Part 5: Mapeig de la interacció epigenòmica i transcriptòmica durant la formació i el record de la memòria al conjunt d'engrames hipocampals

ali.ma@wecistanche.com

Si us plau, feu clic aquí per a la part 6

Si us plau, feu clic aquí a la part 5

Dades esteses Fig. 2: Els DAR estables s'enriqueixen principalment per a marques potenciadores

( a ) Flux de treball per a la dissecció per citometria de flux de les diferents poblacions neuronals de l'hipocamp, durantmemòriaformació i recuperació. Gràfics FACS representatius que mostren l'expressió de tota la població (tauler esquerre). Es va fer una selecció addicional en nuclis únics i població NeuN plus / DAPI més (tauler mitjà). Finalment, la selecció es va fer sobre la subpoblació tancada; GFP plus (ajustat a ~ 2, 5 per cent de totes les cèl·lules), ARC més / GFP plus (~ 0, 15 per cent de totes les cèl·lules) i els nuclis es van classificar a tubs Eppendorf d'1, 5 ml recoberts amb 200 ul d'1 per cent de PBS.

Feu clic aL'extracte de Cistanche en pols millora la memòria

(b) Diagrama de Venn (esquerra) i taula (dreta), il·lustren la superposició entre els DAR identificats en les diferents comparacions per parelles durantmemòriaformació i rememoració.

( c ) Es va realitzar una anàlisi estadística basada en el mostreig per determinar si els enriquiments dels estats de cromatina sobre les emissions de ChromHMM (observades) són estadísticament significatius. L'enriquiment esperat es va calcular realitzant 10,000 conjunts aleatoris de superposicions (permutacions) entre "tots els llocs accessibles" i "tots els llocs de modificació d'histones (és a dir, totes les emissions)" i es va presentar com un histograma a la figura. La mida de la mostra de cada conjunt aleatoritzat es va determinar per la mida dels DAR de cada estat. Es va calcular la mitjana i la desviació estàndard de la mostra (taula suplementària 3). El nombre de superposicions observades entre els DAR i cada emissió es va calcular i es va presentar com a línies. La puntuació z es va calcular com a guaret; Z=(valors observats (X) – mitjana de la mostra (μ))/(desviació estàndard de la mostra (σ)). puntuació z Basal vs precoç; SE 10,5, WE 6,9. estable; SE 16,9, WE 12,7, tots p <0,0001, puntuació="" z="" early="" vs="" late;="" sp="" 91.7,="" wp="" 38.7.="" tard="" vs.="" reactivat;="" sp="" 26.8,="" wp="" 28.9,="" totes=""><0.0001. p-values="" (two-sided)="" were="" calculated="" from="" the="" z-table.="" a="" full="" analysis="" is="" reported="" in="" supplement="" table="">

(d) El gràfic circular mostra el percentatge de diferents estats potenciadors, per a totes les regions estables. La superposició de cada regió estable es va realitzar amb les dades de ChIP-seq H3K4me1 i H3K27ac publicades anteriorment, obtingudes 1 h després de FS21. Els estats potenciadors es van classificar com a "primerats": es superposen amb regions marcades només amb H3K4me1, "actius" - amb H3K4me1/H3K27ac o "latents" - sense solapament.

(e) Motifs identified from nucleosome-free regions (NFR) on the ATAC-seq tracks from each state (Basal, Activated -early, Activated -late, and Reactivated). Peaks were divided into positions that were annotated to promoters (5kb from TSS) and enhancers (>5 kb de TSS). La mida del cercle indica el percentatge d'enriquiment (1-50 per cent). El color indica –log (valor P).

Dades ampliades Fig. 3: Cebament coordinat de l'estat epigenètic durantmemòriacodificació i

( a ) Les propietats de les interaccions detectades a Chicago en cada fase (Basal, Activat -precoç, Activat -tard i Reactivat). La configuració predeterminada i un llindar de puntuació de 5 es van utilitzar en trucades d'interacció significatives, realitzades conjuntament en totes les rèpliques.

(b) El gràfic de sectors representa el percentatge de totes les interaccions detectades a Chicago que estan delimitades per H3K27ac/H3K4me1 (67,5% de marques de potenciadors), H3K4me3/H3K9ac (46,2% de marca de promotors) o H3K27me3 (1,1% de marques repressives).

(c) Imatge del navegador de l'epigenoma WashU, que abasta una regió de ~ 500 Kb al voltant dels gens Eif4e2. Els arcs mostren potenciadors comuns (rectangle vermell) i únics (fletxes) significatius que interaccionen amb els promotors (rectancle blau).

(d) Exemples d'interaccions anomenades per Chicago. Gràfics que mostren tots els recomptes de lectura de bait-other-end (potenciador), dins de 500–700 kb (aigües amunt i aigües avall) del Grink3 i Promotors de la Wwc2. Les interaccions significatives detectades per Chicago (puntuació superior o igual a 5) es mostren en vermell, i les interaccions inferiors al llindar (3 inferior o igual a la puntuació < 5)="" es="" mostren="" en="" blau.="" les="" línies="" grises="" mostren="" els="" recomptes="" esperats="" i="" les="" línies="" discontínues="" el="" límit="" superior="" dels="" intervals="" de="" confiança="" del="" 95%.="" (e)="" anàlisi="" d'enriquiment="" de="" superposició="" entre="" potenciadors="" d'interacció="" i="" dar,="" mitjançant="" un="" procediment="" de="" permutació="" en="" 10,000="" conjunts="" aleatoris="" de="" llocs="" accessibles.="" l'histograma="" presenta="" una="" distribució="" de="" mostreig="" aleatòria="" dels="" llocs="" accessibles="" per="" a="" cada="" condició="" (basal="" vs.="" activat="" -="" primerenca,="" activat="" -precoç="" vs.="" activat="" -tard,="" activat="" -tard="" vs.="" reactivat,="" estable).="" el="" nombre="" de="" loci="" superposats="" es="" presenta="" en="" línies="" de="" colors="" a="" partir="" de="" les="" neurones="" basals,="" activades="" primerenques,="" activades="" tardanes="" i="" reactivades.="" dar="" de="" bas="" vs.="" activat="" -precoç="" (puntuació="" z;="" 7,1,="" 7,7,="" 8,5,="" 10,9).="" dar="" d'activat="" -early="" vs.="" activat="" -tard="" (puntuació="" z;="" -0,1,="" -0,8,="" -2,4,="" -3,2).="" dar="" d'activat="" -tard="" vs.="" reactivat="" (0,4,="" 1,8,="" 0,4,="" -0,2).="" dar="" d'estable="" (puntuació="" z;="" 1,7,="" 2,0,="" 6,5,="">

Dades ampliades Fig. 4: Canvis de cromatina que es produeixen durant la fase inicial d'habilitació

( a ) Anàlisi de superposició entre els noms dels gens de l'anàlisi diferencial per parelles i les dades publicades anteriorment de i) cèl·lules de grànuls DG activades 1 h després d'una nova exposició32 ii) 24 h després de FS20 i iii) després d'una estimulació prolongada (6 h) de cultiu cortical de ratolí. neurones amb KCl33. L'anàlisi es va dur a terme mitjançant el paquet GeneOverlap R.

( b ) Les lectures exòniques (vermell) i intròniques (blau) es van quantificar per separat en totes les condicions i es van comparar amb l'activitat transcripcional mesurada per DEseq2. Les lectures es van normalitzar (RPKM) i es presenten els canvis de log2FC per a cada estat. la trama del violí indica la mitjana,

rang interquartil, i el mínim i màxim, ANOVA unidireccional (paramètric, no aparellat), basal vs. precoç; F (5, 248)=389.9. Primera vs Tarda; F (5, 2374)=2183. Tard vs. Reactivat. F (5, 1357) {{10}},5, Totes les P < 0,0001.="" les="" múltiples="" comparacions="" de="" bonferroni.="" ns="no" significatiu,="" ***p=""><>

( c ) Es van mesurar les relacions exó/intró a cada clúster en totes les condicions (escala Log2FC). El gràfic de violí indica la mitjana, el rang interquartil i el mínim i màxim, ANOVA unidireccional (paramètric, no aparellat), F (5, 1143)=260.2, P<0.0001. bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test.="" n.s="non-significant," ***p="" <="">

(d) Anàlisi de superposició entre DAR i DEG durant diferentsmemòriafases. Els DAR a les regions intergèniques i introns es van cartografiar als seus respectius gens amb els mapes d'interacció pc-HiC. L'anàlisi de superposició es va dur a terme pel paquet GeneOverlap R. El valor P (nombres) i la relació de probabilitats (color) de la prova exacta de Fisher es presenten al mapa de calor. ns - no significatiu.

( e ) Correlació de Pearson entre els valors de log2FC de DAR i log2FC DEG que es van anotar a aquesta regió (les regions intergèniques es van cartografiar mitjançant el conjunt de dades pc-HiC). Els canvis d'accessibilitat de la cromatina es van comparar amb lectures exòniques analitzades (línia vermella), lectures intròniques (línies blaves) i canvis transcripcionals totals (tant lectures intròniques com exòniques) mesurats per Desq2 (línia grisa). Tots els valors r i p es mostren a la taula suplementària 9.

Dades esteses Fig. 5: Els canvis transcripcionals en les neurones activades-tarde es correlacionaven més

( a ) Les lectures exòniques (vermell) i intròniques (blau) es van quantificar per separat en totes les condicions per a cadascun dels grups identificats a la figura 5B. Les lectures es van normalitzar (RPKM) i es presenten els canvis de log2FC per a cada clúster.

( b ) Es van mesurar les relacions exó/intró a cada clúster en totes les condicions. El gràfic de violí indica la mitjana, el rang interquartil i el mínim i el màxim, n=3 mostres biològicament independents ANOVA unidireccional (paramètric, no aparellat), Dw –Clúster tardà; F (3.968)

652) = 93.97, P<0.0001. reactivation="" -cluster;="" f="" (3,="" 1600)="485.2,"><0.0001. bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test="" to="" deseq2="" reads.="" ***p="" <="">

Estesa Dades Fig. 6: Distint temporalment transcripcionals programes són ser sincronitzat a

de manera dependent en presència de tamoxifè. Al plafó dret, imatges representatives de l'IHC del DG. Verd - AAV-eYFP, Vermell - Arc endogen. La barra d'escala representa 50 μm.

(b) Avaluació de la morfologia de les espines durant diferentsmemòriafases. El panell dret mostra un únic eYFP més un eix dendrític amb diferents tipus d'espines (Stubby, Thin, Mushroom, Enlarged). La barra d'escala representa 5 μm. El diagrama de caixa indica la mitjana, l'interval interquartil i el mínim i el màxim, Activat -early: n=4 ratolins /5 secció per animal, Activat -tard: n=4 ratolins /4 secció per animal, Reactivat: n=4 ratolins /2 secció per animal. ANOVA unidireccional (paramètric, no aparellat), Stubby; F (2, 36)=2,313, P=0,1135. Prim; F (2, 36)=35.12, pàg<0.0001. mushroom;="" f="" (2,="" 36)="38.42," p="" <="" 0.0001.="" bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test,="" ***p="" <="">

(c) Imatges IHC representatives i quantificació dels nivells de proteïnes de dos membres de la família EIF; (esquerra) Eif2a i (dreta) Eif3e. La barra d'escala representa 10 μm. Les dades de l'eix dendrític es presenten com una relació entre el nombre i la longitud (μM). n=4 ratolins /5 secció per animal, el diagrama de caixa indica la mitjana, el rang interquartil i el mínim i màxim, ANOVA unidireccional (paramètric, no aparellat) amb la prova de comparacions múltiples de Bonferroni, ns - no significatiu, Eif2a Shaft; F (2, 20)=4,484, P{=0,0246. Soma; F (2, 21)=19,58, P <0,0001. (activat="" -early="" vs.="" activat="" -tard="" *p="0.0142," activat="" -early="" vs.="" reactivat="" *p=""><0,0001, activat="" -tard="" vs.="" reactivat="" *p="" {="0,0303)." eif3e="" eix;="" f="" (2,="" 14)="1,983," p="0,1745." soma;="" f="" (2,="" 23)="8.309," p="0.0019," (activat="" -early="" vs.="" reactivat="" *p="" {="0.0057," activat="" -tard="" vs.="" reactivat="" *p="" {{="">

(d) El gràfic de sectors presenta el percentatge d'espines de bolets ampliades (Dh superior o igual a 3Dn) i d'espines de bolets de les neurones activades tardanes i reactivades.

( e ) Imatges representatives (tauler esquerre) i quantificació (plafó dret) dels nivells d'ARNm de Gria1, durant diferents fases dememòria. Les dades es presenten com una relació entre diversos punts i la longitud de l'eix dendrític. La barra d'escala representa 10 μm. N=4 ratolins /5 secció per animal, el diagrama de caixa indica la mitjana, el rang interquartil i el mínim i màxim, Shaft; ANOVA unidireccional (paramètric, no aparellat) F (2, 15)=10,41, P=0,0015. Prova de comparacions múltiples de Bonferroni, **P=0,0011. panell inferior - Soma; ANOVA unidireccional F (2, 12)=0,13, P=0,88.

Dades ampliades Fig. 7: Les interaccions amb diferents potenciadors combinatoris condueixen a un direccional

(a) Els diagrames de Venn mostren el percentatge de superposició entre l'accessibilitat de la cromatina (DAR) a totmemòriafases (BAS vs. Activat -primer, cercle de graella verd clar; Activat -precoç vs. Activat -tard, cercle de graella verd fosc; Activat -tard vs. Reactivat, cercle de graella taronja) i canvis transcripcionals totals de tots els grups identificats (Dw - tard, Amunt –tard, Estable, Reactivació, cercle blau de quadrícula). Els DAR intergènics i introns es van cartografiar als seus respectius gens amb els mapes d'interacció pc-HiC. El percentatge de superposició es va calcular a partir de tots els DEG identificats als clústers (n=1095).

(b) Anàlisi de superposició entre DAR (per parelles) i DEG de cada clúster. Els DAR intergènics i introns es van cartografiar als seus respectius gens amb els mapes d'interacció pc-HiC.

L'anàlisi de superposició es va dur a terme pel paquet GeneOverlap R. Els valors P i els valors de Jaccard (color) de la prova exacta de Fisher es presenten al mapa de calor (esquerra). El percentatge de superposició es va calcular a partir de tots els DEG identificats als clústers (dreta).

( c ) Imatge representativa de la cromatina i els canvis transcripcionals del locus Gabrb3 del clúster Dw-late. Tot i que les interaccions d'estat primerenc eren entre el promotor i els potenciadors amb activadors transcripcionals (Ap1), les interaccions d'estat tardà eren amb repressors transcripcionals (Slug). Les pistes del navegador del genoma IGV superior (morat - basal, verd clar - activat - primerenca, verd fosc - activat -tard i taronja - reactivat) presenten canvis transcripcionals (ncRNA-seq), les pistes mitjanes mostren la dinàmica d'accessibilitat de la cromatina (ATAC-seq) al promotor (rectangle vermell) i potenciadors (rectangle gris). Les interaccions importants promotor-potenciador es representen com arcs (traces del navegador WashU). La pista inferior presenten motius que es van identificar mitjançant eines HOMER (Slug, Ap1 i Rest).

(d) Gràfics d'agregació per a motius individuals. Els valors d'enriquiment (motius per bp / per pic) de sis motius seleccionats (dos repressors, dos activadors i dos bivalents) es van avaluar al voltant del centre dels pics (-/ més 4000 bp) de cada clúster.

Dades ampliades Fig. 8: Model proposat de l'accessibilitat de la cromatina, la interacció promotor-potenciador i la dinàmica transcripcional de les neurones de l'engrama de memòria de l'hipocamp

regions, que alberguen motius activadors transcripcionals. Aquesta reprogramació del promotor-potenciador dóna lloc a un augment de l'expressió gènica que presumiblement permet l'estabilització de lamemòria. Recordatori: les neurones de l'engrama reactivades van utilitzar un subconjunt d'interaccions promotor-potenciador cebades, que s'associa amb canvis transcripcionals implicats en el transport de l'ARNm als compartiments sinàptics i la traducció de proteïnes. Factor de transcripció – TF, E(1–3) – diferents potenciadors que interaccionen amb el mateix promotor, Vermell - repressors transcripcionals, Blau - activadors transcripcionals.

Material complementari

Consulteu la versió web de PubMed Central per obtenir material suplementari.

Agraïments

Donem les gràcies a E. Niederst, J. Penney, S. Barker, RT Stott, M. Victor, A. Watson, N. Dedic, E. Lockshin i els membres de L.HT Lab per la discussió i els suggeriments útils. Donem les gràcies als directors del laboratori Y. Zhou, E. McNamara pel manteniment de la colònia de ratolins. Agraïm a P. Autissier (Institut Whitehead) l'ajuda amb FACS. Finançament: Aquests treballs van comptar amb el suport de subvencions NIH RF1AG062377, AF1AG054012, RO1NS102730, RF1AG064321, The JPB Foundation, The Alana Down Syndrome Research Foundation, The LuMind Down Syndrome Research Foundation, Cure Alzheimer's Fund CIRCUITS i Robert A consortium Renee E. Fundació Família Belfer a LH.T. This work was also supported in part by NIH grants R01AG058002, U01NS110453, R01AG062335, UG3NS115064 to MK and LH.T, and R01AG067151, R01MH109978, U01MH119509, R01HG008155, U24HG009446 to MKVD is supported by an AARF-19-618751 grant from Alzheimer's Association . HSM compta amb el suport del Burroughs Wellcome Fund i la beca postdoctoral UNCF-Merck. C. A compta amb el suport de la Fundació JPB. RMR compta amb el suport de la subvenció NIH T32 5T32HD09806. El kit de preparació de biblioteques Hi-C es va rebre com un generós regal de DovetailTM (v.1.03, Dovetail Genomics, Chicago, EUA). Donem les gràcies a l'equip de Dovetail per la discussió i els suggeriments útils.