Part 3: L'equinacòsid aïllat de Cistanche Tubulosa estimula putativament la secreció de l'hormona del creixement mitjançant l'activació del receptor de la grelina

L'equinacòsid aïllat de Cistanche tubulosa estimula putativament la secreció d'hormona de creixement mitjançant l'activació del receptor de la grelina

Chieh-Ju Wu 1, Mei-Yin Chien 2, Nan-Hei Lin 1, Yi-Chiao Lin 1, Wen-Ying Chen 3, Chao-Hsiang Chen 2,4* i Jason TC Tzen 1*

1 Institut de Postgrau de Biotecnologia, Universitat Nacional Chung-Hsing, Taichung 402, Taiwan; baby159357520@gmail.com (C.-JW); CMNHEI@mohw.gov.tw (N.-HL); s9755702@gmail.com (Y.-CL)

2 Ko Da Pharmaceutical Co. Ltd., Taoyuan 324, Taiwan; rd1@koda.com.tw

3 Departament de Medicina Veterinària, Universitat Nacional Chung-Hsing, Taichung 402, Taiwan; wychen@dragon.nchu.edu.tw

4 Institut de Postgrau de Farmacognòsia, Universitat Mèdica de Taipei, Taipei 110, Taiwan

* Correspondència: gm@koda.com.tw (C.-HC); TCTZEN@dragon.nchu.edu.tw (JTCT); Tel.: més 886-4-22840328 (ext. 776) (JTCT); Fax: més 886-4-22853527 (JTCT)

Editor acadèmic: Pinarosa Avato

Rebut: 22 de gener de 2019; Acceptat: 14 de febrer de 2019; Publicat: 17 de febrer de 2019

Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Resum:CistancheS'ha registrat que una espècie, el ginseng del desert, posseeix moltes activitats biològiques a la farmacopea tradicional xinesa i s'ha utilitzat com a medicina antienvelliment. Tres glicòsids feniletanoides:equinacòsid, tubulòsid A i acteòsid: es van detectar a l'extracte d'aigua deCistanche tubulosa(Schenk) R. Wight i el constituent principal,equinacòsid, es va purificar encara més.Echinacòsidd'una concentració superior a 10_6 M va mostrar una activitat significativa per estimular la secreció de l'hormona del creixement de les cèl·lules pituïtàries de rata. De manera similar a l'hormona alliberadora de l'hormona del creixement -6, un anàleg sintètic de la grelina, l'estimulació de la secreció de l'hormona del creixement per l'equinacòsid va ser inhibida per la substància P [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11] , un agonista invers del receptor de la grelina. El modelatge molecular va demostrar que els tres glicòsids feniletanoides van interactuar adequadament amb la butxaca d'unió del receptor de grelina i l'echinacòsid va mostrar una interacció lleugerament millor amb el receptor que el tubulòsid A i l'acteòsid. Els resultats suggereixen que els glicòsids feniletanoides, especialment l'equinacòsid, són constituents actius presumptament responsables dels efectes anti-envelliment de C. tubulosa i es pot considerar que es desenvolupen com a anàlegs no peptidils de la grelina.

Paraules clau: cistanchetubulosa;equinacòsid; grelina; secreció de l'hormona del creixement;feniletanoideglicòsids

equinacòsidencistancheté molts efectes

Si us plau, feu clic aquí per a la part 2

4. Materials i Mètodes

4.1. Productes químics i materials vegetals

Cistanchedeserticola YC Ma es va obtenir d'un mercat local i va ser autenticat pel Dr. Nan-Hei Lin.Cistanchetubulosa (Schenk) R. Wight es va comprar a Sinopharm Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., (Hangzhou, Xina). L'acetonitril, l'àcid fòrmic i el metanol de grau HPLC es van comprar a ECHO Chemical Co., Ltd, (Miaoli, Taiwan). El medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM), el sèrum boví fetal dialitzat (DFBS) i la tripsina-EDTA es van comprar a Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). DNase Em van comprar a Worthington Biochemical (Lakewood, NJ, EUA). L'hormona alliberadora de l'hormona del creixement-6 (GHRP-6) es va obtenir de Gen Way Biotech, Inc. (San Diego, CA, EUA). La col·lagenasa tipus I i la substància P [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11] es van comprar a Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, EUA). El kit ELISA d'hormona de creixement de rata es va comprar a Sunred Biological Technology Corporation (Xangai, Xina).

4.2. Anàlisis HPLC/UV i LC_MSn de l'extracció d'aigua de Cistanche spp.

Tija seca (25 g) deCistanchedeserticola YC Ma orCistanchetubulosa (Schenk) R es va extreure tres vegades amb 500 ml d'aigua destil·lada durant 60 min a 50 graus en un bany maria. La solució es va filtrar a través d'un filtre sirià de 13 mm amb un filtre de membrana PP de 0,45 um (Pall Corporation, Glen Cove, NY, EUA) i es va sotmetre a les anàlisis següents. Es van analitzar els components químics dels extractes

utilitzant una columna Syncronis C18 (4,6 × 250 mm de diàmetre interior, 5 um, Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) al sistema HPLC juntament amb un detector de matriu de fotodíodes model 600E (Waters Corporation,

Milford, MA, EUA). La fase mòbil constava d'aigua (A) que contenia {{0}}, 1 per cent d'àcid fòrmic i (B) acetonitril. El gradient d'elució va ser el següent: 0–60 min, gradient lineal a partir del 14 per cent de B; 0–3 min, del 14% al 17% B; 3–4 min, 17 per cent B; 4–15 min, 17 per cent a 20 per cent B; 15–20 min, 20 per cent B; 20–50 min, 20 per cent a 14 per cent B; 50-60

min, 14 per cent B. La longitud d'ona de detecció d'absorbància ultraviolada (UV) es va establir en 330 nm. Es va connectar un espectròmetre de masses en tàndem quadripol de trampa lineal (LTQ) (Thermo Electron, San Jose, CA, EUA) equipat amb una interfície d'ionització per electrospray (ESI) a un sistema Surveyor LC (Thermo Electron)

amb un bucle de mostra de 5 uL. El gradient d'elució va ser el següent: 0–9{0 min, gradient lineal a partir del 14 per cent de B; 0–24 min, del 14% al 17% B; 24–25 min, 17 per cent B; 25–36 min, 17 per cent a 20 per cent B; 36–37 min, 20 per cent B; 37-80 min,

20% to 14% B; 80–90 min, 14% B. The heated capillary temperature was set at 300℃ with a spray voltage of 4.5 kV. Negative ESI mode was firstly scanned ranging from m/z 400–1000. Data-dependent MSN was obtained using the high purity helium (>99,99 per cent) com a gas de col·lisió.

4.3. Aïllament d'echinacòsid

L'extracte d'aigua de la tija seca (25 g) de C. tubulosa es va concentrar a pressió reduïda per donar un xarop marró profund. L'extracció bruta es va suspendre amb aigua destil·lada i es va liofilitzar amb un liofilitzador. La pols de 100 mg es va resoldre en aigua destil·lada de 5 ml i es va sotmetre a purificació mitjançant la columna Sephadex LH-20 (100 ml; GE Healthcare Bio-Sciences AB, Suècia) eluïda amb una solució aquosa de metanol al 10% i controlada per HPLC . Les fraccions que contenien echinacòsid es van detectar llegint l'absorbància a 245 nm i es van recollir mitjançant un mostreig automàtic.

4.4. Animals

Els experiments van ser aprovats pel Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals de la National Chung_Hsing University amb el número d'aprovació de IACUC 106-079. Es van comprar rates Sprague_Dawley mascles de 250_300 g de pes a BioLASCO, Taiwan Co., Ltd. (Taipei, Taiwan). Es van mantenir dos animals per gàbia en un entorn controlat de 23 o 2, 60 o 10 per cent d'humitat i un cicle de llum/foscor de 12 h. Les rates van ser alimentades amb una dieta estàndard (calories proporcionades

en un 28,7 per cent de proteïnes, un 13,4 per cent de greixos i un 57,9 per cent d'hidrats de carboni, 5001 Rodent LabDiet, St. Louis, MO, EUA) i aigua destil·lada ad libitum.

4.5. Cultiu primari de cèl·lules hipofisàries

Les cèl·lules pituïtàries es van aïllar segons un mètode de dispersió enzimàtica modificat desenvolupat per Yamazaki et al. [29]. Breument, les rates masculines Sprague Dawley van ser anestesiades amb Zoletil 50 (40 mg/kg, IP; Virbac Laboratories, Carros, França), i les glàndules pituïtàries anteriors es van eliminar i es van dispersar per cultivar cèl·lules pituïtàries en suspensió, tal com es va descriure anteriorment [30].

4.6. Assaig de secreció de l'hormona del creixement

Les cèl·lules pituïtàries anteriors primàries de 4 × 104 cèl·lules/pou es van cultivar a 37 graus amb un 5% de CO2 durant 2 dies abans de l'assaig de secreció de l'hormona del creixement segons el protocol descrit anteriorment [30].

Després de l'eliminació del medi de cultiu, les cèl·lules es van morir de fam en el medi d'àguila modificada de Dulbecco (DMEM) sense sèrum durant 90 minuts per estabilitzar la secreció d'hormones basals. El medi de fam es va substituir per DMEM fresc que contenia equinacòsid (de 10_8 a 10_5 M) o GHRP-6 (un agonista d'un receptor de grelina humana, GHSR, 10_7 M) com a control positiu, i les cèl·lules es van incubar durant 15 i 30 min a 37 graus amb un 5 per cent de CO2. Per a la detecció de l'efecte antagonista, les cèl·lules es van incubar amb un GHSR

agonista invers, [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-substància P (0,5 uM), i després tractat amb DMEM que conté equinacòsid (10_5 M) o GHRP-6 (10_7 M) durant 30 min. El mitjà es va recollir per

determinació de la secreció d'hormona de creixement mitjançant un kit ELISA d'hormona de creixement de rata (Shanghai Sunred Biological Technology Corporation).

4.7. Anàlisi estadística

Les dades es van presentar com a valors mitjans o SD. Les diferències es van analitzar mitjançant T-Test. Els càlculs estadístics van ser realitzats per GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EUA). Es va considerar que un nivell de p < 0,05="" era="" estadísticament="">

4.8. Modelatge i acoblament d'homologia

El modelatge d'homologia i l'acoblament a un receptor humà de grelina, el receptor secretagog de l'hormona del creixement (GHSR, número d'adhesió AAI13548), es va establir seguint la nostra construcció anterior [21, 24]. Breument, les estructures cristal·lines dels receptors adrenèrgics 1 i 2 (PDB 2YCY i 3PDS) amb lligands units, cianopindolol i FAUC50 es van utilitzar com a plantilles per construir l'estructura GHSR [31,32]. L'estructura GHSR amb l'energia total de PDF més baixa es va seleccionar per a un acoblament posterior amb GHRP-6, echinacòsid, tubulòsid A i acteòsid. Tots els processos de modelatge es van realitzar mitjançant la plataforma Discovery Studio 2.1 (http://accelrys.com/).

L'estructura 3D de GHRP-6 es va descarregar de la base de dades composta Pub-Chem al lloc web de NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Les estructures 3D d'echinacòsid, tubulòsid A i acteòside es van construir mitjançant el programa Chem3D (http://www.cambridgesoft.com/). El lloc d'unió de lligands de GHSR es va definir com l'espai esfèric amb un radi de 14 Å des del centre de la butxaca d'unió a la simulació d'acoblament. L'acoblament de GHRP-6, echinacòsid, tubulòsid A o acteòsid al lloc d'unió de GHSR es va realitzar in silico mitjançant l'ús del mòdul LibDock al paquet Discover Studio 2.1 i es va minimitzar encara més mitjançant un algorisme de minimització intel·ligent amb el camp de força CHARMm al camp de força CHARMm. Paquet Discover Studio 2.1 [33]. Per comparar les afinitats d'unió relatives de l'echinacòsid, el tubulòsid A i l'acteòsid en GHSR, es va utilitzar l'àrea central activa construïda amb GHRP-6 a GHSR per a l'acoblament i l'energia d'unió es va calcular per GEMDOCK (Institut de Bioinformàtica). , Universitat Nacional de Chiao Tung, Taiwan).

Contribucions de l'autor: experiments amb animals, C.-JW, Y.-CL i W.-YC; Identificació i purificació: MY.C., N.-HL i C.-HC; Modelització molecular: C.-JW, Y.-CL i JTCT; Disseny i redacció del projecte: C.-HC i JTCT

Finançament: el treball va comptar amb el suport d'una subvenció a Jason TC Tzen de la National Chung-Hsing University (NCHU-102D604).

Agraïments: els autors agraeixen a Tian-Shun Weng per compartir la seva experiència professional en l'ús de les espècies de Cistanche.

Conflictes d'interessos: Tots els autors declaren no conflictes d'interessos.

Referències

1. Wang, T.; Zhang, X.; Xie, W. Cistanche deserticola YC Ma, "Desert ginseng": A review. Am. J. Chin. Med. 2012,40, 1123–1141. [CrossRef] [PubMed]

2. Wang, T.; Chen, C.; Yang, M.; Deng, B.; Kirby, MG; Zhang, X. L'extracte d'etanol de Cistanche tubulosa media els nivells d'hormones sexuals de rata mitjançant la inducció d'enzims esteroidogènics testiculars. Farmàcia. Biol. 2016, 54, 481–487. [CrossRef] [PubMed]

3. Lin, WY; Chun, Y.; Jack, C.; Kao, ST; Tsai, FJ; Liu, HP Vies moleculars relacionades amb la promoció de la longevitat i la millora cognitiva de Cistanche tubulosa a Drosophila. Phytomedicine 2017, 26, 37–44. [Ref creuat]

4. Wu, CR; Lin, HC; Su, MH Reversió per extractes aquosos de Cistanche tubulosa a partir de dèficits de comportament en el model de rata similar a la malaltia d'Alzheimer: rellevància per a la deposició d'amiloide i la funció del neurotransmissor central. Complement BMC. Altern. Med. 2014, 14, 202. [CrossRef]

5. Xuan, GD; Liu, CQ Investigació sobre l'efecte dels glicòsids feniletanoides (PEG) de la Cistanche deserticola sobre l'anti-envelliment en ratolins vells induït per D-galactosa. Zhong Yao Cai 2008, 31, 1385–1388. [PubMed]

6. Jiang, Y.; Tu, PF Anàlisi de constituents químics en espècies de Cistanche. J. Cromatogr. 2009, 1216, 1970–1979. [CrossRef] [PubMed]

7. Gao, C.; Wang, C.; Wu, G. Cistanche glucòsids totals sobre la influència de l'aprenentatge i la memòria de les rates de demència vascular i la investigació del mecanisme. Barbeta. Herba. Med. 2005, 36, 1852–1855.

8. Li, F.; Yang, Y.; Zhu, P.; Chen, W.; Qi, D.; Shi, X.; Zhang, C.; Yang, Z.; Li, P. Echinacoside afavoreix la regeneració òssia augmentant la relació OPG/RANKL a les cèl·lules MC3T3-E1. Fitoterapia 2012, 83, 1443–1450. [Ref creuat]

9. Shimoda, H.; Tanaka, J.; Takahara, Y.; Takemoto, K.; Shan, SJ; Su, MH Els efectes hipocolesterolèmics de l'extracte de Cistanche tubulosa, una medicina tradicional xinesa crua, en ratolins. Am. J. Chin. Med. 2009, 37, 1125–1138. [Ref creuat]

10. Tang, F.; Hao, Y.; Zhang, X.; Qin, J. Efecte de l'equinacòsid sobre la fibrosi renal per inhibició de la via de senyalització TGF- 1/Smads en el model de ratolins DB/DB de nefropatia diabètica. Drug Des. Desenvolupament. Allà. 2017, 11,2813–2826. [Ref creuat]

11. Xiong, WT; Gu, L.; Wang, C.; Sol, HX; Liu, X. Efectes antihiperglucèmics i hipolipidèmics de Cistanche tubulosa en ratolins DB/DB diabètics tipus 2. J. Etnofarmacol. 2013, 150, 935–945. [CrossRef] [PubMed]

12. Bao, XX; Ma, HH; Ding, H.; Li, WW; Zhu, M. Optimització preliminar d'una fórmula de medicina herbal xinesa basada en els efectes neuroprotectors en un model de rata de la malaltia de Parkinson induïda per rotenona. J. Integr. Med. 2018, 16, 290–296. [CrossRef] [PubMed]

13. Kojima, M.; Hosoda, H.; Data, Y.; Nakazato, M.; Matsuo, H.; Kanagawa, K. Ghrelin és un pèptid acilat que allibera l'hormona del creixement de l'estómac. Natura 1999, 402, 656–660. [CrossRef] [PubMed]

14. Zigman, JM; Jones, JE; Lee, CE; Saper, CB; Elmquist, JK Expressió de l'ARNm del receptor de grelina al cervell de rata i ratolí. J. Comp. Neurol. 2006, 494, 528–548. [CrossRef] [PubMed]

15. Castaneda, TR; Tong, J.; Datta, R.; Culler, M.; Tschop, MH Ghrelin en la regulació del pes corporal i el metabolisme. Davant. Neuroendocrinol. 2010, 31, 44–60. [CrossRef] [PubMed]

16. Rudman, D.; Feller, AG; Nagraj, HS; alemanys, GA; Lalitha, PY; Goldberg, AF; Schlenker, RA; Cohn, L.; Rudman, IW; Mattson, DE Efectes de l'hormona del creixement humà en homes de més de 60 anys. N. Anglès. J. Med. 1990, 323, 1–6. [CrossRef] [PubMed]

17. Liu, H.; Bravata, DM; Olkin, I.; Nayak, S.; Roberts, B.; Garber, AM; Hoffman, AR Revisió sistemàtica: la seguretat i l'eficàcia de l'hormona del creixement en la gent gran sana. Ann. Becari. Med. 2007, 146, 104–115. [CrossRef] [PubMed]

18. Giordano, R.; Bonelli, L.; Marinazzo, E.; Ghigo, E.; Arviat, E. Tractament de l'hormona del creixement en l'envelliment humà: beneficis i riscos. Hormones 2008, 7, 133–139. [CrossRef] [PubMed]

19. Sattler, FR Hormona del creixement en el mascle envellit. Millor pràctica. Res. Clin. Endocrinol. 2013, 27, 541–555. [Ref creuat]

20. Heus aquí, YH; Chen, YJ; Chang, CI; Lin, YW; Chen, CY; Lee, MR; Lee, VS; Tzen, JTC Teaghrelins, tetraglicòsids flavonoides acilats únics en el te oolong Chin-shin, són putatius agonistes orals del receptor de la grelina.

J. Agric. Química dels Aliments. 2014, 62, 5085–5091. [Ref creuat]

21. Hsieh, SK; Mira, YH; Wu, CC; Chung, TY; Tzen, JTC Identificació d'intermedis biosintètics de teaghrelins i compostos semblants a teaghrelin en tes oolong, i el seu acoblament molecular al receptor de grelina.

J. Food Drug Anal. 2015, 23, 660–670. [Ref creuat]

22. Hsieh, SK; Chung, TY; Li, YC; Mira, YH; Lin, NH; Kuo, PC; Chen, WY; Tzen, JTC Ginkgoghrelins, glucòsids flavonoides acilats únics en Folium Ginkgo, estimulen la secreció de l'hormona del creixement mitjançant l'activació del receptor de la grelina. J. Etnofarmacol. 2016, 193, 237–247. [Ref creuat]

23. Han, L.; Mavis, BY; Liu, E.; Zhang, Y.; Li, W.; Cançó, X.; Fu, F.; Gao, X. Caracterització estructural i identificació de glicòsids feniletanoides de Cistanches deserticola YC Ma per UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS. Fitoquímica. Anal. 2012, 23, 668–676. [Ref creuat]

24. Lu, D.; Zhang, J.; Yang, Z.; Liu, H.; Li, S.; Wu, B.; Ma, Z. Anàlisi quantitativa de Cistanches Herba mitjançant cromatografia líquida d'alt rendiment combinada amb detecció de matrius de díodes i espectrometria de masses d'alta resolució combinada amb mètodes quimiomètrics. J. Set. Sci. 2013, 36, 1945–1952. [Ref creuat]

25. Lluna, M.; Kim, HG; Hwang, L.; Seo, JH; Kim, S.; Hwang, S.; Kim, S.; Lee, D.; Chung, H.; Oh, MS; et al. Efecte neuroprotector de la grelina en el 1-metil-4-fenil-1, 2, 3, un model de ratolí 6-tetrahidropiridina de la malaltia de Parkinson bloquejant l'activació de la microglia. Neurotox. Res. 2009, 15, 332–347. [Ref creuat]

26. Lupien, SJ; Isabelle, OM; Hupbach, A.; Tu, MT; Buss, C.; Walker, D.; Pruessner, J.; Mcewen, BS Més enllà del concepte d'estrès: càrrega alostàtica: una perspectiva biològica i cognitiva del desenvolupament. En psicopatologia del desenvolupament: volum dos: neurociència del desenvolupament; John Wiley & Sons, Inc.: Nova York, NY, EUA, 2015; pàgines 578–628.

27. Rizzo, M.; Rizvi, AA; Sudar, E.; Soskic, S.; Obradovic, M.; Montalto, G.; Boutjdir, M.; Mikhailidis, DP; Isenovic, ER Una revisió dels efectes cardiovasculars i antiaterogènics de la grelina. Curr. Farmàcia. Des. 2013, 19, 4953–4963. [Ref creuat]

28. Holst, B.; Lang, M.; Brandt, E.; Bach, A.; Howard, A.; Frimurer, TM; Beck-Sickinger, A.; Schwartz, TW Agonistes inversos del receptor de la ghrelina: identificació d'un nucli peptídic actiu i els seus epítops d'interacció al receptor. Mol. Pharmacol. 2006, 70, 936–946. [Ref creuat]

29. Yamazaki, M.; Nakamura, K.; Kobayashi, H.; Matsubara, M.; Hayashi, Y.; Kanagawa, K.; Sakai, T. Efecte de regulació de la grelina sobre la secreció d'hormona de creixement a partir de cèl·lules pituïtàries anteriors de rata perfuses. J. Neuroendocrinol. 2002, 14, 156–162. [Ref creuat]

30. Heus aquí, YH; Chen, YJ; Chung, TY; Lin, NH; Chen, WY; Chen, CY; Lee, MR; Chou, CC; Tzen, JTC Emoghrelin, un derivat únic de l'emodina a Heshouwu, estimula la secreció de l'hormona del creixement mitjançant l'activació del receptor de la grelina. J. Etnofarmacol. 2015, 159, 1–8. [Ref creuat]

31. Moukhametzianov, R.; Warne, T.; Edwards, PC; Serrano-Vega, MJ; Leslie, AG; Tate, CG; Schertler, GF Dues conformacions diferents de l'hèlix 6 observades en estructures unides a antagonistes d'un receptor beta1-adrenèrgic. Proc. Natl. Acad. Ciència. EUA 2011, 108, 8228–8232. [Ref creuat]

32. Rosenbaum, DM; Zhang, C.; Lyons, JA; Holl, R.; Aragao, D.; Arlow, DH; Rasmussen, SG; Choi, HJ; Devree, BT; Sunahara, RK; et al. Estructura i funció d'un complex irreversible agonista-adrenoceptor beta(2). Natura 2011, 469, 236–240. [Ref creuat]

33. Brooks, BR; Bruccoleri, RE; Olafson, BD; Estats, DJ; Swaminathan, S.; Karplus, M. CHARMM—Un programa per a l'energia macromolecular, minimització i càlculs dinàmics. J. Informàtica. Chem. 1983, 4, 187–217. [Ref creuat]