PART 2: el polisacàrid de Cistanche Deserticola inhibeix la pèrdua òssia induïda per OVX en ratolins i l'osteoclastogènesi induïda per RANKL
Mar 02, 2022
Contacte:joanna.jia@wecistanche.com
L'osteoporosi és una malaltia òssia greu que afecta la població envellida. S'ha demostrat que Cistanche deserticola (CD), un aliment tònic i medicinal molt utilitzat a la Xina, proporciona un tractament eficaç per a l'osteoporosi.Polisacàrid de Cistanche deserticola(CDP), extret de CD, posseeix diverses propietats farmacològiques, però el seu paper en la formació i funció osteoclàstica, així com en l'osteoporosi, segueix sent desconegut. L'objectiu d'aquest estudi era extreure i purificar CDP.(Polisacàrid de Cistanche deserticola)per explorar encara més el seu mecanisme d'acció potencial sobre l'osteoporosi. Els resultats van mostrar que el CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola) el tractament va prevenir l'osteoporosi induïda per OVX i va millorar la pèrdua òssia reprimint l'activitat i la funció dels osteoclasts. A més, CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola)el tractament va inhibir significativament l'osteoclastogènesi induïda per RANKL. reabsorció òssia i expressió gènica específica dels osteoclasts. Mecànicament, CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola)va inhibir l'activació de les vies de senyalització de NF-xB i MAPKs induïda per RANKL i, en conseqüència, va afectar l'activació de NEATc1 aigües avall. Els resultats d'aquest estudi suggereixen que CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola)és un fàrmac potencialment segur per tractar l'osteoporosi.
Tractament de l'osteoporosi: Cistanche Deserticola Polysaccharide
FEU CLIC AQUÍ PER BARK PRAT 1
3. Resultats
3.1. CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola)prevé la pèrdua òssia induïda per OVX in vivo
Hem utilitzat un model de ratolí d'osteoporosi induït per OVX per investigar els efectes del CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola)Tractament de l'osteoporosi in vivo. En comparació amb el grup Sham, el pes corporal dels ratolins OVX va augmentar significativament mentre que l'índex uterí va disminuir, cosa que indica que el model d'osteoporosi es va construir amb èxit (Fig. 1B i D). L'anàlisi micro-TC de les tíbies en el grup OVX va mostrar una pèrdua òssia extensa. En comparació amb el grup OVX, el nombre de trabècules òssies va augmentar en el grup CDP-L, mentre que l'augment en els grups CDP-H i E2 va ser més significatiu, i les trabècules en els dos últims grups es van fer més gruixudes i la bretxa es va reduir. L'anàlisi quantitativa va confirmar que diversos paràmetres histomorfomètrics ossis, inclosos DMO, BV/TV, BS/TV i Tb. N va tenir valors significativament augmentats, mentre que Tb. Sp va mostrar valors disminuïts en el grup CDP-H (Fig. 1E i F). L'examen histopatològic mitjançant la tinció H&E va revelar que el nombre de trabècules òssies en els grups CDP-H i E2 era significativament superior al del grup OVX mentre que no hi va haver cap millora significativa en el grup CDP-L (Fig. 1G). A més, la tinció de TRAcP va mostrar que el nombre d'osteoclasts va augmentar notablement en el grup OVX, però va disminuir en els grups CDP-H i E2 (Fig. 1H). Els grups CDP-L, CDP-H i E2 van mostrar inhibició de l'augment del contingut de P induït per OVX, però van augmentar el contingut de Ca al sèrum sanguini. Els marcadors d'absorció òssia, RANKL i TRAcP-5b van mostrar una tendència a la disminució del CDP-L.
3.2. CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola) suprimeix l'osteoclastogènesi induïda per RANKL in vitro
Hem controlat la proliferació cel·lular deCDPBMM tractats mitjançant un analitzador d'imatges de cèl·lules vives dinàmiques a llarg termini a temps real. En comparació amb el grup control, la confluència cel·lular a laCDP-els grups tractats no van canviar en una dosi<10 µg/ml,="" but="" was="" significantly="" reduced="" at="" the="" 20="" and="" 40="" µg/ml="" dosages="" (fig.="" 2a).="" to="" investigate="" the="" effect="" of="">CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola)sobre l'osteoclastogènesi induïda per RANKL, els BMM es van estimular amb RANKL i M-CSF en presència deCDPfor 7 days. TRAcP, a characteristic enzyme of osteoclasts, is considered an indicator of osteoclast function (Minkin, 1982). TRAcP staining showed that the osteoclasts treated with>1,25 µg/mlCDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola)va mostrar una mida i un nombre significativament reduïts. Aquests resultats van mostrar que CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola)va inhibir eficaçment l'esperada osteoclastogènesi induïda per RANKL sense afectar la viabilitat cel·lular.
3.3. CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola)inhibeix l'activitat de reabsorció osteoclàstica induïda per RANKL i l'expressió gènica específica dels osteoclasts
També vam determinar els efectes del CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola)tractament de l'activitat de reabsorció òssia dels osteoclasts mitjançant plaques recobertes d'hidroxiapatita. La reabsorció òssia és la funció principal i l'estàndard per mesurar l'activitat i la capacitat dels osteoclasts (Novack i Faccio, 2011). Els resultats van mostrar que CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola)pot reduir significativament l'àrea de reabsorció òssia dels osteoclasts d'una manera dependent de la dosi, cosa que indica que CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola)va inhibir l'activitat de reabsorció òssia induïda per RANKL (Fig. 3A i B). En particular, l'àrea de reabsorció òssia osteoclàstica va disminuir a aproximadament un 6,3 per cent després del tractament amb 10 µg/mL de CDP.(Polisacàrid de Cistanche deserticola). Per esbrinar millor l'obstacle del CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola)sobre l'osteoclastogènesi, vam mesurar els nivells de transcripció dels gens relacionats amb els osteoclasts. Sense tractament amb CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola), la inducció amb RANKL va promoure l'expressió dels gens NFATc1, CTSK, Acp5, Atp6v0d2 i Mmp9. Per contra, l'aplicació concomitant de CDP i RANKL va reduir significativament aquests cinc gens.
3.4. CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola)inhibeix l'activació de NFATc1 induïda per RANKL
La tinció de TRAcP va revelar que CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola)El tractament va reduir significativament l'augment esperat del nombre d'osteoclasts madurs després de l'estimulació de RANKL durant 3-7 dies (Fig. 4A i B). A més, vam investigar si el tractament amb CDP pot afectar eficaçment la diferenciació dels osteoclasts mitjançant la inhibició de l'expressió NFATc1. Els resultats van mostrar que NFATc1 es va expressar molt després de l'estimulació RANKL durant 5 dies, que es va inhibir significativament després de CDP.(Polisacàrid de Cistanche deserticola)tractament (Fig. 4C i D). A més, el tractament amb CDP va suprimir els nivells d'expressió de CTSK, una proteïna necessària per a la formació i funció normals dels osteoclasts (Bossard et al., 1996) (Fig. 4E i F). Hem seleccionat una representació puntual de l'estimulació RANKL durant 5 dies per investigar més l'efecte de 10 µg/mL CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola)tractament de la translocació de NFATc1. Com era d'esperar, CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola)El tractament va inhibir significativament la translocació nuclear NFATc1 induïda per RANKL.
3.5. CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola) inhibeix l'activació induïda per RANKL de les vies de senyalització de NF-κB i MAPKs
Per dilucidar els mecanismes implicats en la inhibició de la diferenciació d'osteoclasts induïda per CDP, vam examinar l'impacte de la CDP.(Polisacàrid de Cistanche deserticola)tractament a les vies NF-κB i MAPKs. Els resultats van revelar que CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola)El tractament va tenir efectes supressors sobre la degradació de IκB i la fosforilació de p65 de manera dependent de la dosi. La fosforilació de tres membres de la família MAPK, específicament la cinasa regulada per senyal extracel·lular (ERK), la cinasa N-terminal c-Jun (JNK) i la p38 es van regular.
Cistanche Deserticola
4. Discussió
L'osteoporosi és una malaltia òssia comuna i degenerativa. Actualment, hi ha molts fàrmacs de síntesi química utilitzats en tractaments clínics de l'osteoporosi, com els estrògens i els bisfosfonats. Tanmateix, l'ús a llarg termini d'aquests fàrmacs debilitarà gradualment l'eficàcia clínica i fins i tot provocarà molts efectes secundaris greus, inclòs un augment del risc de càncer d'ovari, mama i endometri i osteonecrosi de la mandíbula (Beral, 2003; Khan et al., 2009; Lacey et al., 2002). Durant aquest estudi, vam seleccionar CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola), un component efectiu extret de la CD, com a agent terapèutic i va demostrar que CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola)tenia un efecte protector contra
pèrdua òssia en ratolins OVX i va inhibir la formació i funció d'osteoclasts induïda per RANKL. Mentrestant, segons la teoria de la medicina tradicional xinesa del "os que governa el ronyó", la pèrdua òssia s'atribueix a deficiències renals. Com a aliment mèdic tonificant els ronyons, s'ha demostrat que el CD proporciona un tractament eficaç per a l'osteoporosi (Fan et al., 2019; Jiang, Wang, Li i Zhang, 2016). Així, CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola)extret d'aquesta herba natural és una opció de fàrmac millor i més segura.
Actualment, el model de ratolí OVX és un model clàssic de pèrdua òssia postmenopausa en dones, que investiga les causes de la pèrdua òssia i realitza intervencions (Wehrle et al., 2015). En conseqüència, vam realitzar una ooforectomia bilateral en ratolins femelles C57BL/6J per construir un model d'osteoporosi. En estudis anteriors, les dosis de CDP donades als animals eren de 50 a 200 mg/kg (dosi baixa) i 1800 mg/kg (dosi alta) (Guo et al., 2016; Zhang et al., 2018). Aquí, la dosi alta de CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola)en ratolins va ser de 600 mg/kg, que es basava en l'elevada dosi clínica de 30 g CD en decocció; per tant, és similar a la pràctica clínica actual. En aquest estudi, el tractament amb CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola)va inhibir significativament l'augment de pes corporal induït per OVX, que és un fenomen comú observat en ratolins OVX (Davis et al., 2019). Mitjançant l'exploració micro-TC i la reconstrucció 3D, vam trobar que OVX va provocar una reducció notable de la DMO, BV/TV, BS/TV i Tb. N, i un augment de Tb. Sp, mentre que el tractament amb CDP va revertir totes aquestes alteracions. En particular, en comparació amb el fàrmac positiu, el CDP podria millorar significativament la DMO dels ratolins OVX, que és un marcador important de la qualitat òssia i s'utilitza per reflectir el grau d'osteoporosi (Fuggle et al., 2019), cosa que indica que el CDP té un avantatge. sobre el fàrmac positiu per millorar la DMO. A més, els resultats histològics van indicar que el tractament amb CDP podria reduir l'augment de la quantitat d'osteoclasts positius per TRAcP induït per OVX. Aquests resultats suggereixen que l'administració de CDP va mitigar eficaçment la pèrdua òssia en l'osteoporosi induïda per OVX, possiblement inhibint la formació d'osteoclasts. D'acord amb els resultats anteriors, vam trobar que la CDP inhibia depenent de la dosi la formació i funció osteoclàstica induïda per RANKL, mentre que la CDP va tenir poc efecte en la proliferació de cèl·lules precursores d'osteoclasts induïda per M-CSF en els nostres experiments in vitro.
La unió de RANKL i RANK pot provocar el reclutament de TRAF6 i la posterior activació de diverses vies de senyalització aigües avall, com ara NF-κB i MAPK (Boyle et al., 2003; Huang et al., 2006). La via de senyalització NF-κB té un paper important en la regulació de la diferenciació dels osteoclasts, i el silenciament dels gens que codifiquen proteïnes clau en aquesta via pot conduir a un desenvolupament ossi anormal (Leibbrandt i Penninger, 2008). Està ben establert que NF-κB està present al citoplasma de cèl·lules no estimulades en un complex amb IκB, però entra ràpidament al nucli després de l'estimulació RANKL (Boyle et al., 2003). L'IκB alliberat es degrada ràpidament, mentre que NF-κB activa la transcripció gènica específica, promovent en conseqüència la diferenciació, la maduració i l'apoptosi dels osteoclasts (Abdelmagid et al., 2015). En aquest estudi, els resultats van mostrar que CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola)el tractament va suprimir l'activació induïda per RANKL de la via de senyalització NF-κB, com es demostra mitjançant la inhibició de la degradació d'IκB i la fosforilació de p65 de manera dependent de la dosi, que pot implicar el seu efecte anti-osteoclastogènic. A més, la via de senyalització de MAPK, incloent ERK, JNK i p38, estan estretament implicades en l'osteoclastogènesi induïda per RANKL (Li et al., 2002). A més, els inhibidors dominants de p38 i JNK poden prevenir l'osteoclastogènesi induïda per RANKL (Chang et al., 2008; Kim et al., 2019), mentre que ERK té un paper important en la supervivència dels osteoclasts (Miyazaki et al., 2000). Està ben establert que RANKL activa la via de senyalització de MAPK augmentant la fosforilació d'ERK, JNK i p38 (Mizukami et al., 2002). En el nostre estudi, vam demostrar que CDP va suprimir la fosforilació induïda per RANKL de proteïnes clau a la via de senyalització de MAPK. En conjunt, aquests resultats indiquen que la inhibició de l'activació de les vies de senyalització NF-κB i MAPK contribueix a l'efecte inhibidor de CDP contra l'osteoclastogènesi.
L'activació de les vies de senyalització NF-κB i MAPKs promou l'expressió de diversos factors de transcripció clau, com ara l'oncogen fos cel·lular, la proteïna activadora 1 i NFATc1 (Huang et al., 2006; Wagner i Matsuo, 2003). NFATc1, un membre important de la família NFAT, està implicat en la diferenciació terminal dels osteoclasts com a regulador transcripcional mestre (Asagiri et al., 2005). S'ha informat que les cèl·lules mare embrionàries amb deficiència de NFATc1- no es poden diferenciar en osteoclasts sota l'estimulació de RANKL i l'expressió ectòpica de NFATc1 fa que les cèl·lules precursores es diferenciïn sense passar la senyalització RANKL, cosa que suggereix que NFATc1 té un paper crític en diferenciació d'osteoclasts (Takayanagi et al., 2002). Els resultats del nostre estudi van mostrar l'efecte supressiu del CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola)sobre l'expressió de NFATc1 i la seva següent proteïna CTSK. Curiosament, vam observar que el nivell d'expressió de proteïnes de NFATc1 primer va augmentar i després va disminuir, assolint el nivell més alt el 5è dia després de l'estimulació de RANKL. Això va ser coherent amb els resultats de Baek et al. (2014), que va observar la degradació de NFATc1 induïda per M-CSF durant l'osteoclastogènesi en fase tardana mitjançant la ubiqüitinació induïda per Cbl de NFATc1 de manera dependent de la cinasa Src. Els resultats de l'assaig d'immunofluorescència van donar suport constantment a l'efecte inhibidor del CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola)sobre l'activació transcripcional de NFATc1. A més, els gens específics dels osteoclasts, inclosos CTSK, Acp5, Mmp9 i Atp6v0d2, estan regulats directament per NFATc1 (Y. Kim et al., 2005), van ser suprimits per CDP. Aquestes troballes il·lustren que el NFATc1 és un objectiu de l'efecte inhibidor del CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola)a les vies de senyalització NF-κB i MAPKs.
Polisacàrid de Cistanche deserticola
5. Conclusió
En resum, vam extreure i purificar el polisacàrid actiu del CD i vam demostrar que el CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola)va mostrar un efecte protector sobre l'osteoporosi induïda per OVX i va millorar la pèrdua òssia reprimint l'activitat i la funció dels osteoclasts. A més, CDP(Polisacàrid de Cistanche deserticola)pot inhibir la diferenciació i funció dels osteoclasts induïda per RANKL interferint amb les vies de senyalització de NF-κB i MAPKs i, en conseqüència, afectant l'activació de NFATc1 aigües avall. En conclusió, els nostres resultats proporcionen la base per a l'expansió i l'aplicació de CDP en el tractament de l'osteoporosi.
Referències
Abdelmagid, SM, Sondag, GR, Moussa, FM, Belcher, JY, Yu, B., Stinnett, H., … Safadi, FF (2015). La mutació de l'osteoactivina promou l'activador del receptor del lligand NFkappaB (RANKL) mediada per la diferenciació i la supervivència dels osteoclasts, però inhibeix la funció dels osteoclasts. Journal of Biological Chemistry, 290(33), 20128–20146. https://doi.org/10.1074/jbc.M114.624270.
Baek, JM, Kim, JY, Cheon, YH, Park, SH, Ahn, SJ, Yoon, KH, … Lee, MS (2014). Aconitum pseudolaeve var. erectum inhibeix l'activador del receptor de l'osteoclastogènesi induïda pel lligand kappa-B mitjançant el factor c-Fos/nuclear de les cèl·lules T activades, la via de senyalització citoplasmàtica 1 i prevépolisacàrid- Pèrdua òssia induïda en ratolins. Molècules, 19(8), 11628–11644. https://doi.org/ 10.3390/molecules190811628.
Black, DM, Bauer, DC, Schwartz, AV, Cummings, SR i Rosen, CJ (2012). Tractament continuat amb bisfosfonats per aosteoporosiper a qui i durant quant de temps? New England Journal of Medicine, 366(22), 2051–2053. https://doi.org/10.1056/ NEJMp1202623.
De Martinis, M., Di Benedetto, MC, Mengoli, LP i Ginaldi, L. (2006). Senilosteoporosi: És una malaltia de mediació immune? Recerca sobre la inflamació, 55(10),399–404. https://doi.org/10.1007/s00011-006-6034-x.
Fuggle, NR, Curtis, EM, Ward, KA, Harvey, NC, Dennison, EM i Cooper, C. (2019). Predicció de fractures, imatges i cribratgeosteoporosi. Nature Reviews Endocrinology, 15(9), 535–547. https://doi.org/10.1038/s41574-019-0220-8.
Hu, Y., Huang, J., Li, Y., Jiang, L., Ouyang, Y., Li, Y., … Zeng, Q. (2020).Polisacàrid de Cistanche deserticolaindueix la melanogènesi als melanòcits i redueix l'estrès oxidatiu mitjançant l'activació de la via NRF2/HO-1. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 24 (7), 4023–4035. https://doi.org/10.1111/jcmm.15038.
Huang, H., Ryu, J., Ha, J., Chang, EJ, Kim, HJ, Kim, HM, … Kim, HH (2006). La diferenciació dels osteoclasts requereix TAK1 i MKK6 per a la inducció de NFATc1 i la transactivació de NF-kappaB per RANKL. Cell Death & Differentiation, 13(11), 1879–1891.
Liu, Y., Wang, C., Wang, G., Sun, Y., Deng, Z., Chen, L., ... Xu, J. (2019). Loureirin B suprimeix l'osteoclastogènesi induïda per RANKL i s'ovariectomitzaosteoporosimitjançant l'atenuació de les activitats NFATc1 i ROS. Theranostics, 9(16), 4648–4662. https://doi. org/10.7150/thno.35414.
Rachner, TD, Khosla, S. i Hofbauer, LC (2011).Osteoporosi: Ara i el futur. Lancet, 377(9773), 1276–1287. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(10)62349-5.
Strom, O., Borgstrom, F., Kanis, JA, Compston, J., Cooper, C., McCloskey, EV i Jonsson, B. (2011).Osteoporosi: Càrrega, provisió d'assistència sanitària i oportunitats a la UE: un informe elaborat en col·laboració amb l'InternationalOsteoporosiFundació (IOF) i la Federació Europea d'Associacions de la Indústria Farmacèutica (EFPIA). Arxius deOsteoporosi, 6, 59–155. https://doi.org/10.1007/ s11657-011-0060-1.
Identificació i caracterització d'apolisacàridde les arrels de Morinda officinalis, com a inductor de la formació òssia mitjançant la regulació a l'alça de l'expressió del gen objectiu. Revista Internacional de Macromolècules Biològiques, 133, 446–456.
Zhang, A., Yang, X., Li, Q., Yang, Y., Zhao, G., Wang, B. i Wu, D. (2018). Activitat immunoestimuladora de l'aigua extractiblepolisacàridsde Cistanche deserticola com a adjuvant vegetal in vitro i in vivo. PLoS One, 13(1), article e0191356. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0191356.
Zhang, K., Ma, X., He, W., Li, H., Han, S., Jiang, Y., … Tu, P. (2014). Els extractes de Cistanche deserticola poden antagonitzar la immunosenescència i allargar la vida útil dels ratolins propensos a la senescència 8 (SAM-P8) del ratolí accelerat. Medicina complementària i alternativa basada en l'evidència, 2014(2), article 601383. https://doi.org/10.1155/2014/601383.
Zhang, S., Zhang, Q., Zhang, D., Wang, C. i Yan, C. (2018).Antiosteoporosi aActivitat d'una novel·la Achyranthes Biden tatapolisacàridmitjançant l'estimulació de la formació òssia.Carbohydrate Polymers, 184, 288–298. https://doi.org/10.1016/j.
Zheng, H., He, B., Wu, T., Cai, J. i Wei, J. (2020). Extracció, purificació i activitat antiosteoporòtica de apolisacàridde Epimedium Maxim. in vitro. Revista internacional de macromolècules biològiques, 156, 1135–1145. https://doi. org/10.1016/j.ijbiomac.2019.11.145.
Suplements de Cistanche deserticola
