antioxidants, antifatiga, neuroprotectors i antiinflamatoris tant en estudis in vivo com in vitro [7]. En els darrers anys, s'ha informat que els CPhG(Glicòsids de feniletanol de cistanche) tenen efectes hepatoprotectors. Els mecanismes potencials subjacents a aquests efectes són l'eliminació de radicals lliures, la protecció de les membranes hepàtiques, la immunoregulació, la inhibició de l'apoptosi, la inhibició de l'expressió d'HBsAg i HBeAg i la inhibició de la replicació de l'ADN del VHB i altres [8-11]. Tanmateix, pocs estudis a la literatura aborden l'efecte anti-fibrosi hepàtica dels gràfics. Per tant, aquest estudi tenia com a objectiu investigar l'efecte anti-fibrosi hepàtica dels GPhC mitjançant l'ús d'un model de fibrosi hepàtica induïda per l'albúmina sèrica bovina (BSA) en rates. Es van investigar mecanismes moleculars relacionats a les cèl·lules HSC-T6.

Mètodes

Productes químics i reactius

Es va comprar un kit d'hidroxiprolina (hidròlisi alcalina) (Lot: 20140616) al Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Xina). Els kits ELISA de sandvitx de Rat TGF- 1 (Lot: 238240615) es van comprar a Lianke Biotech Co., Ltd. (Xina). Beijing Biosynthesis Biotechnology Co. va proporcionar l'anticòs Rabbit Anti-Collagen I (Lot: 140619), l'anticòs Rabbit Anti-Collagen III (Lot: 980788 W) i l'anticòs Rabbit Anti-TGF- 1 (Lot: 140619), LTD (Xina). Tancat amb sèrum d'ovella normal (fluid de treball) (lot: WP141214), PV-6000 (lot: WK141225) i kit DAB (lot: K136621D) es van comprar a Zhongshan Golden Bridge Biotech Co., Ltd. (Xina) . La detecció d'anticossos primaris es va realitzar utilitzant 2. Solució d'anticossos (Alk-Phos. Conjugated, Anti-conill) i 2. Solució d'anticossos (Alk-Phos. Conjugated, Anti-ratolí) (lot: 272387) comprada a Invitrogen Company (EUA). ). L'albúmina sèrica bovina (BSA) (Lot: SLBG8239V) es va comprar a Sigma (EUA). Abans del seu ús, el BSA es va preparar a 18 g/L en solució salina normal, els bacteris es van eliminar per filtració i el BSA es va emmagatzemar a 4 graus. L'adjuvant incomplet de Freund que contenia 1 g de lípid de pèl d'ovella (Lot: AF0220LA14, Shanghai Yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (Xina)) es va barrejar amb 2 g de parafina líquida (Lot: 20130815, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd. (Xina), esterilitzat en un autoclau de vapor i emmagatzemat a 4 graus. El fàrmac positiu BJRG es va obtenir com a pastilles de Biejiarangan de Inner Mongolia Furui Medical Science Co., Ltd. (Xina). Les existències de fàrmacs BJRG es van preparar mitjançant la dissolució Comprimits de BJRG en aigua destil·lada a una concentració de 600 mg/kg.

Materials vegetals

C. tubulosa(família Orobanchaceae) es va comprar a la regió de Minfeng de Xinjiang de la Xina. El material va ser autenticat per l'investigador Jun Zhao, Laboratori Clau de Medicina Uigur, Institut de Matèria Mèdica de Xinjiang. Els exemplars de val es van dipositar a l'Institut de Matèria Mèdica de Xinjiang.

Preparació de CPhGs(Glicòsids de feniletanol de cistanche)

Rizomes secs i tallats a rodanxesC. tubulosa(6,0 kg) es van extreure consecutivament a reflux tres vegades amb etanol al 70 per cent, i es va eliminar el dissolvent per produir l'extracte d'etanol. Els extractes d'etanol es van purificar mitjançant la resina AB-8 per obtenir els glucòsids de feniletanol (CPhG). Les solucions d'emmagatzematge de CPhG utilitzades per a diferents grups de dosis en estudis amb animals (500 mg/kg, 250 mg/kg i 125 mg/kg, respectivament) es van dissoldre en un 0,5 per cent (5 g/L) de carboximetil cel·lulosa (sal de sodi).

Quantificació de CPhGs(Glicòsids de feniletanol de cistanche)

El contingut de dos components (echinacòsid i acteòsid) als CPhG es va determinar mitjançant HPLC mitjançant un mètode informat anteriorment (Zhang et al. 2004) [12]. L'HPLC es va realitzar mitjançant un LC Shimadzu-10A HPLC equipat amb un detector d'UV. La columna HPLC era una columna Phenomenex Gemini ODS (250 × 4,6 mm, 5 μm). La fase mòbil isocràtica consistia en metanol-acetonitril -1 per cent d'àcid acètic (15:10:75, v/v/v). L'elució va ser durant 40 min i el cabal es va mantenir a 0, 6 ml/min. La temperatura de la columna es va mantenir constant a 30 graus. La detecció UV va ser a 334 nm.

Animals i línia cel·lular HSC-T6

[Grau SPF] es van comprar rates Sprague–Dawley (SD) mascles adults sans (180–220 g) al Xinjiang Medical University Animal Center, número de llicència: SCXK (nou) 2011–0004. Les rates van ser alimentades amb menjar lliure de patògens específics (SPF). Tots els procediments relacionats amb els experiments amb animals van ser aprovats pel Comitè d'Ètica Animal del Primer Hospital Afiliat de la Universitat Mèdica de Xinjiang. Les rates es van allotjar en gàbies en condicions ambientals controlades (25 graus i un cicle de 12 h de llum/foscor) i tenien accés gratuït a menjar de pellets de rates estàndard i aigua de l'aixeta. Les rates es van aclimatar abans del tractament. Es va obtenir una línia cel·lular estelada hepàtica de rata immortalitzada, HSC-T6, de Wuhan Procell Gene Biotechnology Co., LTD. (Wuhan, Xina). Les cèl·lules HSC-T6 es van cultivar al mitjà d'àguila modificat de Dulbecco (glucosa alta) (DMEM, Pequín, Xina) complementat amb sèrum boví fetal al 10% (Gibco, Amèrica del Sud), 100 UI/ml de penicil·lina i 100 ug/ml d'estreptomicina (Beijing). , Xina) en una incubadora humidificada a 37 graus amb un 5 per cent de CO2.

Tractaments i lesions hepàtiques induïdes per BSA

Setanta-cinc rates SD es van dividir aleatòriament en sis grups: normal (tractat amb aigua destil·lada), model (tractat amb BSA), fàrmac positiu (tractat amb BSA més BJRG 600 mg/kg/dia) i tractat amb BSA més CPhG.(Glicòsids de feniletanol de cistanche)(125, 250, 5{{20}}0 mg/kg/dia) grups. Els grups tractats amb BSA més CPhGs (125, 250, 500 mg/kg/dia) tenien 13 rates a cada grup, i l'altre grup tenia 12 rates a cada grup. El model de lesió hepàtica induïda per BSA es divideix en sensibilització primària seguida d'un atac immunològic) [13]. Excepte el grup normal, als altres grups se'ls va administrar múltiples injeccions subcutànias amb 0,5 ml (9 mg/ml) d'adjuvant incomplet de BSA Freund el dia 1, el dia 15, el dia 22, el dia 29 i el dia 36 per a la sensibilització primària. Set dies després de la cinquena injecció, es va obtenir sang a través del plexe de la vena de la retina de rata i es va provar els anticossos d'albúmina sèrica. L'anticossos BSA en sèrum de rata es va detectar mitjançant un mètode de difusió de doble agar. La injecció d'atac es va realitzar mitjançant l'administració de 0, 4 ml de BSA en solució salina normal a través de la vena caudal en rates positives amb anticossos BSA dues vegades per setmana durant deu vegades. Les concentracions i els temps de les injeccions van ser 5.00, 5.50, 6.00, 6.50, 7.00, 7.50, 8.50, 9.00, 9.50 i 10.00 g/L el dia 46, el dia 50, el dia 53, el dia 57, el dia 60, el dia 64, el dia 67, el dia 71, el dia 74 i el dia 78, respectivament. Al grup normal, es va utilitzar solució salina normal per a injeccions immunològiques primàries (sensibilització) i secundàries (atac) en lloc de BSA, i altres condicions eren les mateixes que les del grup model. Al grup normal se li va administrar per via oral aigua destil·lada amb una dosi de 10 ml/kg/dia. Al grup model se li va administrar per via oral una solució de CMC-Na al 0,5 per cent de 10 ml/kg/dia. El grup de fàrmacs positius es va administrar per via oral 600 mg/kg/dia de BJRG. Els CPhG tractats amb BSA més (125,

250 i 500 mg/kg/dia) es van administrar per via oral CPhG de 125, 250 i 500 mg/kg/dia(Glicòsids de feniletanol de cistanche), respectivament. Les rates de dosificació diària van continuar durant dues setmanes després de l'última injecció. Després del període experimental, les rates es van dejunar durant 12 hores abans d'hidratar-se el 10% de cloral i després es van sacrificar immediatament. Es van recollir mostres de sèrum de cada rata i es van utilitzar immediatament. Els fetges es van recol·lectar amb dos finalitats: (1) conservació en nitrogen líquid per als kits Hyp i (2) fixació en formaldehid al 10 per cent per a exàmens histològics i immunohistoquímics. La durada total dels estudis amb animals va ser de 93 dies.

Índexs hepàtics i de melsa

El fetge i la melsa es van dissecar per laparotomia i es van rentar amb solució salina normal de 4 graus. Després d'absorbir l'excés d'aigua amb paper de filtre, es van pesar el fetge i la melsa per calcular els índexs corresponents: pes relatiu de l'òrgan=massa d'òrgans (g)/massa corporal individual (g) × 100 per cent [14].

Experiments amb cèl·lules

Les cèl·lules HSC-T6 es van xapar en una placa 96-pou. Inicialment, les cèl·lules es van cultivar amb DMEM que contenia un 10 per cent de FBS durant 48 h. A continuació, el medi es va substituir per DMEM sense FBS per morir de fam les cèl·lules durant 12 h. A continuació, es van cultivar les cèl·lules amb DMEM que contenia 5, 0 ng/mL de TGF - 1 (sense FBS) durant 24 h. Finalment, diferents concentracions de CPhG(Glicòsids de feniletanol de cistanche)(100 ug/ml, 50 ug/ml i 25 ug/ml), acteòsid (6 ug/ml, 3 ug/ml i 1,5 ug/ml) i equinacòsid (500 ug/ml, 250 ug/ml i 125 ug/ml) es van realitzar a la placa en pous quadruplicats i es van incubar durant 48 h.

Anàlisi PCR en temps real

El nivell d'expressió d'ARNm de NF-κB, p65 i col·lagen I es va determinar mitjançant PCR en temps real. Per determinar les expressions d'ARNm a les cèl·lules HSC-T6, les cèl·lules (4 × 105 cèl·lules) es van sembrar en plaques de sis pous amb 3 ml de DMEM amb un 10 per cent de FBS i es van incubar durant la nit a 37 graus i un 5 per cent de CO2, després de la qual cosa el medi de cultiu cel·lular. es van canviar a DMEM sense sèrum. A continuació, CPhGs(Glicòsids de feniletanol de cistanche)(100 ug/ml, 50 ug/ml i 25 ug/ml), acteòsid (6 ug/ml, 3 ug/ml i 1,5 ug/ml) i equinacòsid (500 ug/ml) , 250 ug/ml i 125 ug/ml) es van afegir als pous. Després de 48 h d'incubació amb CPhGs o composicions monomèriques, es va extreure l'ARN total mitjançant el reactiu TRIzol (Invitrogen, EUA) i es va agitar vigorosament amb cloroform durant 15 s. Després d'estar assegut a temperatura ambient durant 3 minuts, el lisat es va centrifugar a 12,000 × g durant 15 minuts a 4 graus. L'ARN de la fase aquosa es va precipitar amb isopropanol i la fase aquosa superior es va transferir a un nou tub de microcentrífuga. L'ARN es va precipitar afegint un 0,75 per cent d'etanol, després del qual el tub de microcentrífuga es va centrifugar a 12,000 × g a 4 graus durant no més de 5 min. Es va eliminar el sobrenedant i l'ARN es va assecar a temperatura ambient durant 5-10 min. Conjunts específics d'encebadors (Sangon, Xangai, Xina) que es van utilitzar per a l'amplificació de l'actina de rata [GenBank: NM_031144.3], Collagen I [GenBank: NM{_ 053304.1] i NF Els gens -κB p65 [GenBank: NM_199267.2] es van dissenyar mitjançant Batch Primer 3. Els primers directes (fw) i inversos (rv) eren els següents: Col·lagen I (fw: GGA GAG AGC ATG ACC GAT GG , rv: GGG ACT TCT TGA GGT TGC CA), NF-κB p65 (fw: CAT ACG CTG ACC CTA GCC TG, rv: TTT CTT CAA TCC GGT GGC GA), -actina (fw: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GAT G, rv: AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A). Els resultats es van normalitzar a l'ARNm del gen de la casa -actina com a control intern i es presenten com a nivells d'ARNm relatius. Les reaccions es van realitzar amb 8 μL iQ SYBR Green Supermix, 1 μL 10 pM parell d'imprimadors, 8,5 μL d'aigua destil·lada i 2,5 μL d'ADNc. Cada reacció en cadena de la polimerasa es va realitzar en les condicions següents: 95 graus durant 3 min, després 40 cicles de 10 s a 95 graus, 30 s a 55 graus i 10 s a 55 graus - 95 graus per a l'extensió, seguit d'una mesura de fluorescència única. . Els resultats finals es van descriure amb els valors relatius (2-ΔΔCt). El càlcul i l'anàlisi es van realitzar mitjançant el sistema de detecció de PCR en temps real iQ5.

Anàlisi Western blot

Els nivells d'expressió de proteïnes de col·lagen I (Abcam, Cambridge, Regne Unit, Art No: ab34710) es van determinar mitjançant Western blotting [amb -actina (Lot: 60008-1-lg; Proteintech, Xina) com a control de neteja. Els extractes de cèl·lules senceres es van preparar mitjançant l'assaig de radioimmunoprecipitació (RIPA) (Thermo Scientific, EUA) amb un còctel d'inhibidor de proteasa Halt a l'1 per cent (Thermo Scientific, EUA) i còctels inhibidors de la fosfatasa Halt a l'1 per cent (Thermo Scientific, EUA). La concentració de proteïnes es va mesurar i quantificar pel mètode Bradford [18]. La proteïna (10-50 ug) es va separar en un gel SDS-PAGE al 10% i es va transferir a membranes PVDF (Millipore, EUA). Les membranes es van bloquejar durant 1 h a temperatura ambient amb un 5 per cent de BSA i els anticossos primaris (anticòs Anti-Colla gen I, dilució 1:200 o mAb de ratolí de -actina, dilució 1:5000) es van incubar a 4 graus durant la nit. El corresponent Alk-Phos. Els anticossos secundaris conjugats es van incubar a temperatura ambient. Finalment, les membranes es van rentar tres vegades amb 1 × Tris-HCl salina amb un 0, 1 per cent de Tween 20, i els senyals es van escanejar i visualitzar mitjançant el sistema d'imatges GEL DOC XR (Bio-Rad). Es va realitzar una anàlisi densitomètrica de les proteïnes d'interès i es va normalitzar a -actina mitjançant el programari GEL DOC Image Studio (Bio-Rad). -L'actina es va utilitzar com a control intern.

Anàlisi estadística

La prova de normalitat de Shapiro-Wilk i la prova d'homogeneïtat de la variància de Levene es van aplicar per verificar la normalitat i You et al. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences (2015) 23:52 Pàgina 4 de 13homogeneïtat de la variància. Es va utilitzar l'anàlisi de variància (ANOVA) seguida de la prova post hoc de Tukey per identificar diferències estadístiques de dades no homogènies i distribuïdes normalment. La prova no paramètrica de Kruskal-Wallis es va utilitzar per analitzar dades no distribuïdes normalment o homogènies. Els resultats es van expressar com a mitjana ± SD. La importància es va establir a P <0,05. totes="" les="" dades="" es="" van="" analitzar="" mitjançant="" el="" programari="" spss="" 16.0="" (xinjiang="" medical="">

Resultats

Determinació quantitativa de CPhG

Els CPhG de C. tubulosa contenen dos glucòsids d'alcohol feniletílic, equinacòsid i acteòsid, i el seu contingut en els CPhG es va determinar mitjançant l'anàlisi HPLC (Fig. 1) que era de 42,71 ± 0,42 per cent i 14,27 ± {{7. }},18 per cent, respectivament.

Índexs hepàtics i de melsa

Tal com es va mostrar a la taula 1, els índexs de fetge i melsa del grup model es van elevar significativament [P <0.01, p=""><0, 05).="" els="" índexs="" de="" fetge="" i="" melsa="" del="" fàrmac="" positiu="" bjrg="" i="" cphg="" a="" diferents="" grups="" de="" dosis="" es="" van="" reduir="" significativament="" en="" comparació="" amb="" el="" grup="" model="" [pliver="0.004," pliver="0.003," pliver="0." 004,="" pliver="0,005;" pspleen="0.017," pspleen="0.027," pspleen="0.024," pspleen="" {="0.070," respectivament].="" els="" índexs="" de="" fetge="" i="" melsa="" eren="" més="" baixos="" que="" els="" del="" grup="">

Efectes dels CPhG sobre les activitats ALT, AST i marcadors de fibrosi hepàtica

En el present estudi, els nivells sèrics dels enzims hepàtics AST i ALT van augmentar significativament en el grup model, reflectint el dany hepatocel·lular en rates de fibrosi hepàtica induïda per BSA. Tanmateix, els experiments.

va demostrar que el tractament amb BJRG (600 mg/kg) i CPhG (125, 250 i 5{{10}}0 mg/kg) va reduir significativament l'AST [PASSAT < 0.0{{{60}}1,="" past=""><0,001, past=""><0,001, past=""><0,001 ,="" respectivament]="" i="" alt="" [palt="0.117," palt="0.139," palt="0.189," palt="" {="0.255," respectivament]="" en="" rates="" de="" fibrosi="" hepàtica="" .="" (taula="" 2).="" els="" nivells="" d'ha,="" ln,="" pc="" i="" iv-c="" en="" rates="" model="" es="" van="" augmentar="" significativament="" [pha=""><0,001, pln=""><0,001, ppciii="0,002," piv-c=""><0,001, respectivament).="" en="" comparació="" amb="" el="" grup="" de="" models,="" els="" nivells="" d'ha="" [pha="0.009," pha="0.007," pha="0.009," pha="0.023," respectivament],="" ln="" [pln="0,011," p="" ln="0,004," p="" ln="0,026," p="" ln="0,069," respectivament],="" pc="" iii="" [p="" pciii="" {="" {47}}.006,="" p="" pciii="0.067," p="" pciii="0.136," p="" pciii="0.296," respectivament]="" i="" iv-c="" [p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c=""><0,001, p="" iv-c=""><0,001, p="" iv-c=""><0,001, respectivament]="" en="" rates="" es="" va="" reduir="" notablement="" per="" bjrg="" (600="" mg/kg)="" i="" cphg="" en="" diferents="" grups="" de="" dosis="" (125,="" 250="" i="" 500="" mg/kg)="" (taula="" 3).="" el="" contingut="" d'hyp="" i="" el="" contingut="" de="" col·lagen="" de="" tgf-="" 1="" també="" es="" va="" detectar="" mesurant="" els="" nivells="" d'hyp="" al="" teixit="" hepàtic.="" com="" es="" mostra="" a="" la="" taula="" 4,="" la="" mitjana="" de="">El nivell del grup model va ser significativament més alt que el grup normal, però va disminuir notablement en el grup BJRG i els diferents grups de dosi de CPhG. La concentració hepàtica de TGF{{0} del grup model en rates va augmentar significativament [P <0.001]. en="" comparació="" amb="" el="" grup="" model,="" els="" nivells="" de="" tgf-="" 1="" del="" fàrmac="" positiu="" i="" els="" diferents="" grups="" de="" dosis="" de="" cphg="" es="" van="" reduir="" notablement="" [p="" tgf-="" 1=""><0,001, p="" tgf-="" 1=""><0,001, p="" tgf-="" 1=""><0,001, ptgf{-="" 1=""><0,001, respectivament].="" els="" resultats="" es="" resumeixen="" a="" la="" taula="">

Exploració histopatològica

Les observacions de seccions de teixit hepàtic normal tenyides amb H&E i el tricrom de Masson presenten diferents lòbuls hepàtics i sinusoides hepàtics. L'estructura del teixit hepàtic de les rates model estava alterada i el teixit hepàtic i els sinusoides hepàtics es van substituir per una gran quantitat de teixit connectiu. Tanmateix, es va detectar una citoarquitectura més normal i menys teixit connectiu al grup de tractament que els del grup model.

Tinció H&E

En el grup normal, es va observar integritat estructural del lòbul hepàtic sense àrees portals anormals i sinusoides hepàtics. Els cordons hepàtics estaven disposats de manera ordenada, amb el nucli rodó i clar. Els nuclis es troben al centre de la cèl·lula, amb abundant citoplasma. Només la zona portal té una petita quantitat de teixit fibrós (Fig. 2a). Al grup del model, l'estructura lobular va quedar greument danyada. Les cèl·lules hepàtiques van mostrar una degeneració aquosa lleu, principalment degeneració en globus i/o degeneració grassa. També es va observar la formació d'infiltració de cèl·lules inflamatòries, una hiperplàsia extensa del teixit fibrós, la formació d'un gran nombre de septe fibrós, lòbuls dividits i una proliferació significativa de cèl·lules hepàtiques. Aquestes observacions van confirmar l'èxit de l'establiment del model animal de lesions immunitàries de la rata de fibrosi hepàtica (Fig. 2b). En comparació amb el grup model, es va produir una reducció de la infiltració de cèl·lules inflamatòries en els diferents CPhG. També es va observar menys necrosi i degeneració grassa de les cèl·lules hepàtiques, així com alleujament de la fibrosi. Els CPhG van mitigar significativament la patologia de la fibrosi hepàtica induïda per BSA a les rates, van alleujar la inflor de les cèl·lules hepàtiques i van prevenir eficaçment la necrosi dels hepatòcits i la infiltració de cèl·lules inflamatòries, cosa que suggereix que els CPhG exerceixen un efecte protector sobre la fibrosi hepàtica de rata induïda per BSA. (Fig. 2c–f). Tinció de tricrom de Masson En el grup normal, el teixit hepàtic era normal. L'àrea del portal hepàtic mostrava un petit nombre de fibres de col·lagen blau i el teixit hepàtic estava estructurat normalment (Fig. 3a). En comparació amb el teixit hepàtic del grup normal, el teixit fibrós va proliferar pel folíol central i es va expandir al parènquima hepàtic. Fibres de col·lagen esteses i enllaçades i

envoltava tot el lòbul i envoltava la vena central. Aquests efectes, juntament amb la fibrosi dels hepatòcits, el dany estructural lobular, la fibrosi periportal i la formació de pseudolòbuls (Fig. 3b) van proporcionar proves que el model es va establir. En comparació amb el grup model, les fibres de col·lagen del grup de control positiu de fàrmacs es van estendre lleugerament cap a l'exterior des de la zona del portal perifèric (Fig. 3c). En comparació amb el grup model, les fibres de col·lagen dels diferents grups de dosis de CPhG es van reduir significativament, es va inhibir la proliferació de fibres i es va reduir significativament la proliferació de teixit fibrós dins del parènquima hepàtic. Aquests resultats van suggerir que els CPhG protegien les rates de la fibrosi hepàtica induïda per BSA (Fig. 3d-f).

Tinció immunohistoquímica

És important destacar que l'expressió del col·lagen tipus I i el col·lagen tipus III tenen un paper essencial en el desenvolupament de la fibrosi hepàtica, i la seva generació i deposició al teixit hepàtic podria servir com a determinant important de l'eficàcia anti-fibrosi hepàtica. Els resultats es resumeixen a la taula 5

Col·lagen tipus I

El grup normal expressava col·lagen tipus I principalment als vasos sanguinis i la zona portal. El grup model va expressar col·lagen tipus I fibrosi vascular a les zones portals. A l'espai de Disse, la tinció de col·lagen tipus I es va observar amb ratlles o com una distribució irregular. Septes fibrosos recoberts de col·lagen per formar pseudolòbuls. En aquests experiments, es van formar menys septes fibrosos per a BJRJ (600 mg/kg) i diferents grups de dosis de CPhGs (125, 250 i 500 mg/kg) [PCol I=0.002, PCol I {{ 6}},001, PCol I=0,023 i P Col I=0,044, respectivament]. Els resultats semicuantitatius van revelar que l'expressió del seu col·lagen tipus I era significativament menor en comparació amb el grup model (Fig. 4).

Col·lagen tipus III

El col·lagen tipus III es va expressar dèbilment en el grup normal, i les zones perifèriques que envolten les venes portal i hepàtiques mostraven una petita quantitat de color groc fi en lloc de fibres contínues (Fig. 5a). Al grup del model, les fibres de col·lagen presentaven cordons amples i gruixuts, cosa que indica una forta expressió, principalment localitzada a les zones del teixit portal i fibrós (Fig. 5b). Les fibres de col·lagen de BJRJ (600 mg/kg) i diferents grups de dosis de CPhG (125, 250 i 500 mg/kg) eren filamentosos i distribuïts per la vena central i les zones portal. En comparació amb el grup model, les fibres de col·lagen es van reduir significativament, la tinció era pàl·lida i fina i la tinció immunohistoquímica va ser feblement positiva (Fig. 5c-f). Aquests resultats semiquantitatius mostren que les cèl·lules expressades positivament en els grups de dosis positius i diferents [PCol III=0,015, PCol III=0,001, PCol III=0,010 i P Col III=0.037, respectivament] eren diferents dels del grup del model.

TGF- 1

Hi havia poca expressió de TGIF{{0}} a les cèl·lules normals del fetge de rata. L'expressió es limitava a un nombre reduït de cèl·lules intersticials (Fig. 6a). En el grup model, l'expressió de TGF- 1 es va distribuir àmpliament a la zona portal, espais fibrosos, cèl·lules estelades hepàtiques, cèl·lules inflamatòries, paret sinusoïdal i citoplasma. Una àrea del portal particular va mostrar una expressió fortament positiva amb una tinció de color groc marró (Fig. 6b). Hi va haver una petita quantitat d'expressió a l'àrea portal i septes fibrosos de BJRJ (600 mg/kg) i diferents grups de dosis de CPhGs (125, 250 i 500 mg/kg). L'extensió de la tinció positiva en aquests grups es va reduir significativament en comparació amb la del grup model. Es va reduir la tinció de les cèl·lules intersticials dels septes fibrosos i el citoplasma de les cèl·lules inflamatòries (Fig. 6c-f). Els resultats semiquantitatius van revelar que BJRJ i diferents grups de dosis de CPhG [P TGF- 1=0,001, P TGF{- 1 <0,001, p="" tgf{-="" 1="0,009," ptgf-="" 1="0" .004,="" respectivament]="" van="" ser="" significatius="" en="" comparació="" amb="" el="" grup="" model.="" com="" s'ha="" esmentat="" anteriorment="" a="" l'article,="" el="" tgf-="" 1="" és="" una="" citocina="" important="" en="" la="" fisiopatologia="" del="">

fibrosi, estimulant la producció de matriu extracel·lular [19]. Vam demostrar que el nivell de TGF- 1 va augmentar al grup model d'una manera coherent amb la gravetat de la fibrosi hepàtica. Els nivells d'expressió de TGF- 1 al fetge eren coherents amb els nivells sèrics de TGF- 1. Això indica que els CPhG poden reduir significativament la fibrosi hepàtica a causa de l'expressió de TGF- 1 participant en la síntesi i la degradació de l'ECM. L'expressió de col·lagen tipus I, col·lagen tipus III i TGF- 1 pot detectar el procés patològic de la fibrosi hepàtica. Els seus nivells d'expressió en els grups de tractament es van reduir significativament i van il·lustrar que els CPhG poden millorar l'activitat de la col·lagenasa, mantenint l'equilibri dinàmic de la síntesi i la degradació de l'ECM hepàtica, retardant i evitant així la formació de fibrosi hepàtica.