Part IV Estudi sobre el model de supressió de medul·la òssia induïda per 5-Fu/5-Fu+L-OHP en ratolins

Actualment, els mètodes utilitzats habitualment per construir models animals de supressió de medul·la òssia inclouen el modelatge de radiació [1,2], el modelatge d'injecció intraperitoneal de ciclofosfamida [3-5], 5-fluorouracil (5-Fluorouracil, { {5}}FU) modelització d'injecció intraperitoneal [6,7], radiació combinada ambfàrmac de quimioteràpiamodelatge compost [8,9], modelatge per sonda de carbamazepina amb fàrmacs antiepilèptics [10], etc. Diferents mètodes de modelització provoquen diferents mecanismes de supressió de la medul·la òssia, i els efectes sobre les diverses cèl·lules sanguínies i el seu grau són diferents; diferents fàrmacs de quimioteràpia, a causa dels seus diferents mecanismes d'acció, també mostren certes diferències en els seus efectes sobre l'hematopoesi de la medul·la òssia. Per tant, un model animal ideal de supressió de medul·la òssia és de gran importància per estudiar els efectes dels fàrmacs de quimioteràpia sobre l'hematopoesi de la medul·la òssia.

En la pràctica clínica,quimioteràpia adjuvant per al càncer colorectaladopta principalment el règim 5-FU i el règim 5-Fu combinat amb oxaliplatina (oxaliplatina, L-OHP). S'han fet estudis rellevants sobre l'ús de 5-Fu sol per construir un model animal de supressió de la medul·la òssia. Tanmateix, l'abast de l'ús de 5-Fu és relativament ampli. Els informes bibliogràfics inclouen 110 mg/kg, injecció intraperitoneal (ip) a d1 i d5 per al modelatge [7, 150 mg/kg, ip, d1 per al modelatge 16, 11], 200 mg/kg, ip, d1 per al modelatge [{{ 15}}], i 250 mg/kg, ip, d1 per al modelatge [16]. Tanmateix, no hi ha hagut informes sobre l'ús de 5-Fu combinat amb L-OHP per construir un model animal de supressió de medul·la òssia. Yu Linghong et al. [17] va utilitzar 5-Fu combinat amb L-OHP per establir un model animal de lesió hepàtica. En referència al mètode d'administració i la dosi de la literatura, l'equip va realitzar una exploració preliminar de la dosi de 5-Fu combinat amb L-OHP per establir un model animal d'os.supressió medul·lar, i va comparar el mètode de modelització de 5-Fu 200 mg/kg, ip, d1 i el mètode de modelització de 5-Fu 187,5 mg/kg + L-OHP 9 mg/kg, ip, d1. Els resultats van mostrar que la dosi d'aquests dos models era massa gran. Per tant, l'objectiu d'aquest estudi és continuar explorant la dosi òptima del model animal de supressió de medul·la òssia induïda per 5-Fu i la dosi de 5-Fu combinada amb el modelatge de L-OHP, per tal de proporcionar el model animal més ideal per alsegüent pas per estudiar l'eficàciaimecanisme de prescripció de Qitu Erzhi.

CISTANCHE D'HERBES PER A LA SALUT DEL RONÓN

Servei de Suport de Wecistanche

Correu electrònic:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Materials i mètodes

1 Materials experimentals

1.1 Animals d'experimentació

Es van comprar 100 ratolins mascles BALB/c sense patògens específics (SPF), amb un pes de 20 g ± 2 g, a SBEF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. i es van allotjar en gàbies al Centre d'Animals Experimentals de l'Hospital Xiyuan, Acadèmia Xina de Medicina Xinesa. Ciències (certificat de qualificació: SYXK (Beijing) núm. 2015-0011). Tots els ratolins van ser alimentats de manera adaptativa durant 1 setmana i van tenir accés gratuït a l'aigua i els aliments durant el període d'alimentació. Condicions d'alimentació: temperatura interior 20-26 graus, humitat relativa 40% ~ 60%, temps clar/fosc 12 hores/12 hores. Aquest experiment compleix estrictament amb les regulacions rellevants del Comitè d'Ètica de Gestió d'Animals Experimentals de l'Hospital Xiyuan, Acadèmia de Ciències Mèdiques Xineses de la Xina i compleix els estàndards d'ètica animal.

1.2 Principals fàrmacs i reactius experimentals

5-Fu (injecció de fluorouracil) Oxaliplatina per a injecció

0Tampó fosfat, 0,01 M (tampó PBS) Diluent per a l'anàlisi de cèl·lules sanguínies (MEK-640)

Solució de neteja per a l'anàlisi de cèl·lules sanguínies (MEK-680) Agent hemolític per a l'anàlisi de cèl·lules sanguínies (MEK-680) Solució de neteja per a l'anàlisi de cèl·lules sanguínies

Taca d'hematoxilina de Harris 0, 5% taca d'eosina

Mitjà de segellat de goma neutre

Solució de descalcificació de mostres de teixit tipus àcid mineral

1.3 Principals instruments i equipaments

Comptador automàtic de cèl·lules sanguínies (MEK6318) Tub de recollida de sang capil·lar (20 μL)

Punta de pipeta de 1000 μL

Deshidratador de teixits biològics Tissue-TEK VIP6 Màquina d'incrustació de teixits biològics Tissue-TEK TEC Talladora de teixits Leica RM2235

Recollidor de rodanxes Leica HI1210 Màquina per coure a rodanxes Leica HI1220

Tintura automàtica Leica ST5020 Coberta cobertora automàtica Leica CV5030 Microscopi Olympus Bx53

Path QC control de qualitat de la patologia i sistema de gestió de dades

Altres: pipeta, bàscula electrònica ordinària, tisores quirúrgiques, pinces, alcohol al 75%, gasa mèdica, cotó estèril, xeringues, etc.

1.4 Preparació de fàrmacs de quimioteràpia

(1) Règim de fu d'una sola droga 5-

Dissoleu {{0}}Fu ({0,25 g/10 ml) en 40 ml de solució de NaCl al 0,9% per preparar una solució amb una concentració de 5 mg/ml per al seu ús en espera.

(2) 5-Fu combinat amb règim L-OHP

Dissoleu {{0}}Fu (0,25 g/1{0 ml) en 40 ml de solució de NaCl al 0,9% per preparar una solució amb una concentració de 5 mg/ml per a l'espera. utilitzar. Dissoleu 1 tub de L-OHP (50 mg) en 5 ml de solució de glucosa al 5% i continueu diluint amb una solució de glucosa al 5% a una solució de 0,5 mg/ml per al seu ús.

Taula 4-1 Modelització del règim de medicació

Segons el règim de dosificació anterior, tots els ratolins es van pesar i dosificar individualment segons el pes corporal. En el grup de fàrmacs duals, l'interval de temps entre l'administració de 5-Fu i L-OHP va ser de més de 5 hores [17].

(2) Indicadors d'avaluació del model de supressió de medul·la òssia

Els indicadors d'avaluació del model de supressió de medul·la òssia inclouen la disminució del recompte de cèl·lules de la sang perifèrica [18-22] o el recompte de cèl·lules de la sang perifèrica combinat amb les cèl·lules nucleades de la medul·la òssia [9.23-25]. Aquest estudi va utilitzar el segon mètode per avaluar l'efecte del modelatge.

2.2 Indicadors i materials d'observació

2.2.1 Estat general dels ratolins

Durant l'experiment, es va observar diàriament la dieta, la defecació, l'activitat, l'estat, l'estat mental i l'estat del cabell de cada grup de ratolins. Si els ratolins morien, es registraven a temps.

2.2.2 Canvis en el pes dels ratolins de cada grup

Peseu i registreu el pes de cada ratolí abans de la dosificació el dia del modelatge (d0), i peseu i registreu el pes de cada ratolí cada dos dies després del modelatge.

2.2.3 Canvis en el recompte de cèl·lules de la sang perifèrica

Fixeu el ratolí amb un fixador de ratolí, exposa la cua i remulla-la amb aigua calenta de 45-50 graus. Després d'assecar la cua, talleu 1-2 mm de la punta de la cua. Acaricia ràpidament i suaument la cua des de la base fins a la punta 2-3 vegades. Utilitzeu un tub de recollida de sang capil·lar per recollir 20 μL de sang, diluir-la en el diluent de cèl·lules sanguínies preparat i realitzar anàlisis de cèl·lules sanguínies a la màquina. Recollir sang a una hora fixa cada dia; tota la recollida de sang la realitza una sola persona. Els indicadors de detecció inclouen: glòbuls blancs, glòbuls vermells, hemoglobina i plaquetes.

2.2.4 Canvis en el recompte de cèl·lules nucleades de medul·la òssia

Un dia abans del mostreig, utilitzeu una micropipeta per prendre 1000 μL de solució de PBS i diluir-lo en un tub EP de 2 ml i emmagatzemar-lo en una nevera de 4 graus per al seu ús posterior. El d6, es van seleccionar aleatòriament 8 ratolins de cada grup i es van matar per luxació cervical. Sota un banc net estèril, es van utilitzar unes tisores quirúrgiques per tallar la pell prop del fèmur, treure el fèmur dret i embolicar-lo amb una gasa mèdica per eliminar el teixit tou residual. Utilitzeu una agulla de xeringa d'1 ml (agulla núm. 4) per extreure la solució de PBS al tub EP, perforar un extrem del fèmur per abocar la medul·la òssia al tub EP; rentar i aspirar diverses vegades per eliminar les cèl·lules de la medul·la òssia fins que el fèmur es torni blanc. La suspensió de cèl·lules de medul·la òssia preparada es va passar a través d'una xarxa de niló de 200-malla. Utilitzeu un comptador automàtic de cèl·lules sanguínies per detectar cèl·lules nucleades de medul·la òssia. El d13, els ratolins restants es van matar de la mateixa manera i es van recollir exemplars.

2.2.5 Tinció HE de patologia de la medul·la òssia

El d6, després que els ratolins de cada grup fossin assassinats per luxació cervical, es van utilitzar tisores quirúrgiques per tallar la pell a prop del fèmur sota un banc net estèril, treure el fèmur esquerre, fer blocs de cera, rodanxes i tinció d'HE.

(1) Etapes de preparació i seccionament del bloc de cera

① Mostra: Fixeu el teixit amb un 4% de paraformaldehid durant més de 24 hores, submergiu-lo en una solució de descalcificació durant 24-48 hores, punxeu el teixit amb una agulla, talleu-lo i retalleu-lo després que s'estovi i col·loqueu-lo al bloc de cera. caixa;

② Deshidratació: el teixit es col·loca seqüencialment en un 70% d'alcohol (2 hores), 80% d'alcohol (1,5 hores), 95% d'alcohol I (1,5 hores), 95% d'alcohol II (1,5 hores). hores), alcohol 100% I (0,5 hores) i alcohol 100% II (0,5 hores), i deshidratat de manera gradient.

③ Transparència: el teixit es col·loca seqüencialment en etanol anhidre i solució de xilè (proporció de volum 1:1), xilene I i xilene II durant 40 minuts cadascun.

④ Immersió en cera: el teixit es col·loca seqüencialment en una barreja de xileno i parafina (1:1), parafina I i parafina II durant 20 minuts cadascun. L'immersió de cera es realitza en un dispositiu de temperatura constant a 58 graus per mantenir la parafina fosa.

⑤ Incrustació: després d'etiquetar el bloc de teixit, preescalfeu les pinces, injecteu la parafina fosa al motlle i, a continuació, poseu el bloc de teixit i espereu que la parafina es solidifiqui.

⑥ Tallar: després d'incrustar-lo, col·loqueu el bloc de cera de teixit a la talladora, ajusteu l'angle de la talladora i talleu el bloc de teixit a rodanxes amb un gruix de 4-5 μm.

⑦ Enganxament: esteneu les rodanxes de parafina en aigua a 42 graus, agafeu les rodanxes una a una amb un portaobjectes i enganxeu-les al portaobjectes.

⑧ Cocció: col·loqueu la diapositiva enganxada en una caixa de temperatura constant a uns 70 graus i coure durant 1,5 h.

(2) Etapes de tinció HE:

① Desparafinareu en remull en xilè I i II durant 15 minuts cadascun.

② Remullar en alcohol 100% I i II durant 5 min.

③ Remullar amb alcohol de gradient al 95%, 85% i 75% durant 3 minuts i esbandida amb aigua destil·lada.

④ Tinció d'hematoxilina durant 1-3 min i esbandida amb aigua destil·lada.

⑤ Diferenciació d'alcohol àcid clorhídric durant 2-3 s, rentar amb aigua destil·lada.

⑥ Submergeix-lo en aigua d'amoníac perquè es torni blau durant 1 min, renteu-lo amb aigua destil·lada.

⑦ Tinció d'eosina durant 5 min.

⑧ Submergeix-lo en alcohol de gradient al 75%, 85% i 95% durant 2 min.

⑨ Submergeix-lo en alcohol 100% I, IⅡ durant 3 minuts cadascun.

⑩ Submergeix-lo en xilè I, Ⅱ durant 5 minuts cadascun.

⑪ Segellar amb goma neutra.

2.3 Mètodes estadístics

SPSS26.0 es va utilitzar per realitzar anàlisis estadístiques de les dades. Les dades de mesura es van expressar com a mitjana ± desviació estàndard (x±s). En primer lloc, es van provar les dades per a la normalitat i l'homogeneïtat de la variància: per a les dades distribuïdes normalment, es va utilitzar ANOVA unidireccional per a la comparació entre diversos grups: quan la variància era igual, es va utilitzar la prova LSD per a la comparació per parelles; si la variància no era igual, es va utilitzar la prova t2 de Tamhane per a la comparació per parelles; si no s'ajustava a la distribució normal, s'utilitzava una prova no paramètrica. P<0.05 was considered statistically significant.