Part Ⅱ: aïllament guiat per desreplicació de nous diglicòsids substituïts per fenilpropanoides de salsa de Cistanche i la seva activitat inhibidora sobre la producció de NO en macròfags
Mar 04, 2022
Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com
Un grup 3-metilbutenil, una subestructura d'aglicona, va ser suggerit per les correlacions COSY de H-2 amb H-1a i H-1b i les correlacions HMBC entre H{{ 4}} i H-5 i els carbonis olefínics, a kC 120,7 (C{-2) i 136,4 (C{-3). Es van establir dos fragments de sucre mitjançant l'anàlisi d'espectres de RMN i l'anàlisi d'espectres d'HPLC de l'hidrolitzat àcid, amb patró de fragments MS. Es va determinar que la seva configuració absoluta era D-glucosa i L-ramnosa mitjançant l'anàlisi HPLC de l'hidrolitzat àcid [17]. Aquests fragments de sucre es van definir com una -glucosa i una a-ramnosa mitjançant l'acoblament de constants dels protons anomèrics. L'espectre 1H-1H COSY va mostrar correlacions seqüencials des de H-13 a H-63 i de H{-133 a H{-633 (figura 4).
Un protó de glucosa desplaçat a la baixa a kH 4,70 (H-43) va suggerir un substituent acil a la glucosa. A partir de l'espectre HMBC, la correlació entre H-43 i C{-9333 va confirmar la posició del substituent de cafeoil. Les correlacions HMBC entre H-13 i C-1 (kC 64,5) i entre H{-33 (kH 3,68) i C{-133 (kC 101,2) van suggerir les posicions de cada substituent . En conseqüència, l'estructura de 6 es va determinar com a 3-metilbutenil-O- -L-ramnopiranosil-(1→3)-4-O-(E)-cafeoil- -D- glucosa-piranòsid i anomenat cistansalside B.
Cistansalside C (12), una pols amorf marró, es va determinar que tenia una fórmula molecular de C26H38O13 per (plus)-HR-ESI-QTOF-MS, que va mostrar un pic a m/z 581,2213 [M més Na] més (calc. per C26H38O13Na, 581,2205). Un ió característic a m/z 163 va suggerir que hi havia un substituent de cafeoil a l'estructura. Els ions fragments a m/z 325 i m/z 471 van suggerir l'existència d'una unitat de ramnosa i una unitat de glucosa.
La comparació dels espectres de RMN de 12 amb els de 6 va mostrar que eren similars excepte per a l'estructura de l'aglicona. En l'espectre de RMN de 12, es van observar dos carbonis parafínics a kC 38.0 (C-2) i 24,4 (C{-3) en lloc de dos carbonis olefínics a kC 12{{16 }},7 (C{-2) i 136,4 (C{-3) a l'aglicona de 6. Els grups metil germinals (kH 0,88) a l'aglicona de 12 es van desplaçar cap amunt. en relació amb H-4 i H-5 (kH 1,71 i 1,63) a l'aglicona de 6 (taula 2). Es va suggerir que l'aglicona de 12 era un grup 3-metilbutil, que es va confirmar pels espectres de RMN 1H i COSY. Els pics del grup 3-metilbutil es van observar a 3,81 (1H, m, H-1a), 3,48 (1H, m, H{-1b), 1,71 (1H, m). , H-3), 1,44 (2H, m, H{-2) i 0,88 (H{-4, 5).
Es van reafirmar dos fragments de sucre mitjançant l'anàlisi HPLC de l'hidrolitzat àcid i l'anàlisi d'espectres de RMN, així com el patró de fragments MS. Les configuracions absolutes dels sucres es van identificar com a D-glucosa i L-ramnosa mitjançant l'anàlisi HPLC de l'hidrolitzat àcid [17]. Es va confirmar un fragment A-glucosa i un fragment a-ramnosa mitjançant l'acoblament de constants dels protons anomèrics. L'espectre 1H-1H COZY mostrava correlacions seqüencials de H-13 a H-53, de H-133 a H{-333 i de H{{11} } a H-433 (figura 4).
La posició dels substituents es va confirmar mitjançant l'anàlisi HMBC. A l'espectre HMBC, les correlacions entre H-13 i C-1 (kC 67,2), entre H-33 (kH 3,68) i C-133 (kC 101,2) i entre Es van detectar H-43 (kH 4,70) i C-9333 (kC 165,7). En conseqüència, es va establir que l'estructura de 12 era 3-metilbutil-OaL-ramnopiranosil-(1→3)-4-O-(E)-cafeoil- -D-glucosa-piranòsid i anomenat cistansalside C.
Cistansalside D (17), una pols marró amorfa, es va determinar que tenia una fórmula molecular de C31H38O14 mitjançant el mode positiu d'alta resolució ESI-QTOF-MS, que va mostrar un pic d'ions adductes a m/z 657,2147 [M més Na] més (calculat per a C31H38O14Na, 657,2154). Fragmentar ions que inclou un [M més H x Aglicona x Rha x Acetil Glc] més ió a m/z 147, un [M més H x Aglicona x Rha] més ió a m/z 351 i un [M més H x Aglicona] També es van detectar ions més a m/z 497. Un ió característic a m/z 147 va suggerir que hi havia un substituent de cumaroil a la seva estructura. Els ions fragmentats a m/z 351 i m/z 497 van suggerir l'existència d'una unitat de ramnosa i una unitat de glucosa substituïda amb acetil.
Cistansalside deherba cistanche
L'espectre 13C-RMN va revelar la presència de 31 àtoms de carboni. Es van observar dos protons anomèrics a kH 4,61 (1H, m, H-13) i 4,60 (1H, s, H{{{1{0}}) als espectres 1H i HSQC . L'espectre 1H-RMN va indicar la presència d'un grup metil a 1,97 (3H, s, acetil-CH3), una trans-olefina a kH 7,55 (1H, d, J=15,9 Hz, H{{ 25}}) i 6,34 (1H, d, J=15,9 Hz, H-8333) i dos anells de benzè substituïts en para a kH 7,53 (2H, d, J=6. 9 Hz, H-3333, 5333) i 6,79 (2H, d, J=6,9 Hz, H{-2333, 6333)/kH 6,98 (2H, d, J {{5 0}},0 Hz, H{-2, 6) i 6,65 (2H, d, J=8,0 Hz, H{-3, 5) (taula 2) . A partir de l'espectre de RMN HMBC, les correlacions entre un carboni carbonílic a kc 165,5 (C{-9333) i H{-8333 i entre H{-2333, 6333 i C{-7333 (kc 145.4) va suggerir un grup (E)-cumaroil. La correlació HMBC entre un pic de protó metil i un carboni carbonil a kc 169,0 va confirmar la presència d'un grup acetil.
Es va suggerir un grup 4-hidroxifenil basat en les correlacions HMBC entre H-3, 5 i carbonis aromàtics quaternaris a kC 155,6 (C-4) i 128,6 (C{-1) . Un grup etil hidroxilat es va confirmar pels senyals de RMN COSY a kH 2,66 (2H, t, J=6,1 Hz, H{-7), 3,90 (1H, m, H-8a ) i 3,54 (1H, m, H-8b). Les correlacions HMBC entre H-7 i C{-1 (kC 128,6) i C-2, 6 (kC 129,7) van suggerir un grup {4-hidroxifeniletil, com a subestructura de glicona.
Dos fragments de sucre, suggerits a partir del patró del fragment MS, es van reconfirmar mitjançant l'anàlisi HPLC de l'hidrolitzat àcid i els espectres de RMN. La D-glucosa i la L-ramnosa es van dilucidar mitjançant l'anàlisi HPLC de l'hidrolitzat àcid [17]. Un fragment de glucosa i un fragment de a-ramnosa es van establir mitjançant l'acoblament de constants dels protons anomèrics. L'espectre 1H-1H COZY mostrava correlacions seqüencials des de H-13 a H-53 i de H-133 a H{-633 (figura 4).
A partir de l'espectre 1H-RMN, el desplaçament de camp cap avall de H-23 (kH 4,69) i H-43 (kH 4,8{0) va suggerir la posició substituïda per acil a la glucosa. Les connexions entre la glucosa i dos grups acil es van confirmar per les correlacions HMBC entre H-43 (kH 4,80) i C{-9333 i entre H{-23 i el carboni carbonílic d'un grup acetil (kC 169,0) ). Les posicions d'una aglicona i ramnosa estaven donades per les correlacions HMBC entre H-33 (kH 3,95) i C-1333 i entre H{-8 i C-13. En conseqüència, l'estructura de 17 es va assignar com a 4-hidroxifeniletil-2-O-acetil-O- -L-ramnopiranosil-(1→3)-4-O-(E)- cumaroil- -D-glucopiranòsid i anomenat cistansalside D.
Cistansalside E (18) es va aïllar com una pols marró amorfa. Es va determinar que la seva fórmula molecular era C31H38O14 mitjançant dades de 13C-RMN i el pic ESI-QTOF-MS d'alta resolució en mode positiu a m/z 657,2166 [M més Na] més (calculat per a C31H38O14Na, 657,2154). A més, també es van detectar ions de fragments que inclouen un ió cafeoil a m/z 163, un [M més H x Aglicona x Rha] més ió a m/z 367 i un ió [M més H x Aglicona] a m/z 513. Els ions del fragment van suggerir l'existència d'una unitat de ramnosa i una unitat de glucosa substituïda amb acetil.
L'espectre 1H-RMN va suggerir la presència de dos protons anomèrics a kH 4,63 (1H, d, J=8.2 Hz, H{-13) i 4,60 (1H, s, H-133 ) i dos protons de glucosa substituïts per acil a kH 4,71 (1H, dd, J=8.9, 8.2 Hz, H{-23) i 4.81 (1H, dd, J=9}.7 , 9,5 Hz, H-43). Els espectres 1H i HMBC van suggerir l'existència d'un grup acetil a kH 1,94 (3H, s, acetil-CH3), una part (E)-cafeoil a kH 7,48 (1H, d, J=15,9 Hz, H-7333), 7,02 (1H, d, J=1,6 Hz, H{-2333), 6,98 (1H, dd, J {= 8,1, 1,6 Hz, H-6333), 6,76 (1H,d, J=8,1 Hz, H{-5333) i 6,21 (1H, d, J {= 15,9 Hz, H{ {67}}) i un anell de benzè monosubstituït a kH 7,29 (2H, m, H-3, 5), 7,21 (2H, m, H{-2, 6) i 7,20 (1H, m, H-4) (Taula 2). Les correlacions HMBC entre H-7 (2H, kH 2,80, m) i C-1 (kC 138,8) van suggerir un grup fenilmetil, una subestructura d'aglicona, i entre H-7 i C -2, 6 (kC 128,9) i els senyals COSY RMN de H-7 amb H-8a (1H, kH 3,99, m) i H-8b (1H, kH 3,63, m).
Es van reafirmar dos fragments de sucre mitjançant l'anàlisi HPLC de l'hidrolitzat àcid i l'anàlisi d'espectres de RMN. Les configuracions absolutes dels sucres es van dilucidar mitjançant l'anàlisi HPLC de l'hidrolitzat àcid, que es va confirmar que eren D-glucosa i L-ramnosa [17]. A -glucosa i un fragment -ramnosa es van establir mitjançant l'acoblament de constants dels protons anomèrics. L'espectre 1H-1H COZY mostrava correlacions seqüencials de H-13 a H-53, de H-133 a H{-233 i de H{{11} } a H-333 (figura 4).
A partir de l'espectre HMBC, les correlacions entre H{{0}} i C{-8 (kC 69,4), entre H{-23 i el carboni carbonílic d'un grup acetil (kC 169,1), entre H-33 (kH 3,95) i C-133 (kC 102,0) i entre H{-43 (kH 4,81) i C-9333 (kC 165,6) van confirmar la posició dels substituents en l'estructura. Per tant, es va determinar que l'estructura de 18 era feniletil-2-O-acetil-OaL-ramnopiranosil-(1→3)-4-O-(E)-cafeoil- -D-glucopiranòsid i anomenat cistansalside E.
La majoria dels substituents trans-cinnamoil es van isomeritzar a la isoforma cis in vitro. S'ha informat que la llum converteix els derivats de l'àcid transcinàmic en cis-isoformes [18,19]. Es va observar que l'equilibri de la conversió trans-cis dels substituents de cinnamoil mantenia aproximadament el 70 per cent dels aïllats a la trans-isoforma. Per als protons olefins de la forma cis, els pics són aproximadament 6,90 ppm (d, J=12~13 Hz, H{-7333) i 5,80 ppm (d, J=12~13 Hz, H-8333) eren assignables als espectres de RMN-1H, mentre que els pics a aproximadament 7,55 ppm (d, J=15,8 Hz, H-7333) i 6,40 ppm (d, J { Es van observar {28}},8 Hz, H-8333) per a la transformada [20]. En l'espectre 1H-RMN de mescles trans-cis, es van observar pics de dos protons olefínics (H-7333 i H-8333) en una proporció de 7:3 (trans:cis). Els pics de 13C-RMN de la forma cis eren similars als de la transformada.
Ingredients efectius del cistanche: acteòsids
Tots els aïllats es van provar pels seus efectes inhibidors sobre la producció de NO induïda per LPS en RAW
Tots els aïllats es van provar pels seus efectes inhibidors sobre la producció de NO induïda per LPS a les cèl·lules RAW 264.7. La dexametasona es va utilitzar com a control positiu i la seva IC50 era de 7,0 uM. Dels compostos provats, els compostos 5 (IC50 42,7 o 6,6 uM), 11 (IC{50 37,3 o 2,2 uM), 13 (IC{50 40.{{2{{ 24}}}} o 4.0 uM) i 18(IC{50 27.9 o 0.8 uM) van mostrar activitats inhibidores moderades sobre la NO sintasa inducible, mentre que els altres compostos estaven inactius en aquest assaig (IC50). valors > 100 uM). Per verificar si aquests compostos tenien citotoxicitat, es va mesurar la viabilitat cel·lular mitjançant l'assaig MTT. Com a resultat, cap d'ells va mostrar una citotoxicitat significativa (figura suplementària S 6-1). Aquests quatre compostos es van seleccionar per avaluar la seva activitat inhibidora contra la via NF-λB en cèl·lules RAW 264.7 estimulades per LPS. L'estimulació de cèl·lules RAW 264,7 amb LPS va induir la fosforilació d'I入B i NF-入B (p65) després de 0,5 h d'incubació. La fosforilació de NF-入 B (p65) es va reduir significativament mitjançant el pretractament amb els compostos 11, 13 i 18, tal com es mostra per l'anàlisi de Western blot (figura 5). Per tant, els compostos 11, 13 i 18 poden exercir efectes antiinflamatoris mitjançant la inhibició de NF-入B als macròfags.
Figura 5.Efecte de quatre compostos sobre la fosforilació d'I入B i NF-入B (p65) en cèl·lules RAW 264,7 estimulades per LPS. (A) Les taques occidentals es van realitzar en LPS i cèl·lules RAW 264,7 tractades amb mostra; (B, C) Els senyals d'immunoblot es van quantificar mitjançant el programari de densitometria Molecular Analyst/PC (Bio-Rad, Richmond, CA, EUA). S'informa de l'anàlisi densitomètrica d'isoformes fosforilades. NF-入 B a la cèl·lula RAW 264.7 es va normalitzar al contingut de -actina.
3. Materials i Mètodes
3.1. Experiment general Procediment
Les rotacions òptiques es van mesurar amb un polarímetre digital Jasco P-2000 (Jasco, Tòquio, Japó). Els espectres UV es van registrar en un espectròmetre Chirascan més dicroisme circular (Chirascan, APL, Regne Unit). Els espectres IR es van registrar mitjançant l'espectrofotòmetre Jasco FT/IR-4200. Es va realitzar una espectrometria de masses en temps de vol de quadripols d'ionització per electrospray d'alta resolució (HR-ESI-qTOF-MS) en un Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS equipat amb la sèrie Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Inc. , Palo Alto, CA, EUA), i la columna utilitzada va ser una columna Jasco SFCpak Crest C18T-5 (id 150 4,6 mm, 5 um). Es va utilitzar el programari MassHunter per a l'adquisició de dades.
Els espectres de RMN 1D (1H i 13C) i 2D (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) es van obtenir amb un Jeol LA 300 (Jeol, Tòquio, Japó), Bruker AVANCE-400, Bruker Espectròmetres AVANCE-500, Bruker AVANCE-600 i Bruker AVANCE 800 HD acoblats amb una criosonda (Bruker, Ettlingen, Alemanya). Es va utilitzar DMSO-d6 (Cambridge Isotope Laboratories, a Cistanche Andover, MA, EUA) com a dissolvent de RMN i pics de referència (kH 2,50 i kC 39,5). La cromatografia en columna (CC) es va realitzar amb Sephadex LH-20 (25–100 um; Pharmacia, Uppsala, Suècia) o gel de sílice Kieselgel 60 (40–63 um, malla 230–400, art. 9385; Merck, Darmstadt). , Alemanya). La cromatografia en capa fina (TLC) es va realitzar sobre plaques de gel de sílice F254 Kieselgel 60 prerevestides (Art. 5715; Merck). Es van detectar taques en TLC mitjançant una làmpada UV a 254 nm i 365 nm (VL-4.LC, 365/254; Vilber Lourmat, Torcy, França). La cromatografia líquida a pressió mitjana (MPLC) es va realitzar en una columna de sílice RediSep de 120 g (Isco, Lincoln, NE, EUA) i gel de sílice Kiesegel 60 (40–63 um, 230–400 mesh, Art. 9385; Merck) mitjançant un Combiflash company (Isco). El sistema de cromatografia líquida d'alta pressió (HPLC) era una HPLC Gilson equipada amb una bomba Gilson 321 i un detector UV.VIS 151 (Gilson, Middleton, WI, EUA), utilitzant columnes ODS semipreparatives (Luna 5 um C18 (2) 100 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Phenomenex Inc., Torrance, CA, EUA; Hypersil GOLD™ aQ 175 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Thermo Scientific™, Hennigsdorf, Alemanya; Inno C18 columna 120 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Young Jin Biochrom Co., Ltd., Seongnam, Corea). El sistema analític RP-HPLC era un sistema d'aliança Waters 2695 amb detector a996 Photodiode Array (PDA) (Waters Corp, Milford, MA, EUA) i la columna utilitzada va ser una columna Hypersil™ BDS C18 (130 Å, id 150: 4,6). mm, 5 um, Thermo Scientific™). L'àcid fòrmic es va comprar a Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. (Seül, Corea). Els dissolvents de grau HPLC es van comprar a Fisher Scientific Korea Ltd. (Seül, Corea). H2SO4, Na2CO3 i dissolvents de primer grau per a l'extracció, el fraccionament i l'aïllament es van comprar a Daejung Chemical & Metals Co. Ltd. (Seül, Corea). El clorhidrat de l'èster metílic de L- i D-cisteïna i el o-tolilisotiocianat es van comprar a Tokyo Chemical Industry (Tòquio, Japó).
3.2. Planta Material
Totes les plantes deSalsa de Cistanche, que es van recollir del Shinjang Uigur, es van importar a través de la Daerim Pharmaceutical Wholesale Company (Cheongju, Corea). Els va identificar el Prof. Dr. Jehyun Lee (Universitat Dongguk, Seül, Corea). L'exemplar del val (SNUPH2016-03) es va dipositar a l'Herbarium of Medicinal Plant Garden, College of Pharmacy, Universitat Nacional de Seül.
3.3. Extracció i Aïllament
Les plantes senceres deSalsa de Cistanche(5,7 kg) es van tallar i es van extreure tres vegades amb MeOH (20 L) a temperatura ambient amb sonicació durant 99 min. Després d'eliminar el dissolvent al buit, l'extracte brut (1,35 kg) es va suspendre en H2O (5 L), després es va repartir amb EtOAc (5 L). El residu d'EtOAc (55, 3 g) es va separar en 16 fraccions (E01-16) per cromatografia en gel de sílice eluint amb CHCl3/MeOH (50: 1-0: 1, sistema de gradient de pas).
E08 (611,7 mg) es va sotmetre a cromatografia líquida a pressió mitjana en gel de sílice (25 g) i es va eluir amb CHCl3/MeOH (18:1–0:1, sistema de gradient de pas) i va donar 11 fraccions (E08a-k). A partir d'E08g, els compostos 13 (0,7 mg) i 18 (0,6 mg) es van purificar mitjançant una columna HPLC Luna 5 um i una elució isocràtica amb un 28% d'aigua aq. MeCN. La purificació HPLC (Hypersil GOLD, 25 per cent aq. MeCN) d'E08h (138,5 mg) va proporcionar els compostos 7 (10,6 mg), 8 (17,2 mg), 14 (13,4 mg) i 17 (4,9 mg).
E09 (1,15 g) es va purificar més en una columna de sílice-MPLC (2{0 g) eluint amb CHCl3/MeOH (10:1-0:1, pas- sistema de gradient) per donar 11 subfraccions (E09a-k). E09e (398,7 mg) es va sotmetre a Sephadex LH-20 (MeOH) i va donar vuit subfraccions (E09e1-8). Posteriorment, E09e6 es va purificar mitjançant una columna HPLC Hypersil GOLD (22 per cent aq. MeCN) per obtenir el compost 11 (0,4 mg). A partir d'E09e7, el compost 5 (0,6 mg) es va purificar per elució isocràtica a partir d'una columna HPLC Luna 5 um amb un 40 per cent d'aigua aq. MeOH.
E10 (1,20 g) es va separar en nou fraccions (E1{0ai) a la columna Sephadex LH{-20 eluint amb MeOH. A partir d'E10g (147,5 mg), els compostos 4 (13,4 mg), 9 (8,0 mg) i 15 (5,0 mg) es van aïllar mitjançant separació per HPLC (Inno, 23% aq. MeCN). La fracció E10h (470,0 mg) es va purificar en una columna Hypersil GOLD mitjançant elució isocràtica (40 per cent aq. MeOH) per produir els compostos 1 (3,8 mg), 10 (42,1 mg) i 16 (3,0 mg).
E11 (2, 96 g) es va sotmetre a Sephadex LH-20 eluint amb MeOH per donar nou fraccions (E11a-i). E11e es va separar mitjançant un cartutx Sep-Pak C18 eluint pas a pas amb un 10 per cent, 20 per cent, 30 per cent, 50 per cent i 100 per cent aq. MeOH per produir set fraccions (E11e1-7), seguides de Luna 5 um HPLC (28 per cent aq. MeCN) per donar els compostos 3 (3,4 mg), 6 (1,4 mg) i 12 (1,2 mg).
E12 (19,0 g) es va sotmetre a MPLC de sílice (120 g) mitjançant un sistema de gradient de CHCl3/MeOH per donar sis fraccions (18:1–0:1 , E12a-f). E12f es va cromatografiar en una columna Sephadex LH-20 (MeOH), donant set fraccions (E12f1-7). La purificació HPLC (Hypersil GOLD, 25% aq. MeCN) del compost 2 proporcionat per E12f7 (3,3 mg). Tots els dissolvents utilitzats per a HPLC eren un tampó d'àcid fòrmic del 0,05 per cent. El cabal comú per a la cromatografia HPLC i MPLC va ser de 3 i 40 ml/min, respectivament.
3.4.Caracterització
Cistansalside A (5): pols amorf marró; [ |20 x33,7 (c 0,1, MeOH); UV (MeOH) Amax nm (log e) 332 (3,18); IR (ordenat) vmax 3359, 1748, 1705, 1602, 1516 cmx1; Dades 1H-NMR (800 MHz) i 13C-NMR (200 MHz), vegeu la taula 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M més Na] més 645,2146 (calculat per a C30H38O14Na, 645,2154).
Cistansalside B (6): pols amorf marró; [ |20 x72,9 (c 0,1, MeOH); UV (MeOH) Amax nm (log e) 333 (3,32); IR (ordenat) vmax 3400, 1705, 1603, 1516 cmx1; Dades 1H-NMR (500 MHz) i 13C-NMR (125 MHz), vegeu la taula 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M més Na] més 579,2054 (calculat per a C26H36O13Na, 579,2048).
Cistansalside C (12): pols amorf marró; [ |20 x61,6 (c 0,1, MeOH); UV (MeOH) Amax nm (log e) 337 (3,25); IR (ordenat) vmax 3359, 1704, 1602, 1508 cmx1; Dades 1H-NMR (800 MHz) i 13C-NMR (200 MHz), vegeu la taula 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M més Na] més 581,2213 (calculat per a C26H38O13Na, 581,2205).
Cistansalside D (17): pols amorf marró; [ |20 x51,1 (c 0,1, MeOH); UV (MeOH) Amax nm (log e) 221 (3,53), 315 (3,52); IR (ordenat) vmax 3358, 1746, 1722, 1603, 1516, 1232, 1157, 1039 cmx1; Dades 1H-NMR (400 MHz) i 13C-NMR (75 MHz), vegeu la taula 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M més Na] més 657,2147 (calculat per a C31H38O14Na, 657,2154).
Cistansalside E (18): pols amorf marró; [ |20 x59,2 (c 0,1, MeOH); UV (MeOH) Amax nm (log e) 336 (3,22); IR (ordenat) vmax 3370, 1741, 1712, 1602, 1231, 1157 cmx1; Dades 1H-NMR (800 MHz) i 13C-NMR (200 MHz), vegeu la taula 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M més Na] més 657,2166 (calculat per a C31H38O14Na, 657,2154)
3.5.HPLC-QTOF-MS Anàlisi
L'anàlisi d'espectrometria de masses cromatogràfica es va realitzar en un sistema LC Agilent 1260 Infinity series (Agilent Technologies, Inc., EUA). La columna analítica era una columna SFCpak Crest C18T-5 (id 15{{10}}: 4,6 mm, 5 um, Jasco, Japó). La fase mòbil constava d'un 0,1 per cent (v/v) d'àcid fòrmic en MeCN (A) i aigua (B) utilitzant una elució en gradient de 0-35 min (23 per cent A), 35-45 min ( 23-28 per cent A), 45-75 min (28 per cent A) i 75-80 min (90 per cent A). El cabal es va mantenir a 0,3 ml/min. L'absorbància es va mesurar a 320 nm. Les condicions de la font ESI eren les següents: cabal de gas d'assecat (N2), 10 L/min; temperatura del gas d'assecat, 350 graus; nebulitzador, 30 psig; cabal de gas de la funda, 12,0 L/min; temperatura del gas de la funda, 350 graus; capil·lar, 4000 V; skimmer, 60 V; octapol RF, 750 V; tensió del fragmentador, 180 V; mode positiu. El sistema funcionava amb el programari de l'estació de treball Masshunter. El rang de massa es va establir en m/z 50-1000.
3.6.Àcid Hidròlisi
Els compostos es van hidrolitzar mitjançant H2SO4 1 N (100 uL) escalfat amb un bany d'aigua a 90 graus durant 2 h, després es van neutralitzar amb una solució aquosa saturada de Na2CO3. Després d'assecar les solucions sota un corrent de N2, els productes i els sucres estàndard (D-Glc, L-Glc, L-Rha) es van dissoldre en piridina (100 uL) que contenia clorhidrat d'èster metílic de L-cisteïna (0, 5 mg). Es va dissoldre una mostra de L-ramnosa en piridina (100 uL) que contenia clorhidrat d'èster metílic de D-cisteïna (0,5 mg). Després d'això, es van escalfar a 60 graus durant 1 h. Les solucions es van tractar amb 1 uL (1,11 mg) d'o-tolilisotiocianat, que es van escalfar de nou a 60 graus durant 1 h. Cada mescla final es va analitzar directament mitjançant RP-HPLC analític (columna Hypersil™ BDS C18, 17% aq. MeCN, 0,8 ml/min, 40 min, 35 graus). El tR del pic als 21, 9 i 40, 4 min va coincidir amb el del derivat de tiocarbamoil tiazolidina de D-glucosa i L-ramnosa, respectivament.
3.7. Cèl·lula Cultura
Els macròfags murins, RAW 264.7, es van obtenir de l'Institut de Recerca de Biociència i Biotecnologia de Corea (Daejeon, Corea) i es van cultivar en medi RPMI que contenia un 10 per cent de sèrum boví fetal i 100 U/mL de sulfat de penicil·lina/estreptomicina. Les cèl·lules es van incubar en una atmosfera humidificada al 5% de CO2 a 37 graus.
3.8.Fàrmacs i productes químics
RPMI, penicil·lina i estreptomicina es van comprar a HyClone (Logan, UT, EUA). L'albúmina sèrica bovina i el LPS es van comprar a Sigma (St. Louis, MO, EUA).
3.9.Mesura de la producció de NO
La concentració de nitrits al medi de cultiu es va mesurar com a indicador de la producció de NO segons la reacció de Griess. Les cèl·lules es van sembrar a 2: 105 cèl·lules/pou en 96-plaques de cultiu de pous. Després de la preincubació de les cèl·lules RAW 264,7 durant 18 h, les cèl·lules es van tractar prèviament amb compostos (50 uM, 10 uM, 5 uM o 1 uM) i es van estimular amb LPS (500 ng/mL) durant 24 h. Compostos d'assaig dissolts en DMSO. Les cèl·lules també es van tractar amb un 0,05 per cent de DMSO com a control del vehicle. Les cèl·lules RAW 264,7 (2: 105 cèl·lules/pou) es van cultivar en plaques de 96-pous mitjançant RPMI sense vermell de fenol i es van pretractar amb mostres durant 0,5 h. La producció cel·lular de NO es va induir mitjançant l'addició de 500 ng/mL de concentració final de LPS i una incubació de 24 h. Després de la incubació, es van barrejar 100 uL de medi condicionat amb el mateix volum de reactiu de Griess i es van incubar durant 15 min. L'absorbància de la mescla a 540 nm es va mesurar amb un lector de microplaques ELISA (Benchmark, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, EUA). Els valors obtinguts es van comparar amb els de les concentracions estàndard de nitrit de sodi dissolt en RPMI i es van calcular les concentracions de nitrit en els medis condicionats de cèl·lules tractades amb mostra.
3.10.3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-Assaig de bromur de difeniltetrazoli (MTT) per a la viabilitat cel·lular
Les cèl·lules es van sembrar en plaques de {{{0}}pous a una densitat de 5: 104 cèl·lules/pou i es van incubar amb medis sense sèrum en presència de mostres. Compostos d'assaig dissolts en DMSO. Les cèl·lules també es van tractar amb un 0,05 per cent de DMSO com a control del vehicle. Després de la incubació durant 24 h, es van afegir 10 uL de MTT (5 mg/mL en solució salina) i es va continuar la incubació durant 4 h més. La succinat deshidrogenasa mitocondrial a les cèl·lules vives converteix MTT en cristalls de formazà visibles durant la incubació. A continuació, els cristalls de formazan es van solubilitzar en sulfòxid de dimetil i es va mesurar l'absorbància a 540 nm mitjançant un lector de microplaques d'assaig immunoabsorbent lligat a enzims (ELISA) (Benchmark, Bio-Rad Laboratories). Es va calcular la viabilitat cel·lular relativa en comparació amb l'absorbància del grup control no tractat. Tots els experiments es van realitzar per triplicat.
3.11.Anàlisi immunoblot
L'expressió de proteïnes es va avaluar mitjançant western blotting segons procediments estàndard. Breument, les cèl·lules RAW264.7 es van cultivar en plats de cultiu de 6{{2{0}} mm (2: 1{06/mL), seguit d'un pretractament de 5{{0 uM de compostos . Les cèl·lules es van rentar dues vegades en PBS fred amb gel (pH 7, 4), es van tornar a suspendre els pellets cel·lulars en tampó de lisi sobre gel durant 15 min i després es van eliminar les restes cel·lulars mitjançant centrifugació. La concentració de proteïnes es va determinar mitjançant el reactiu d'assaig de proteïnes Bio-Rad segons les instruccions del fabricant. La proteïna (20-30 ug) es va barrejar 1:1 amb 2: tampó de mostra (20 per cent de glicerol, 4 per cent de SDS, 10 per cent 2- ME, 0, 05 per cent de blau de bromofenol i 1, 25 M Tris [pH 6, 8]), carregat en gels SDS-PAGE d'un 8 o 15 per cent i funcionant a 150 V durant 90 min. Les proteïnes cel·lulars es van transferir a membranes de difluorur de polivinilidè Immunoblot (Bio-Rad) mitjançant un sistema de transferència semi-sec Bio-Rad segons les instruccions del fabricant. A continuació, les membranes es van incubar durant la nit amb els respectius anticossos primaris p-NF-入B, NF-入B, pI入B i -actina (Abcam, Cambridge, Regne Unit) en solució salina tamponada amb Tris que contenia un 5% de llet desnatada i un 0,1% de Tween. 20. L'endemà, les taques es van rentar tres vegades amb solució salina tamponada amb Tris (0,1 per cent de Tween 20) i es van incubar durant 1 h amb un anticòs secundari anti-IgG conjugat amb HRP (diluït 1:2000-1). : 20.000). Les taques es van rentar de nou tres vegades amb solució salina tamponada amb Tris (0, 1 per cent de Tween 20) i es van desenvolupar bandes immunoreactives mitjançant el substrat quimioluminiscent ECL Plus (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EUA).
3.12.Anàlisi estadística
Les dades experimentals es presenten com a mitjana o SEM. El nivell de significació estadística es va determinar mitjançant l'anàlisi de la variància (ANOVA) seguida de la prova t de Dunnett per a comparacions múltiples.p Els valors inferiors a 0,05 es van considerar significatius.
Extracte de salsa de cistanche
4. Conclusions
En aquest estudi, vam aïllar i dilucidar les estructures de cinc nous glucòsids substituïts amb fenilpropanoides, anomenats cistansalside AE (5, 6, 12, 17 i 18), a més d'aïllar i identificar 13 compostos coneguts, mitjançant una estratègia de dereplicació. Es va determinar que els compostos coneguts eren lipedósid AI (1) [21], 23-acetilacteòsid (2) [22], isocistanòsid C (3) [15], osmantuside B (4) [21], epimeridinòsid A ( 7) [15], cistàsid D (8) [23], salsaside B (9) [6], tubulòsid E (10) [16], cistàsid M (11) [15], isomartinòsid (13) [24], salsaside C (14) [6], jionòsid C (15) [25] i salsaside F (16) [6]. Les seves estructures es van establir mitjançant l'anàlisi de dades espectroscòpiques extenses i per comparació amb les dades informades a la literatura. Es va confirmar que les estructures previstes provisionalment de glicòsids substituïts amb fenilpropanoides estaven adaptades correctament a les seves estructures reals.
Benefici de l'extracte de salsa Cistanche
Referències
1. Shimamura, H.; Miyazawa, M.; Enomoto, K.; Nakamura, S.-I.; Kameoka, H. Supressió de l'activitat induïdora de SOS de Trp-P-1 per àcids grassos de la salsa de Cistanche a la prova de Salmonella Typhimurium TA1535/pSK1002 umu. Nat. Prod. Lett. 1997, 10, 261–265. [Ref creuat]
2. Jeon, E.; Chung, K.-S.; An, H.-J. Efectes antiproliferació de la salsa Cistanches sobre la progressió de la hiperplàsia benigna de pròstata. Llauna. J. Physiol. Pharmacol. 2016, 94, 104–111. [CrossRef] [PubMed]
3.Xu, C.; Jia, X.; Xu, R.; Wang, Y.; Zhou, Q.; Sun, S. Discriminació ràpida d'Herba Cistanches mitjançant macro-empremta digital infraroja de diversos passos combinada amb un modelat suau independent de l'analogia de classe (SIMCA). Spectrochim. Acta Part A Mol. Biomol. SpectrosCistanche2013, 114, 421–431. [CrossRef] [PubMed]
4. Jiang, Y.; Li, SP; Wang, YT; Chen, XJ; Tu, PF Diferenciació d'Herba Cistanches per empremta digital amb cromatografia líquida d'alt rendiment-detecció de matrius de díodes-espectrometria de masses. J. Cromatogr. 2009, 1216, 2156–2162. [CrossRef] [PubMed]
5. Kobayashi, H.; Karasawa, H.; Miyase, T.; Fukushima, S. Estudis sobre els constituents de Cistanchis Herba. V. Aïllament i estructures de dos nous glicòsids fenilpropanoides, cistanòsids E i F. Chem. Farmàcia. Bou. 1985, 33, 1452–1457. [Ref creuat]
6.Lei, L.; Jiang, Y.; Liu, X.-M.; Tu, P.-F.; Wu, L.-J.; Chen, F.-K. Nous glucòsids de salsa Cistanche. Helv. Chim. Acta 2007, 90, 79–85. [Ref creuat]
7. Kartbaeva, EB; Sakipova, ZB; Ibragimova, LN; Kapsalyamova, EN; Ternynko, II Estudi de la composició de compostos fenòlics de salsa Cistanche (CA Mey) G. Beck, que creixen a la República de Kazakhstan. J. Chem. Farmàcia. Res. 2015, 7, 120–122.
8. Liu, J.-Y.; Guo, Z.-G.; Zeng, Z.-L. Millora de l'acumulació de glucòsids feniletanoides mitjançant l'alimentació de precursors al cultiu en suspensió de salsa Cistanche. Bioquímica. Eng. J. 2007, 33, 88–93. [Ref creuat]
9. Maruyama, S.; Akasaka, T.; Yamada, K.; L'extracte de salsa de Tachibana, H. Cistanche actua de manera similar a l'enllaç de proteïnes
polisacàrid-K (PSK) en diversos tipus de línies cel·lulars. J. Tradit. Med. 2008, 25, 166–169.
10. Tian, X.-F.; Pu, X.-P. Els glucòsids feniletanoides de la salsa Cistanches inhibeixen l'apoptosi induïda per l'ió 1-metil-4-fenilpiridini a les neurones. J. Etnofarmacol. 2005, 97, 59–63. [CrossRef] [PubMed]
11.Michel, T.; Halabalaki, M.; Skaltsounis, AL Nous conceptes, enfocaments experimentals i estratègies de dereplicació per al descobriment de nous fitoestrògens a partir de fonts naturals. Planta Med. 2013, 79, 514–532. [CrossRef] [PubMed]
12.De Medeiros, LS; Abreu, LM; Nielsen, A.; Ingmar, H.; Larsen, TO; Nielsen, KF; Rodrigues-Filho, E. Aïllament guiat per dereplicació de depsides theaflavines ST i lecanora DF del fong endofític Setophoma sp. Fitoquímica 2015, 111, 154–162. [CrossRef] [PubMed]
13.Rakotondraibe, LH; Rasolomampianina, R.; Park, H.-Y.; Li, J.; Slebodnik, C.; Brodie, PJ; Blasiak, LC; Turó, R.; TenDyke, K.; Shen, Y.; et al. Compostos antiproliferatius i antiplasmodials d'espècies de Streptomyces seleccionades. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2015, 25, 5646–5649. [CrossRef] [PubMed]
14.Jiang, Y.; Liu, F.-J.; Wang, Y.-M.; Li, H.-J. Aïllament guiat per desreplicació de noves saponines triterpenoides hepatoprotectores de Celosiae Semen mitjançant cromatografia líquida d'alt rendiment combinada amb espectrometria de masses en tàndem d'ionització amb electrospray quadripol-temps de vol. J. Pharm. Biomed. Anal. 2017, 132, 148–155. [CrossRef] [PubMed]
15.Zhang, J.; Li, C.; Che, Y.; Wu, J.; Wang, Z.; Cai, W.; Li, Y.; Ma, Z.; Tu, P. Estratègia basada en LTQ-Orbitrap per a la medicina tradicional xinesa orientada al descobriment de classes, la identificació i la seva investigació òmica: un estudi de cas sobre glicòsids feniletanoides en tres espècies diferents d'Herba Cistanches. RSC Adv. 2015, 5, 80816–80828. [Ref creuat]
16. Yoshizawa, F.; Deyama, T.; Takizawa, N.; Usmanghani, K.; Ahmad, M. Els constituents de Cistanche tubulosa (Schrenk) Hook. f. II. Aïllament i estructures d'un nou glicòsid feniletanoide i un nou glicòsid de neoligna. Chem. Farmàcia. Bou. 1990, 38, 1927–1930. [Ref creuat]
17. Tanaka, T.; Nakashima, T.; Ueda, T.; Tomii, K.; Kouno, I. Discriminació fàcil d'enantiòmers d'aldosa per HPLCistancheChem de fase inversa. Farmàcia. Bou. 2007, 55, 899–901. [CrossRef] [PubMed]
18. Wong, WS; Guo, D.; Wang, XL; Yin, ZQ; Xia, B.; Li, N. Estudi de l'àcid cis-cinàmic a Arabidopsis thaliana. Physiol vegetal. Bioquímica. 2005, 43, 929–937. [CrossRef] [PubMed]
19.Kahnt, G. Trans-Cis-equilibri d'àcids hidroxicinàmics durant la irradiació de solucions aquoses a pH diferent. Phytochemistry 1967, 6, 755–758. [Ref creuat]
