Part 2 Discriminació química i genètica de Cistanches Herba basada en UPLC-QTOF/MS i codi de barres d'ADN

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

OPLS-DA i identificació de marcadors Per identificar marcadors químics potencials per a la discriminació de les dues espècies, es va generar el diagrama S d'OPLS-DA (Fig. 3). A la trama S, cada punt representa un parell d'ions tR–m/z. Els eixos X i Y representen la contribució i la confiança de l'ió, respectivament; Com més lluny apunten la parella d'ions tR–m/z des de zero, més gran serà la contribució/confiança d'aquesta icona a la diferència entre els dos grups. Així, l'ió tR–m/z que apunta als dos extrems de la "S" representa els marcadors característics amb la confiança més alta de cada grup. Els resultats d'OPLS-DA van mostrar que es podria utilitzar UPLC-QTOF/MS per distingirCistanche deserticolades deCistanche tubulosa(Fig. 3). Es van determinar un total de sis marcadors creïbles i significatius per facilitar la discriminació d'aquests grups (taula 3). Es van assignar provisionalment les identitats de tres marcadors potencials. Els components correlacionats amb aquests tres ions es van identificar provisionalment com a isòmers de campneòsid II, cistanòsid C i cistanòsid A. Els compostos marcadors a, b i c es podrien utilitzar per distingir les dues espècies vegetals, ja que les intensitats d'ions de a i b enCistanche deserticolaera més alt que enCistanche tubulosa(Fig. 4A, 4B) i es va poder detectar el marcador cCistanche tubulosa, però no dinsCistanche deserticola(Fig. 4C).

Codi de barres d'ADN: informació de seqüències i eficàcia d'identificació

La informació de la seqüència es mostra a la taula 4. La distància genètica mitjana de psbA-trnH (0,1732) era més gran que les altres dues regions (0.0740 , 0,1197) significativament. El contingut mitjà de GC de psbA-trnH (20,64 per cent) era més petit que les altres dues regions (55,00 per cent, 55,00 per cent). Tot i que la taxa d'èxit d'ITS i ITS2 no es va obtenir en aquest estudi, la regió psbA-trnH va funcionar bé en l'amplificació i la seqüenciació de PCR (100 per cent, 87,23 per cent). L'eficiència d'identificació es va aconseguir mitjançant l'anàlisi BLAST1 i el mètode de la distància més propera, i reflectia principalment la taxa d'èxit dels codis de barres. La regió psbA-trnH era clarament superior a la dels altres dos codis de barres en eficiència d'identificació basada en dos mètodes. L'escassetat de seqüències és probablement el motiu pel qual la regió ITS va mostrar una eficiència d'identificació del 100% basada en el mètode BLAST1 i 0 segons el mètode de distància més propera.

Anàlisi de la divergència genètica mitjançant sis paràmetres

Es van utilitzar sis paràmetres per analitzar la variació intraespecífica i la divergència interespecífica mitjançant tres codis de barres (taula 5). La diferència significativa entre les variacions inter i intraespecífiques va ser indicativa de la utilitat dels codis de barres d'ADN. Aquí, la distància interespecífica mínima de tres codis de barres era superior a la distància intraespecífica màxima. A més, la regió psbA-trnH tenia una distància intraespecífica màxima i una distància interespecífica mitjana més grans que els altres dos codis de barres, cosa que indica que la regió psbA-trnH va funcionar bé en la discriminació de dos orígens de Cistanches Herba.

Anàlisi de la bretxa de codi de barres per identificar

Cistanche deserticolaiCistanche tubulosaLa bretxa de codi de barres presenta la variació notable d'inter i intraespècies i demostra distribucions separades i no solapades entre mostres intra i interespecífiques. En aquest estudi (Fig. 5), l'interval de distància es va establir en 0-0.45, perquè la distància K2P més gran de psbA-trnH entreCistanche deserticolaiCistanche tubulosaestava a prop de 0,45. Els tres codis de barres presentaven diferents llacunes en les distribucions de la variació intra i interespecífica. A més, la bretxa de psbA-trnH era significativament més gran que els altres dos codis de barres. Per tant, la regió psbA-trnH podria ser un codi de barres ideal per discriminar dos orígensCistancsHerba.

Arbre d'unió de veïns (NJ).

Un arbre de NJ il·lustra la relació entre espècies i facilita la determinació de la seva agrupació. En aquest estudi, es va construir un arbre NJ de tres codis de barres basat en el model K2P (Fig. 6). Els resultats van demostrar que dos orígens de Cistanches Herba es van agrupar en dos clades per separat. Així, l'arbre de NJ es va distingir claramentCistanche deserticolaiCistanche tubulosa.

Discussió i conclusions

Cistanches Herba és un material medicinal important que s'utilitza habitualment per nodrir la comunitat asiàtica [38]. Tanmateix, els dos orígens deCistancsHerba, Cistanche deserticolaiCistanche tubulosa, tenen diferents composicions químiques i activitats farmacològiques respectivament. Paral·lelament, els dos orígens difereixen en l'aplicació clínica i el mercat de productes bàsics. La classificació de Cistanche és confusa i els substituts i adulterants massius inunden el mercat a causa de l'escassetat de recursos i l'entorn especial de creixement de Cistanches Herba. El gènere de Cistanche s'accepta per incloure quatre espècies i una variant:Cistanche deserticola, Cistanche tubulosa, Cistanche sinensis, Cistanche salsa, iCistanchesalsavar. albiflora [39]. Els investigadors del Japó van considerar l'origen deCistancsHerba comCistanche salsa[40–43], mentre que es va identificar comCistanche deserticolaper Tu [44–46]. Per tant, es confon en la classificació de Cistanche, i és difícil discriminar els dos orígens de Cistanches Herba. Els mètodes tradicionals per al control de qualitat de Cistanches Herba són la identificació morfològica [47,48], la identificació microscòpica [49] i TLC (cromatografia de capa fina) [50,51], FTIR (espectroscòpia infraroja de transformada de Fourier) [14], HPLC (alta Cromatografia líquida de rendiment) [52,53]. El mètode morfològic i microscòpic pot diferenciar fàcilment espècies de diferents gèneres o famílies que posseeixen grans diferències en característiques morfològiques i microscòpiques, mentre que és difícil distingir espècies germanes. TLC i FTIR poden discriminar clarament les espècies que posseeixen diferents tipus de composicions químiques, mentre que és difícil determinar el component químic i el contingut. L'HPLC s'utilitza principalment per diferenciar espècies amb diferents continguts d'elements químics, no obstant això, el temps d'anàlisi és més llarg i la sensibilitat és relativament menor en comparació amb la UPLC. En conseqüència, la tecnologia UPLC-QTOF/MS va ser més ràpida i precisa per determinar la composició química que altres mètodes químics. Els mètodes d'identificació molecular es mostren bé en la discriminació basada en la variació genètica, com ara SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) [54], AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) [55,56]. Tanmateix, aquests mètodes moleculars no són fàcils d'utilitzar i no són universals. En conseqüència, el codi de barres d'ADN podria discriminar les espècies de manera més universal, ràpida i precisa que altres mètodes moleculars. Per a les espècies del mateix gènere i una estreta relació genètica, aquests mètodes per si sols poden no funcionar bé en la identificació.

Aquí, vam combinar UPLC-QTOF/MS i codi de barres d'ADN per identificar-losCistanche deserticolaiCistanche tubulosai va avaluar els marcadors químics i moleculars que permetrien discriminar-los. Es van detectar 23 pics de massa qualificats i se'n van identificar 16 mitjançant UPLC-QTOF/MS, i primer es van trobar tres compostos marcadors potencials que faciliten la discriminació de dos orígens mitjançant l'anàlisi PCA i OPLS-DA. A més, es van avaluar quatre indicadors mitjançant la tecnologia de codi de barres d'ADN pel que fa a la seva capacitat per diferenciar dos orígens: eficiència d'identificació, eficiència genètica, bretxa de codi de barres i anàlisi de l'arbre de NJ. La regió psbA-trnH es va donar suport com a codi de barres d'ADN adequat per discriminarCistanche deserticolaiCistanche tubulosa. En conclusió, primer vam establir un nou mètode combinat d'anàlisi molecular i química per discriminar i controlar la qualitat en dos orígens de Cistanches Herba. El codi de barres d'ADN pot discriminar dos orígens en la variació genètica i autenticar espècies de manera universal i precisa; La tecnologia UPLC-QTOF/MS pot analitzar la composició química per avaluar la qualitat dels materials medicinals de manera ràpida i precisa. El mètode combinat de codi de barres d'ADN i la tecnologia UPLC-QTOF/MS garanteixen la identificació en múltiples fonts de materials medicinals de manera més precisa i científica i pot servir com a mètode per identificar altres espècies o gèneres confusos en la classificació.

Aportacions de l'autor

Va concebre i dissenyar els experiments: LFH SHZ LBW. Va realitzar els experiments: SHZ LBW. S'han analitzat les dades: SHZ LBW. Reactius/materials/eines d'anàlisi aportats: LFH. Va escriure el treball: SHZ XJ LBW. Comproveu el manuscrit: ZHW.

Cistanche deserticola té molts efectes, feu clic aquí per saber-ne més

Referències

1. Tu PF, Lou ZC, Li SC, Wang CS, Jiang WY, et al. (1996) Comparació sobre l'alimentació del ronyó i l'enfortiment del yang de l'eficàcia de tres espècies diferents deherbacistanques. Revista de materials medicinals xinesos 19: 420–421.

2. Zhang Y, Wu H, Wang SN, Zheng HC (1994) Comparació de les funcions d'alimentació i enfortiment del yang de tres espècies diferents deherbacistanques. China Journal of Chinese Materia Medica 19: 169–171.

3. Lei L, Song ZH, Tu PF (2003) Avenços en la investigació de components químics en plantes deCistanchebufant. i Enllaç. Drogues tradicionals i herbes xineses 34: 473–476.

4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S, et al. (2006) Aminoglucòsids feniletanoides i oligosucres acilats amb activitat vasorelaxant deCistanchetubulosa. Bioorg Med Chem 14: 7468–7475.

5. Shimoda H, Tanaka J, Takahara Y, Takemoto K, Shan SJ, et al. (2009) Els efectes hipocolesterolèmics deCistanchetubulosaextracte, una medicina tradicional xinesa crua, en ratolins. Am J Chin Med 37: 1125–1138.

6. Yamada P, Iijima R, Han J, Shigemori H, Yokota S, et al. (2010) Efecte inhibidor de l'acteòsid aïllat deCistanchetubulosasobre l'alliberament de mediadors químics i la producció de citocines inflamatòries per les cèl·lules RBL-2H3 i KU812. Planta Med, 1512–1518.

7. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Matsuda H, et al. (2010) Aminoglucòsids feniletanoides acilats amb activitat hepatoprotectora de la planta del desertCistanchetubulosa. Bioorg Med Chem 18: 1882–1890.

8. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, et al. (2010) Glicòsids monoterpènics iridoides i acíclics, kankanòsids L, M, N, O i P deCistanchetubulosa. Chem Pharm Bull (Tòquio) 58: 1403–1407.

9. He YP, Yin ZZ, Tu PF, Lou ZC (1997) Identificació i enquesta de drogues brutes comercials d'herba cistanche. Revista de materials medicinals xinesos 20: 117–122.

10. Zhu SY (2001) Identificació farmacognòstica deCistanchetubulosauna espècie confusa deCistanchedeserticola. Revista de materials medicinals xinesos 24: 24–25.

11. Xu XQ, Ni H, Wei HY, Jia XG, Zhang BG, et al. (2013) Identificació microscòpica de tresherbacistanquesa Xin Jiang. Shizhen Medicine and Materia Research 24: 881–883.

12. Zhang M, Fu XL, Wang SY (2004) Identificació microscòpica de comercialsHerbaCistancsmitjançant la tècnica d'imatge digital. Revista de materials medicinals xinesos 27: 400–402.

13. Li JS, Yao ZQ, Yu MX (2000) Estudi sobre la identificació deherbacistanquesi adulterants. Shizhen Medicine and Materia Research 11: 317–318.

14. Xu R, Sun SQ, Liu YG, Chen J, Liu TN, et al. (2010) Estudis espectroscòpics FTIR i 2D-IR sobre diferents fonts deherbacistanques. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 30: 897–900.

15. Chen J, Sun SQ, Xu R, Liu YG, Yu J, et al. (2009) Identificació deCistanchedeserticolade Boschniakla rossica i Cynomorium solarium mitjançant FTIR i espectroscòpia IR de correlació bidimensional. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 29: 1502–1507.

16. Yang HC, Xia PX, Huang JX, Yuan HZ (2008) Estudi sobre l'empremta digital HPLC deCistanchedeserticola. Pharm Care & Res 8: 255–257.

17. Xie JN, Zhao MB, Wu FW, Tu PF (2005) empremta digital cromatogràfica deCistanchedeserticolaper HPLC. Drogues tradicionals i herbes xineses 36: 268–271.

18. Han JP, Song JY, Liu C, Chen J, Qian J, et al. (2010) Identificació deCistancheespècies (Orobanchaceae) basades en seqüències de la regió intergènica plastid psbA-trnH. Acta Pharmaceutica Sinica 45: 126–130.

19. Shi HM, Wang J, Wang MY, Tu PF, Li XB (2009) Identificació deCistancheEspècies per seqüència química i intersimple Repetició d'empremtes digitals. Biol. Farmàcia. Bull., 32: 142–146.

20. Han LF, Yiadom MB, Liu EW, Zhang Y, Li W, et al. (2012) Caracterització estructural i identificació de glicòsids feniletanoides a partir deCistancsdeserticolaYC Maper UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS. Anàlisi fitoquímica 23: 668–676.

21. Jiang X, Huang LF, Wu LB, Wang ZH, Chen SL (2012) UPLC-QTOF/MS Analysis of Alcaloids in Traditional Processed Coptis chinensis Franch. Complement basat en Evid Alternat Med 2012: 942384.

22. Wu LB, Jiang X, Huang LF, Chen SL (2013) Processing Technology Investigation of Loquat (Eriobotrya japonica) Leaf by Ultra-Performance Liquid Chromatography- Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry Combined with Chemometrics. PLoS ONE 8: e64178.

23. Hebert PD, Ratnasingham S, Waard JR (2003) Codificar la vida animal: divergències de la subunitat 1 del citocrom c oxidasa entre espècies estretament relacionades. Proc. R. Soc. Lond. B., 270 Supl 1: S96–99.

24. Hebert PD, Cywinska A, Ball SL, Waard JR (2003) Identificacions biològiques mitjançant codis de barres d'ADN. Proc Biol Sci., 270: 313:321.

25. Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, Weigt LA, Janzen DH (2005) Ús de codis de barres d'ADN per identificar plantes amb flors. Proc Natl Acad Sci., 102: 8369–8374.

26. Chen S, Yao H, Han J, Liu C, Song J, et al. (2010) Validació de la regió ITS2 com a nou codi de barres d'ADN per identificar espècies de plantes medicinals. PLoS One 5: e8613.

27. Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, et al. (2011) MEGA5: anàlisi de genètica evolutiva molecular utilitzant mètodes de màxima probabilitat, distància evolutiva i màxima parsimònia. Mol Biol Evol 28: 2731–2739.

28. Meyer CP, Paulay G (2005) Codi de barres d'ADN: taxes d'error basades en un mostreig complet. PLoS Biol 3: e422.

29. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1984) Estudis sobre els constituentsCistancheHerba.IV. Aïllament i estructures de dos nous glicòsids fenilpropanoides, cistanòsids C i D. Chem Pharm Bull 32: 3880–3885.

30. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Estudis sobre els constituents deCistancheHerba. VI. Aïllament i estructures d'un nou glicòsid iridoide, 6-Deoxyeatalpol. Chem Pharm Bull 33: 3645–3650.

31. Jiang Y, Li SP, Wang YT, Chen XJ, Tu PF (2009) Diferenciació deHerbaCistancsmitjançant empremta digital amb cromatografia líquida d'alt rendiment-detecció de matrius de díodes-espectrometria de masses. Revista de cromatografia A 1216: 2156–2162.

32. Han LF, Boakye YM, Liu E, Zhang Y, Li W, et al. (2012) Caracterització estructural i identificació de glicòsids feniletanoides a partir deCistanches deserticola YC Maper UHPLC/ESI–QTOF–MS/MS. Phytochem Anal 23: 668–676.

33. Li L, Tsao R, Yang R, Liu CM, Young JC, et al. (2008) Aïllament i purificació de glicòsids feniletanoides deCistanchedeserticolamitjançant cromatografia a contracorrent d'alta velocitat. Food Chemistry 108: 702–710.

34. Lu DY, Zhang JY, Yang ZY, Liu HM, Li S, et al. (2013) Anàlisi quantitativa deCistancsHerbautilitzant cromatografia líquida d'alt rendiment juntament amb detecció de matrius de díodes i espectrometria de masses d'alta resolució combinada amb mètodes quimiomètrics. J Set Sci 26: 1945–1952.

35. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Studies on the ConstiuentsCistancheHerba. V. Aïllament i estructures de dos nous glicòsids fenilpropanoides, cistanòsids E i F. Chem Pharm Bull 33: 1452–1457.

36. Jiang Y, Tu PF (2009) Analysis of chemical constituents inCistancheespècies. J Chromatogr A 1216:1970–1979.

37. Masssart DL, Vandeginste BGM, Deming SN, Michotte Y, Kaufman L (1988) Data handling in science and technology. Quimiometria: un llibre de text.

38. Huang LF, Zheng SH, Wu LB, Jiang X, Chen SL (2014) Ecotypes ofCistanche deserticolabasat en components químics i trets moleculars. SCIENTIA SINICA Vitae 44: 318–328.

39. Tu PF, Jiang Y, Guo YH (2011) investigació i desenvolupament industrial de l'herbacistanques. Journal of Chinese Pharmaceutical 46: 882–887.

40. Kobayashi H, Oguchi H, Takizawa, Miyase T, Ueno A, et al. (1987) Nous glucòsids feniletanoides deCistanchetubulosa(SCHRENK) Ganxo. f. I. Chem Pharm Bull 35: 3309–3314.