PART 2 L'equinacòsid inhibeix l'alliberament de glutamat suprimint el Ca2 depenent del voltatge més l'entrada i la proteïna quinasa C a les terminals nervioses cerebrals de la rata

Per a més informació poseu-vos en contacte amb:Joanna.jia@wecistanche.com

FEU CLIC AQUÍ PER A LA PART 1

3. Discussió

En aquest estudi, l'equinacòsid, un compost actiuHerba Cistanche, va inhibir l'alliberament de glutamat 4-evocat per aminopiridina a les terminals nervioses de l'escorça cerebral de la rata. Els possibles mecanismes subjacents per a la inhibició de l'alliberament de glutamat mediada per echinacòsids s'estudien i es discuteixen més a fons aquí.

Cistanche deserticola té molts efectes, feu clic aquí per saber-ne més

3.1. Mecanismes subjacents a la inhibició de l'alliberament de glutamat mediada per equinacòsids Alliberament de glutamat

evocada per 4-aminopiridina consta de dos components: un component depenent de Ca2 més fisiològicament rellevant, que es produeix mitjançant l'exocitosi de vesícules sinàptiques que contenen glutamat; i un component independent de Ca2 més, que s'origina a partir d'una despolarització prolongada que provoca un desplaçament mediat pel potencial de membrana de l'estat estacionari del transportador de glutamat cap a la direcció exterior, afectant així l'eflux de glutamat citosòlic [31]. Aquí, ho vam observarequinacòsidno va inhibir significativament l'alliberament de glutamat 4-evocat per aminopiridina en presència d'un medi lliure de Ca2 més (alliberament independent de Ca2 més). A més, l'observatequinacòsidLa inhibició mediada de l'alliberament de glutamat 4-evocat per aminopiridina es va prevenir eficaçment per la bafilomicina A1 (que esgota el contingut de glutamat de les vesícules sinàptiques), però no per DL-TBOA (que inhibeix de manera no selectiva tots els subtipus de transportadors d'aminoàcids excitadors). Aquests resultats suggereixen queequinacòsidafecta l'exocitosi depenent de Ca2 plus de l'alliberament de glutamat sense afectar l'eflux citosòlic independent de Ca2 plus de glutamat mitjançant la inversió del transportador de glutamat de la membrana plasmàtica de la terminal nerviosa. A les terminals sinàptiques, la inhibició del canal Na més o l'activació del canal K més estabilitzen l'excitabilitat de la membrana i, en conseqüència, redueixen l'entrada de Ca2 més evocada i l'alliberament del neurotransmissor [32,33]. Per tant, el mecanisme potencial subjacentequinacòsid- La inhibició mediada de l'alliberament de glutamat implica una reducció de l'excitabilitat sinaptosòmica. Tanmateix, aquesta possibilitat és insostenible a partir de dues observacions: (1) 4-la despolarització del potencial de membrana evocada per aminopiridina, mesurada amb el colorant sensible al potencial de membrana DiSC3(5) no es va veure afectada per l'addició deequinacòsid; i (2) l'equinacòsid no va afectar l'alliberament independent de Ca2 més glutamat evocat per 4-aminopiridina, un component d'alliberament que depèn només del potencial de membrana [31]. Si l'efecte no és causat per la supressió de l'excitabilitat sinaptosòmica, es pot manifestar mitjançant una reducció de l'activitat dels canals Ca2 més Cav2.2 (tipus N) i Cav2.1 (tipus P/Q) juntament amb l'exocitosi de glutamat en el terminals nervioses [34–36]. Amb fura-2, ho demostremequinacòsidredueix significativament l'augment 4-evocat per l'aminopiridina de la concentració de Ca2 més. A més, les nostres dades mostren que l'efecte inhibidor deequinacòsiden 4-l'alliberament de glutamat evocat per aminopiridina va disminuir del 42,4% ˘ 2,3% al 12,1% ˘ 3,9% després de l'exposició a un bloquejador de Cav2.2 (tipus N) i Cav2.1 (tipus P/Q) Ca2 més canals. A més, vam observar queequinacòsidva continuar inhibint significativament l'alliberament de glutamat evocat per 4-aminopiridina en presència de Ca2 intracel·lular més inhibidors d'alliberament. Aquests resultats indiquen que la supressió simultània de Cav2.2 (tipus N) i Cav2.1 (tipus P/Q) més l'activitat del canal és el mecanisme potencial subjacent.equinacòsid- Inhibició mediada de l'alliberament de glutamat. Tanmateix, l'activació combinada de Cav2.2 (tipus N) i Cav2.1 (tipus P/Q) més l'activitat del canal no va poder bloquejar l'acció deequinacòsidcompletament. Per tant, altres tipus no identificats de canals de Ca2 més o altres vies presinàptiques poden estar implicats en la inhibició. Per exemple, els receptors GABAA estan presents a nivell presinàptic, i s'ha demostrat que la seva activació inhibeix l'afluència de Ca2 més i l'alliberament de glutamat [37]. En el present estudi, els antagonistes del receptor GABAA SR95531 i la bicucullina no van bloquejar la inhibició de l'alliberament de glutamat mediada per echinacòsids, cosa que suggereix que els receptors GABAA no estan implicats en la reducció de l'activitat del canal de Ca2 més dependent del voltatge i en la inhibició posterior de l'alliberament de glutamat.

L'entrada de Ca2 més a través dels canals de Ca2 més dependents del voltatge activa diverses proteïnes cinases associades a l'alliberament de glutamat a les terminals nervioses, com ara la proteïna cinasa activada per mitògens, la proteïna cinasa C i la proteïna cinasa A. Aquí, demostrem que els inhibidors de la proteïna cinasa C van antagonitzar de manera eficient elequinacòsid-inhibició mediada de l'alliberament de glutamat; no obstant això, l'inhibidor de la proteïna cinasa activat per mitogen PD98059 o l'inhibidor de la proteïna cinasa A H89 no van ser efectius. A més, això. J. Mol. Ciència. 2016, 17, 1006 8 de la 13 4-fosforilació induïda per aminopiridina de la proteïna cinasa C va disminuir als sinaptosomes després del pretractament ambequinacòsida una concentració efectiva per inhibir l'alliberament de glutamat. Per tant, la via de senyalització delequinacòsidLa inhibició de l'alliberament de glutamat mediada pot implicar la proteïna cinasa C. La proteïna cinasa C és un important sistema de senyalització intracel·lular que està present a nivell presinàptic i té un paper crucial en l'exocitosi del neurotransmissor. Per exemple, diverses proteïnes sinàptiques implicades en el tràfic o el reclutament de vesícules sinàptiques i l'exocitosi, com el substrat miristoilat de la C cinasa ric en alanina, estan fosforilades per la proteïna cinasa C [38,39]. Aquest procés de fosforilació es pot augmentar mitjançant l'entrada de Ca2 estimulada per la despolarització, que facilita l'alliberament de glutamat [40]. Per tant, podem especular raonablement que l'efecte inhibidor deequinacòsidL'entrada de Ca2 més observada aquí pot reduir l'activitat de la proteïna cinasa C i, en conseqüència, l'alliberament de glutamat.

3.2. Implicacions terapèutiques

L'excitotoxicitat, un procés patològic causat per l'alliberament excessiu de glutamat i l'activació del receptor de glutamat, és la principal causa de mort neuronal en trastorns cerebrals aguts i crònics com l'ictus, lesions cerebrals traumàtiques, les malalties de Parkinson i Alzheimer [13,41] i estratègies terapèutiques. La inhibició de l'alliberament de glutamat pot ser estratègies neuroprotectores prometedores per tractar aquestes malalties.Echinacòsids'ha confirmat que penetra la barrera hematoencefàlica (BBB) ​​i presenta efectes neuroprotectors en diversos models in vivo de neurotoxicitat [8,10-12,42]. Tot i que el mecanisme d'aquests efectes neuroprotectors no s'entén completament, s'han informat diversos mecanismes possibles, com ara la inhibició de la resposta inflamatòria, l'estabilització de la funció mitocondrial, l'antioxidació, l'eliminació de radicals lliures i la imitació de la funció neurotròfica [5,9,12,42]. En l'estudi actual, la capacitat de l'echinacòsid per reduir l'alliberament de glutamat de les terminals nervioses també pot explicar en part el seu mecanisme neuroprotector. No obstant això, si aquest efecte contribueix a l'aparent potencial terapèutic de l'equinacòsid en trastorns cerebrals associats a l'excitotoxicitat del glutamat justifica més investigacions.

4. Materials i Mètodes

4.1. Productes químics

L'èster de fura-2-acetoximetil (Fura-2-AM) i el iodur de 3',3',3'-dipropiltiadicarbocianina [DiSC3(5)] es van comprar a Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). ω-conotoxina MVIIC, rotlerina,2-[1-({3-dimetilaminopropil)indol-3-il]-3-(indol{-3-il) maleimida ( GF109203X), 5,6,7,13-tetrahidro-13-metil-5-oxo-12H-indolo[2,3-a]pirrolo[3,{ {27}}c]carbazol-12-propanenitril (Go6976) i N-[2-(p bromocinnamilamino)etil]-5-isoquinolinesulfonamida (H89) es van comprar a TocrisBioscience (Bristol, Regne Unit). Equinacòsid, dantrolè, DL-treo-beta-benzil-oxiaspartat (DL-TBOA), 7-cloro-5-({2-clorofenia){-1,5-dihidro -4,1-benzotiazepina-2(3H)-ona (CGP37157), 2-({{2-amino-3-metoxifenil)-4 Es van comprar H-1-benzopiran-4-one) (PD98059), etilenglicol bis(-aminoetil èter)-N,N,N1,N1-àcid tetraacètic (EGTA) i tots els altres reactius de Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, EUA).

4.2. Animals

Es van utilitzar rates Sprague-Dawley mascles de dos mesos d'edat. Els animals es van allotjar en condicions ambientals estandarditzades (22 ˘ 1 ˝ C; 50 per cent d'humitat relativa; 12 h de cicle de llum/foscor) i es van permetre un accés il·limitat al menjar i l'aigua. Els animals van ser assassinats per decapitació i l'escorça cerebral es va eliminar ràpidament a 4 ˝ C. Els procediments experimentals van ser aprovats pel Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals de Fu Jen (A10259), d'acord amb la Guia dels Instituts Nacionals de Salut per a la cura i l'ús d'animals de laboratori. Es van fer tots els esforços per minimitzar el patiment dels animals i utilitzar un nombre mínim d'animals necessaris per produir resultats fiables.

4.3. Preparacions sinaptosòmiques

Els sinaptosomes es van purificar de l'escorça cerebral de rates en gradients discontinus de Percoll tal com es va descriure anteriorment [43,44]. Breument, el teixit es va homogeneïtzar en un medi que contenia 0,32 M sacarosa (pH 7,4), l'homogenat es va centrifugar durant 10 min a 3000ˆ g (5{{25 }}0{0 rpm en un rotor JA 25,5; Beckman Coulter, Inc., Miami, FL, EUA) i 4 ˝C, i el sobrenedant es va centrifugar de nou durant 12 min a 14.500ˆ g ( 11,000 rpm en un rotor JA 25,5). El pellet es va tornar a suspendre suaument en sacarosa 0,32 M (pH 7,4) i es va col·locar una alíquota d'aquesta suspensió sinaptosòmica (2 mL) en un gradient discontinu de Percoll de 3 mL que contenia sacarosa 0,32 M, EDTA 1 mM, DL-dithiothreitol 0,25 mM i 0,25 mM. 3 per cent, 10 per cent i 23 per cent de Percoll (pH 7,4). Després de la centrifugació a 32.500 g (16.500 rpm en un rotor JA 20,5) durant 7 min a 4 °C, els sinaptosomes es van recuperar entre les bandes de Percoll del 10% i el 23% i es van diluir en un volum final de 30 ml. de medi tampó HEPES (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM NaHCO3, 1 mM MgCl2¨ 6H2O, 1,2 mM Na2HPO4, 10 mM glucosa i 10 mM HEPES (pH 7,4)). Després d'una centrifugació posterior a 27, 000ˆ g (15.000 rpm en un JA 25,5) durant 10 min, el pellet de sinaptosoma es va tornar a suspendre en 3 ml de medi tampó HEPES i es va determinar el contingut de proteïnes mitjançant un assaig de Bradford. Finalment, es van diluir 0, 5 mg de la suspensió de sinaptosomes en 10 ml de medi tampó HEPES i es van centrifugar a 3000 g (5000 rpm en un rotor JA 20.1) durant 10 min. El sobrenedant es va descartar i els pellets que contenien els sinaptosomes es van emmagatzemar en gel i es van utilitzar en 4-6 h.

4.4. Alliberament de glutamat

L'alliberament de glutamat es va analitzar mitjançant fluorimetria en línia tal com es va descriure anteriorment [45,46]. Els pellets sinaptosòmics es van tornar a suspendre en un medi tampó HEPES (0.5 mg/ml) i es van preincubar a 37 °C durant 10 min en presència d'albúmina sèrica bovina de 16 µM per unir els àcids grassos lliures alliberats dels sinaptosomes durant la preincubació. Es va transferir una alíquota de 2-ml dels sinaptosomes a una cubeta agitada que contenia 2 mM de NADP més, 50 unitats de glutamat deshidrogenasa i 1,2 mM de CaCl2, i es va mesurar la fluorescència FL de NADPH en un LS Perkin-Elmer. 14}} espectrofluorímetre (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA, EUA) a longituds d'ona d'excitació i emissió de 340 i 460 nm, respectivament. Com que els sinaptosomes no són susceptibles a l'estimulació elèctrica, es va utilitzar el bloquejador dels canals de potassi 4-aminopiridina per estimular l'alliberament de glutamat. 4-l'aminopiridina desestabilitza el potencial de membrana i es creu que provoca Na espontània repetitiva més despolarització dependent del canal que s'aproxima molt a la despolarització in vivo del terminal sinàptic que condueix a l'activació de canals de Ca2 més dependents del voltatge i alliberació de neurotransmissors [47] ]. Les dades es van obtenir a intervals de 2 s. Es va afegir un estàndard de glutamat exògen (5 nmol) al final de cada experiment. El valor del canvi de fluorescència FL produït per l'addició estàndard es va utilitzar per calcular el glutamat alliberat com a nanomols de glutamat per mil·ligram de proteïna sinaptosòmica (nmol/mg). Els valors d'alliberament citats al text són nivells assolits en estat estacionari després de 5 min de despolarització (nmol/mg/5 min). Les dades acumulades es van analitzar mitjançant fulls de càlcul Lotus 1-2-3 (IBM, White Plains, NY, EUA) i MicroCal Origin (OriginLab Corporation, Northampton, MA, EUA).

4.5. Potencial de membrana plasmàtica

El potencial de la membrana plasmàtica es va determinar amb un colorant sensible al potencial de membrana, DiSC3 (5) [48]. Els sinaptosomes es van tornar a suspendre en medi tampó HEPES i es van transferir alíquotes de 2 ml a una cubeta agitada que contenia 5 µM de DiSC3(5) a 37 °C en un espectrofluoròmetre Perkin-Elmer LS-55 (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA, EUA). Després de deixar que la barreja s'equilibrés durant 3 min, es va determinar la fluorescència FL a longituds d'ona d'excitació i emissió de 646 i 674 nm, respectivament. Les dades es van recollir a intervals de 2 s. Les dades acumulades es van analitzar mitjançant MicroCal Origin (OriginLab Corporation, Northampton, MA, EUA) i es van expressar en unitats de fluorescència FL.

4.6. Ca2 citosòlic més concentració ([Ca2 més ]C)

El [Ca2 més ]C es va mesurar amb l'indicador de Ca2 més fura-2. Els sinaptosomes ({3}},5 mg/mL) es van preincubar en un medi tampó HEPES que contenia 5 µM de fura-2 i 0,1 mM CaCl2, durant 30 min a 37 ˝C en una prova agitada. tub. Després de la càrrega de fura-2, els sinaptosomes es van centrifugar en una microcentrífuga durant 30 s a 3000 g (5000 rpm). Els pellets sinaptosòmics es van tornar a suspendre en un medi tampó HEPES i la suspensió sinaptosòmica es va agitar en una cubeta termostat en un espectrofluoròmetre Perkin-Elmer LS-55 (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA, EUA). Es va afegir CaCl2 (1 mM) després de 3 min i es van fer addicions addicionals després de 10 min addicionals. Les dades de fluorescència es van acumular a longituds d'ona d'excitació de 340 i 380 nm (longitud d'ona d'emissió de 505 nm) a intervals de 2 s. [Ca2 més ]C (nM) es va calcular mitjançant procediments de calibratge [49] i equacions descrites anteriorment [50]. Les dades acumulades es van analitzar mitjançant MicroCal Origin (OriginLab Corporation, Northampton, MA, EUA).

4.7. Western Blotting

Els sinaptosomes es van homogeneïtzar en un tampó de lisi (tampó HEPES 10 mM, pH 7,4), 1 per cent de Triton X-100 i una barreja d'inhibidor de proteasa. Els lisats es van aclarir per centrifugació i es va determinar la concentració de proteïnes mitjançant un kit d'assaig de proteïnes (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA). Es van separar quantitats iguals de proteïnes mitjançant electroforesi en gel de dodecilsulfat de sodi-poliacrilamida (SDS-PAGE) i es van transferir a la membrana de nitrocel·lulosa. Les membranes es van bloquejar amb solució salina tamponada amb Tris que contenia un 5% de llet baixa en greixos i es van incubar amb un anticòs primari adequat (fosfoproteïna quinasa C (pan), 1:3000, NOVUS Biologicals Inc., Beverly, MA, EUA) durant la nit a les 4˝C. Després de tres rentats en solució salina tamponada amb Tris, la membrana es va tractar amb l'anticòs secundari conjugat amb peroxidasa de rave picant (1:3000) durant 1 h a temperatura ambient. A continuació, es van rentar les membranes almenys tres vegades amb solució salina tamponada amb Tris i es van visualitzar mitjançant el sistema de quimioluminescència millorat (Amersham, Buckinghamshire, Regne Unit). Es va carregar una alíquota de mostres i es va sondar amb un anticòs anti-PKC per a la detecció de PKC com a control de càrrega. El nivell d'expressió o fosforilació es va avaluar mitjançant la densitat de bandes, que es va quantificar mitjançant densitometria. La quantificació densitomètrica de les bandes es va analitzar mitjançant el programari Syngene (Synoptics, Cambridge, Regne Unit).

4.8. Anàlisi estadística

Les dades es van obtenir d'una única preparació sinaptosòmica i no eren independents les unes de les altres. Per provar la importància de l'efecte d'un fàrmac versus control, es va utilitzar una prova t de Student de dues cues. Quan es va requerir una comparació addicional (com ara si un segon tractament va influir en l'acció de l'echinacòsid), es va utilitzar un ANOVA unidireccional seguit de la prova de Tukey. L'anàlisi es va completar mitjançant el programari SPSS (17.0; SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). Les dades s'expressen com a mitjana ˘ SEM; La significació es va avaluar a p < 0,05="" per="" a="" totes="" les="" mesures="">

5. Conclusions

Aquest és el primer estudi que ho demostraequinacòsidinhibeix l'alliberament de glutamat dels sinaptosomes cerebrocorticals de rata reduint l'afluència de Ca2 més a través dels canals Cav2.2 i Cav2.1, i aquesta inhibició de l'alliberament probablement depèn de la supressió de la via de la proteïna cinasa C, almenys en part. La present troballa és valuosa perquè proporciona una visió nova dels mecanismes d'acció de l'echinacòsid al cervell.

Agraïments:Aquest treball va comptar amb el suport d'una subvenció del Ministeri de Ciència i Tecnologia (MOST 103-2320-B-030-001 MY3).

Contribucions de l'autor:Tzu Yu Lin i Su Jane Wang van concebre i dissenyar els experiments; Cheng Wei Lu va realitzar els experiments; Cheng Wei Lu i Shu Kuei Huang van analitzar les dades; Su Jane Wang va escriure el document.

Conflictes d'interès:Els autors declaren que no hi ha conflictes d'interessos.

Conflictes d'interessos: els autors declaren no conflicte d'interessos.

Referències

1. Tu, PF; Wang, B.; Deyama, T.; Zhang, ZG; Lou, ZC Anàlisi de glicòsids feniletanoides deHerba cistancheper RP-HPLC. Acta Pharm. Sin. 1997, 32, 294-300.

2. Dalby-Brown, L.; Barrett, H.; Landbo, Alaska; Meyer, AS; Molgaard, P. Efectes antioxidants sinèrgics d'alcamides, derivats de l'àcid cafeic i fraccions de polisacàrids d'Echinacea purpurea sobre l'oxidació in vitro de lipoproteïnes humanes de baixa densitat. J. Agric. Química dels Aliments. 2005, 53, 9413-9423. [CrossRef] [PubMed]

3. Dapas, B.; Dall'Acqua, S.; Bulla, R.; Agostinis, C.; Perissutti, B.; Invernizzi, S.; Grassi, G.; Voinovich, D. Immunomodulació mediada per un xarop d'herbes que conté un extracte d'arrel d'equinàcia estandarditzat: un estudi pilot en subjectes humans sans sobre l'expressió gènica de citocines. Phytomedicine 2014, 21,1406-1410. [CrossRef] [PubMed]

4. Ell, WJ; Fang, TH; Tu, PF Progrés de la investigació sobre activitats farmacològiques de l'equinacòsid. Xina J. Chin. Mater. Med. 2009, 34, 476-479.

5. Deng, M.; Zhao, JY; Tu, PF.; Jiang, Y; Li, ZB; Wang, YH Echinacoside rescata les cèl·lules neuronals SHSY5Y de l'apoptosi induïda per TNFalfa. Eur. J. Pharmacol. 2004, 505,11-18. [CrossRef] [PubMed]

6. Koo, KA; Sung, SH; Park, JH; Kim, SH; Lee, KY; Kim, YC Activitats neuroprotectores in vitro dels glucòsids feniletanoides del dichotoma de Callicarpa. Planta Med. 2005, 71, 778-780. [CrossRef] [PubMed]

7. Wang, YH; Xuan, ZH; Tian, ​​S.; Du, GH Echinacoside protegeix contra 6-la disfunció mitocondrial induïda per hidroxidopamina i les respostes inflamatòries a les cèl·lules PC12 mitjançant la reducció de la producció de ROS. Evid. Complement de base. Altern. Med. 2015, 2015, 189239. [CrossRef] [PubMed]

8. Zhu, M.; Lu, C.; Li, W. L'exposició transitòria a l'equinacòsid és suficient per activar la senyalització de Trk i protegir les cèl·lules neuronals de la rotenona. J. Neurochem. 2013,124, 571-580. [CrossRef] [PubMed]

9. Geng, X.; Tian, ​​X.; Tu, P.; Pu, X. Efectes neuroprotectors de l'equinacòsid en el model MPTP del ratolí de la malaltia de Parkinson. Eur. J. Pharmacol. 2007, 564, 66-74. [CrossRef] [PubMed]

10. Wei, LL; Chen, H.; Jiang, Y; Tu, PF.; Zhong, M.; Du, J.; Liu, F.; Wang, L.; Liu, CY Efectes de l'equinacòsid sobre els nivells histiocentrals de massa activa en rates d'oclusió de l'artèria cerebral mitjana. Biomed. Entorn. Ciència. 25, 2012 238-244. [PubMed]

11. Wu, CR; Lin, HC; Su, MH Reversió per extractes aquosos deCistanche tubulosade dèficits de comportament en el model de rata semblant a la malaltia d'Alzheimer: rellevància per a la deposició d'amiloide i la funció del neurotransmissor central. Complement BMC. Altern. Med. 2014, 14, 202. [CrossRef] [PubMed]

12. Zhao, Q.; Gao, J.; Li, W.; Cai, D. Efectes neurotròfics i de neurorescat de l'echinacòsid en el model de ratolí MPTP subagut de la malaltia de Parkinson. Cervell Res. 2010, 1346, 224-236. [CrossRef] [PubMed]

13. Meldrum, BS El glutamat com a neurotransmissor al cervell: una revisió de la fisiologia i la patologia. J. Nutr. 2000, 130, 1007S-1015S. [PubMed]

14. Lee, D.; Shim, MS; Kim, KY; No, YH; Kim, H.; Kim, SY; Weinreb, RN; Ju, WK El coenzim Q10 inhibeix l'excitotoxicitat del glutamat i l'alteració mitocondrial mediada per l'estrès oxidatiu en un model de ratolí de glaucoma. Investig. Oftalmol. Vis. Ciència. 2014, 55, 993-1005. [CrossRef] [PubMed]

15. Choi, DW Calci i lesió neuronal excitotòxica. Ann. NY Acad. Ciència. 1994, 747,162-171. [CrossRef] [PubMed]

16. Lau, A.; Tymianski, M. Receptors de glutamat, neurotoxicitat i neurodegeneració. Pflugers. Arc. 2010, 460, 525-542. [CrossRef] [PubMed]

17. Sattler, R.; Tymianski, M. Mecanismes moleculars de la mort de cèl·lules neuronals excitotòxiques mediada pel receptor de glutamat. Mol. Neurobiol. 2001, 24, 107-129. [Ref creuat]

18. Schauwecker, PE Neuroprotecció per antagonistes del receptor de glutamat contra la mort de cèl·lules excitotòxiques induïdes per convulsions en el cervell envellit. Exp. Neurol. 2010, 224, 207-218. [CrossRef] [PubMed]

19. Yeganeh, F.; Nikbakht, F.; Bahmanpoui; S.; Rastegar, K.; Namavar, R. Efectes neuroprotectors de NMDA i antagonistes del receptor de glutamat metabotròpic del grup I contra la neurodegeneració induïda per l'homocisteïna a l'hipocamp de rata: estudi in vivo. J. Mol. Neurosci. 2013, 50, 551-557. [CrossRef] [PubMed]

20. Doble, A. El paper de l'excitotoxicitat en la malaltia neurodegenerativa: implicacions per a la teràpia. Pharmacol. Allà. 1999, 81,163-221. [Ref creuat]

21. Muir, KW Enfocaments terapèutics basats en glutamat: assaigs clínics amb antagonistes de NMDA. Curr. Opina. Pharmacol. 2006, 6, 53-60. [CrossRef] [PubMed]

22. González, JC; Egea, J.; del Carmen Godino, M.; Fernández-Gomez, FJ; Sánchez-Prieto, J.; Gandia, L.; Garcia, AG; Jordan, J.; Hernández-Guijo, JM La minociclina neuroprotectora deprimeix la neurotransmissió glutamatèrgica i la senyalització de Ca2 més a les neurones de l'hipocamp. Eur. J. Neurosci. 26, 2007 2481-2495. [CrossRef] [PubMed]

23. Lu, CW; Lin, TY; Wang, SJ La memantina deprimeix l'alliberament de glutamat mitjançant la inhibició del Ca2 dependent del voltatge més l'entrada i la proteïna cinasa C a les terminals nervioses de l'escorça cerebral de rata: un mecanisme independent del receptor NMDA. Neuroquimia. Int. 2010, 57,168-176. [CrossRef] [PubMed]

24. Wang, SJ; Sihra, TS L'antagonista metabotròpic no competitiu del receptor del glutamat 5 (E)-2-metil-6- estiril-piridina (SIB1893) deprimeix l'alliberament de glutamat mitjançant la inhibició del Ca2 dependent del voltatge més l'entrada a les terminals nervioses cerebrocorticals de rata (sinaptosomes). J. Pharmacol. Exp. Allà. 2004, 309, 951-958. [CrossRef] [PubMed]

25. Dunkley, PR.; Jarvie, PE; Heath, JW; Kidd, GJ; Rostas, JA Un mètode ràpid per aïllar sinaptosomes en gradients de Percoll. Cervell Res. 1986, 372,115-129. [Ref creuat]

26. Araque, A.; Li, N.; Doyle, RT; Haydon, PG SNARE, alliberament de glutamat depenent de proteïnes dels astròcits. J. Neurosci. 2000, 20, 666-673. [PubMed]

27. Dunlop, J. Enfocaments terapèutics basats en glutamat: orientació al sistema de transport de glutamat. Curr. Opina. Pharmacol. 2006, 6,103-107. [CrossRef] [PubMed]

28. Carbassó, R.; Ronca-Testoni, S. El reticle sarcoplasmàtic Ca2 més canal/receptor de rianodina: Modulació per efectors endògens, fàrmacs i estats de malaltia. Pharmacol. Rev. 1997, 49,1-51. [PubMed]

29. Fan, Y.; Li, J.; Zhang, YQ; Jiang, LH; Zhang, YN; Yan, CQ Proteïna quinasa C delta mediada per citotoxicitat de la 6-hidroxidopamina mitjançant l'activació sostinguda de la cinasa 1/2 regulada per senyal extracel·lular a les cèl·lules PC12. Neurol. Res. 2014, 36, 53-64. [CrossRef] [PubMed]

30. Gschwendt, M.; Muller, HJ; Kielbassa, K.; Zang, R.; Kittstein, W.; Rincke, G.; Marks, F. Rottlerin, un nou inhibidor de la proteïna quinasa. Bioquímica. Biofísica. Res. Commun. 1994, 199, 93-98. [CrossRef] [PubMed]

31. Nicholls, DG; Sihra, TS; Sanchez-Prieto, J. Alliberament de glutamat depenent i independent del calci dels sinaptosomes controlat per fluorometria contínua. J. Neurochem. 1987, 49, 50-57. [CrossRef] [PubMed]

32. Nicoll, RA L'acoblament dels receptors de neurotransmissors als canals iònics del cervell. Science 1988, 241, 545-551. [CrossRef] [PubMed]

33. Wu, LG; Saggau, P. Inhibició presinàptica de l'alliberament de neurotransmissors provocat. Tendències Neurosci. 1997, 20, 204-212. [Ref creuat]

34. Turner, TJ; Dunlap, K. Caracterització farmacològica dels canals de calci presinàptics mitjançant mesures bioquímiques subsegons de la neurosecreció sinaptosòmica. Neurofarmacologia 1995, 34, 1469-1478. [Ref creuat]

35. Millan, C.; Sanchez-Prieto, J. Acoblament diferencial de canals de calci de tipus N i P/Q a l'exocitosi de glutamat a l'escorça cerebral de rata. Neurosci. Lett. 2002, 330, 29-32. [Ref creuat]

36. Vázquez, E.; Sanchez-Prieto, J. La modulació presinàptica de l'alliberament de glutamat s'adreça a diferents canals de calci a les terminals nervioses cerebrocorticals de rata. Eur. J. Neurosci. 1997, 9, 2009-2018. [CrossRef] [PubMed]

37. Llarg, P; Mercer, A.; Begum, R.; Stephens, GJ; Sihra, TS; Jovanovic, JN. Els receptors GABAA de la terminal nerviosa activen la senyalització depenent de Ca2/calmodulina per inhibir el Ca2 dependent de voltatge més l'alliberament d'influència i glutamat. J. Biol. Chem. 2009.284, 8726-8737. [CrossRef] [PubMed]

38. Turner, JR; Angle, JM; Negre, ED; Joyal, JL; Sacs, DB; Madara, JL Regulació de la resistència transepitelial dependent de PKC: rols de la MLC i la MLC cinasa. Am. J. Physiol. 1999, 277, C554-C562. [PubMed]

39. Vaughan, PF; Walker, JH; Peters, C. La regulació de la secreció de neurotransmissors per proteïna cinasa C. Mol. Neurobiol. 1998, 18, 125-155. [CrossRef] [PubMed]

40. Coffey, ET; Sihra, TS; Nicholls, DG; Pocock, JM La fosforilació de la sinapsina I i MARCKS a les terminals nervioses està mediada per l'entrada de Ca2 més a través d'un canal de Ca2 plus sensible a Aga-GI que s'acobla a l'exocitosi del glutamat. FEBS Lett. 1994, 353, 264-268. [Ref creuat]

41. Obrenovitch, TP; Urenjak, J. Transmissió glutamatèrgica alterada en trastorns neurològics: des de glutamat extracel·lular elevat fins a una eficàcia sinàptica excessiva. prog. Neurobiol. 1997, 51, 39-87. [Ref creuat]

42. Zhang, D.; Li, H.; Wang, JB Echinacoside inhibeix la fibril·lació amiloide de HEWL i protegeix contra la neurotoxicitat induïda per Ap. Int. J. Biol. Macromol. 2015, 72, 243-253. [CrossRef] [PubMed]

43. Lin, TY; Lu, CW; Wang, CC; Lu, JF; Wang, SJ La hispidulina inhibeix l'alliberament de glutamat a les terminals nervioses cerebrocorticals de rata. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2012, 263, 233-243. [CrossRef] [PubMed]

44. Chang, CY; Lin, TY; Lu, CW; Huang, SK; Wang, YC; Chou, SS; Wang, SJ L'hesperidina inhibeix l'alliberament de glutamat i exerceix una neuroprotecció contra l'excitotoxicitat induïda per l'àcid kaínic a l'hipocamp de les rates. Neurotoxicologia 2015,2015,157-169. [CrossRef] [PubMed]

45. Nicholls, DG; Sihra, TS Els sinaptosomes posseeixen una piscina exocitòtica de glutamat. Natura 1986, 321, 772-773. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Wang, CC; Kuo, JR; Wang, SJ Dimebon, un fàrmac antihistamínic, inhibeix l'alliberament de glutamat a les terminals nervioses cerebrocorticals de rata. Eur. J. Pharmacol. 2014, 734, 67-76. [CrossRef] [PubMed]

47. Tibbs, GR; Barrie, AP; van Mieghem, FJ; Mc-Mahon, HT; Nicholls, DG Potencials d'acció repetitius en terminals nervioses aïllades en presència d'4-aminopiridina: efectes sobre l'alliberament de Ca2 plus lliure citosòlic i glutamat. J. Neurochem. 1989,53,1693-1699. [CrossRef] [PubMed]

48. Akerman, KE; Scott, LG; Heikkila, JE; Heinonen, E. Dependència iònica del potencial de membrana i les respostes vinculades al receptor de glutamat en sinaptoneurosomes mesurades amb un colorant de cianina, DiSC2 (5). J. Neurochem. 1987, 48, 552-559. [CrossRef] [PubMed]

49. Sihra, TS; Bogonez, E.; Nicholls, DG Ca2 localitzat més l'entrada afecta preferentment la desfosforilació de proteïnes, la fosforilació i l'alliberament de glutamat. J. Biol. Chem. 1992, 267,1983-1989. [PubMed]

50. Grynkiewicz, G.; Poenie, M.; Tsien, RY Una nova generació d'indicadors de Ca2 plus amb propietats de fluorescència molt millorades. J. Biol. Chem. 1985, 260,3440-3450. [PubMed]