PART Ⅱ: Precondicionament i postcondicionament de metformina per reduir la lesió de reperfusió de l'esquemia en un model de perfusió de màquina normotèrmica de ronyó i rata ex vivo asolada porcina
Mar 26, 2022
Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Tobias M.Huink, Leonie H.Venemal, Rene A.Posma, Nynke J.de Vries, Andrie C.Westerkampl i et al.
INTRODUCCIÓ
El trasplantament de ronyó és el tractament d'elecció per als pacients amb malaltia renal en fase terminal. Malauradament, la demanda és superior a la disponibilitat d'òrgans.2 Aquesta escassetat ha donat lloc a un augment de l'ús d'òrgans de qualitat subòptima procedents de la donació després de donants de mort circulatòria (DCD).5 Els ronyons de donants de DCD són més susceptibles a lesions per isquèmia-reperfusió (IRl), que està relacionat amb una incidència significativament més gran de retard en la funció de l'empelt, que afecta tant el resultat a curt com a llarg termini.45 L'IRI és causada per la deterioració del flux sanguini i la posterior reoxigenació, que resulta en la generació d'espècies reactives d'oxigen (ROS). iniciant una cascada de respostes cel·lulars perjudicials.67 La gravetat de la isquèmia es correlaciona fortament amb la insuficiència precoç de l'empelt renal després del trasplantament de ronyó i contribueix a augmentar la morbiditat. Per tant, la isquèmia calenta (W) durant la recuperació i la implantació d'òrgans i el temps isquèmic fred durant la conservació, respectivament, s'han de reduir al mínim. Les estratègies de perfusió de la màquina poden tenir un paper fonamental en la disminució de l'IRI mitjançant el subministrament d'oxigen durant les fases isquèmiques en la donació d'òrgans. A més, proporciona una plataforma per afegir possibles agents protectors abans de la reperfusió (precondicionament) o durant la reperfusió (postcondicionament) i és un mètode adequat per avaluar la funció renal i les lesions a curt termini.9-11
La biguanidametforminaés el fàrmac antihiperglucèmiant oral més utilitzat per tractar pacients amb diabetis tipus 2. El mecanisme d'acció i els efectes pleiotròpics demetforminaresulten principalment de la inhibició del complex 1 dins de la cadena respiratòria mitocondrial.12-14 Per tant,metforminapot atenuar l'IRI més enllà de les seves accions hipoglucemiants i s'ha proposat com a agent protector d'òrgans durant les circumstàncies en què es produeix l'IRI, com ara el trasplantament.15,16.
L'objectiu d'aquest estudi era avaluar els possibles efectes beneficiosos del precondicionament i el postcondicionament ambmetforminasobre IRI en dos models diferents de perfusió de màquina normotèrmica (NMP) ex vivo aïllats mitjançant ronyons de rata i porc.
NUTRIR EL RONDON:HERBA DEL DRAC CISTANCHE
MÈTODES
Estudi de rates
Animals.Es van utilitzar rates Lewis mascles de 270-300 g de pes (Harlan Laboratories, Boxmeer, Països Baixos). El Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals de la Universitat de Groningen va aprovar el protocol d'estudi (DEC6708C). Els animals van rebre atenció segons la Llei holandesa sobre experiments amb animals, seguint els principis de cura dels animals de laboratori de l'Institut Nacional de Salut.
Disseny experimental, recuperació d'òrgans i conservació.Es van dividir un total de 31 rates en 6 grups (n=5-6 per grup; Figura 1). En tots els grups, es van utilitzar 15 minuts de W i 24 hores de conservació en fred per induir lesions isquèmiques. El precondicionament es va realitzar mitjançant l'administració de 300 mg/kgmetformina(1,1-clorhidrat de dimetilbiguanida; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) dissolt en solució salina (0,9 per cent de NaCl) o solució salina sola mitjançant sonda oral 12 i 2 hores abans de la nefrectomia. Solució salina, 30 mg/Lmetforminao 300 mg/Lmetforminaes va afegir al perfusat com a agent de postcondicionament. Es va triar la concentració de 300 mg/kg de pes corporal, ja que aquesta dosi va donar lloc a sèrummetforminaconcentracions que corresponen a les que es troben en humans durant el mantenimentmetforminateràpia.17
L'obtenció de ronyons es va realitzar amb canvis menors en el procediment de DCD, tal com es va descriure anteriorment.18 En resum, les rates van ser anestesiades amb un 2-5 per cent d'isoflurà i es va realitzar la laparotomia mitjançant una incisió de línia mitjana. L'anticoagulació, utilitzant 500 UI d'heparina (Leo Pharma, Ballerup, Dinamarca), es va administrar a través de la vena dorsal del penis. Després de 15 minuts de WI, es va realitzar una nefrectomia del ronyó esquerre. Es van canular l'artèria renal i l'urètre. El ronyó es va rentar in situ amb 10 ml de solució salina (37 graus) i 5 ml de solució d'emmagatzematge en fred de la Universitat de Wisconsin (UW) de 4 graus (Bridge to Life, Columbia, SC). Un cop eliminats, els ronyons es van rentar una vegada més amb 5 ml UW i es van emmagatzemar a UW durant 24 hores a 4 graus.
Màquina de perfusió normotèrmica.El mètode NMP de rata s'ha descrit àmpliament abans.18 En resum, el NMP es va realitzar durant 90 minuts amb una bomba de corró (Ismatec ISM404, Zuric, Suïssa). La pressió de perfusió es va establir en 102 mmHg, controlada a l'artèria renal. Al grup control, el líquid de perfusió constava de 100 ml de William's Medium E complementat amb 30 mmol/L d'HEPES, 50 g/L d'albúmina i 7 mmol/L de creatinina (tots Sigma-Aldrich). En els grups experimentals, 30 o 300 mg/Lmetforminaes va afegir al perfusat. El fluid de perfusió es va oxigenar amb un 95 per cent d'oxigen i un 5 per cent de diòxid de carboni amb un flux de 0,5 L/min. La temperatura del fluid de perfusió es va mantenir a 37 graus mitjançant un bany maria i un intercanviador de calor (Julabo, Seelbach, Alemanya). El flux es va registrar cada 10 minuts, utilitzant un sensor de flux calibrat (ME1PXN Inline, Transonic Systems, Ithaca, NY). Després de la NMP, les biòpsies dels ronyons es van submergir immediatament en un 4% de formaldehid o es van congelar en nitrogen líquid i es van emmagatzemar posteriorment a -80 graus.
figura 1Representació esquemàtica dels grups experimentals. Els grups contenen entre 5 i 7 ronyons. HMP, màquina de perfusió hipotèrmica; NMP, perfusió de màquina normotèrmica; WIT, temps càlid d'isquèmia.
Estudi porcí
Animals.Els ronyons de les femelles de porcs Landrace holandesos es van recollir d'un escorxador. Els animals van ser atordits i exsanguinats segons els procediments estàndard locals. Durant l'exsanguinació, es va recollir aproximadament 1 L de sang en un recipient que contenia 25,000 UI d'heparina no fraccionada (Leo Pharma). Com que s'utilitzava material de rebuig de l'escorxador, no calia l'aprovació del comitè d'ètica animal.
Disseny experimental, recuperació d'òrgans i conservació.Per induir una lesió isquèmica, es van utilitzar 30 minuts de WI. Després d'aquest període, el ronyó es va rentar amb 180 ml de solució salina a 4 graus. Immediatament després del rentat, es va fer una biòpsia cortical (Invivo, Best, Països Baixos) i es va emmagatzemar en formaldehid tamponat al 4%. Per acomodar el transport de l'escorxador al laboratori i com a tècnica de conservació, l'artèria renal es va canular i els ronyons es van connectar a una configuració de perfusió de màquina hipotèrmica controlada per pressió pulsàtil (HMP) (Kidney Assist Transport; Organ Assist, Groningen, Països Baixos). ). Els ronyons es van perfusionar a 4 graus amb 500 ml de solució de perfusió a màquina UW durant 3 hores (Bridge to Life, Londres, Regne Unit) amb o sense l'addició de 2 mg.metformina, amb una pressió arterial mitjana de 25 mmHg. Es va subministrar oxigen (100 per cent) a l'oxigenador (Hilite LT1000; Medos Medizintechnik AG, Stolberg, Alemanya) amb un cabal fix de 0,1 L/min.
Màquina de perfusió normotèrmica.Els ronyons es van reperfondre mitjançant una configuració NMP ex vivo durant 4 hores que es va descriure anteriorment. En el nostre estudi, augmentar les dosis demetforminao solució salina es van afegir mitjançant una bomba d'infusió. En resum, després de l'HMP, l'artèria renal es va canular i es va rentar. L'urètre es va canular per a la recollida d'orina. Després, es va pesar el ronyó i es va prendre una biòpsia i es va emmagatzemar en formaldehid tamponat al 4% per a una anàlisi posterior. Posteriorment, els ronyons es van col·locar en un circuit NMP controlat per pressió ex vivo. La NMP es va realitzar amb 500 ml de sang esgotada de leucòcits (BioR 02 plus; Fresenius Kabi, Bad Homburg, Alemanya) autòloga, oxigenada (carbogen, flux de 0,5 l/min) durant 4 hores a una pressió arterial mitjana de 80 mmHg. Altres compostos afegits al líquid de perfusió es proporcionen a la taula S1. En el grup experimental,metforminadissolt en la solució de lactat de Ringer (20 mg/ml; Baxter, Utrecht, Països Baixos) es va infondre mitjançant una bomba d'infusió controlada per un programari personalitzat en el qual es podien definir els perfils d'infusió (Alaris; CareFusion, Rolle, Suïssa). Cada 30 minuts durant NMP , la velocitat d'infusió es va augmentar segons un programa preespecificat (taula S2). Aquest programa es basava en dades de farmacocinètica humana que indicaven quemetforminal'aclaració de creatinina és quatre vegades més gran que l'aclaració de creatinina.19 En el grup control, els ronyons es van perfondre sense afegirmetformina. Per a cada experiment, el flux es va registrar mitjançant la sonda de flux clampon (ME7PXL; Transonic Systems), que es va connectar al tub proper a l'artèria renal. Aquesta sonda de flux s'ha calibrat per al tub utilitzat. Cada 15 minuts durant la NMP, es va recollir l'orina i es va substituir per un volum corresponent de solució de lactat de Ringer, que també es va registrar. La temperatura del fluid de perfusió es va mantenir a 37 graus mitjançant un intercanviador de calor integrat, connectat a un bany maria (Julabo). Es van prendre mostres de sang i orina al cap de 15 i 60 minuts i cada hora següent per a les anàlisis bioquímiques. Quan es va acabar la NMP, es van prendre biòpsies i es van emmagatzemar en formaldehid tamponat al 4%, o es van congelar instantàniament i es van emmagatzemar a -80 grau per a una anàlisi posterior.
MILLORAR LA FUNCIÓ RENOLÓ SUPLEMENT DE CISTANCHE
Tots dos estudis
Anàlisis bioquímiques.Les mostres de perfusat i d'orina es van centrifugar (1.300 g durant 10 minuts en el model de rata i 1,000 g durant 12 minuts en el model porcí, respectivament, tots dos a 4 graus) i el sobrenedant es va emmagatzemar a {{7} } grau. La lactat deshidrogenasa (LDH), l'aspartat aminotransferasa (ASAT) i la creatinina es van determinar en el perfusat i la creatinina a l'orina, respectivament, pel Centre de Laboratori del Centre Mèdic Universitari de Groningen mitjançant anàlisis bioquímiques estàndard. La quantitat de proteïna excretada a l'orina de rata es va mesurar mitjançant un assaig de proteïnes Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), mentre que la concentració total de proteïnes a l'orina porcina es va mesurar mitjançant anàlisis bioquímiques estàndard al Laboratory Center.
Reacció en cadena de la polimerasa quantitativa en temps real.La reacció en cadena de la polimerasa (PCR) en temps real es va dur a terme segons els procediments estàndard del sistema Tagman Applied Biosystems 7900HT RealTime PCR, tal com es va descriure anteriorment. codificant per ET-1); òxid nítric sintasa endotelial (eNOS); i factor 2 semblant a Krüppel (KLF-2), activació endotelial (factor Von Willebrand (wWF); molècula d'adhesió de cèl·lules vasculars 1 (VCAM) -1) i IL-6), i la proteïna de xoc tèrmic 70 (HSP-70) es va fer amb els conjunts d'imprimadors enumerats a la taula S3. En resum, l'ARN total es va extreure de les seccions de ronyó mitjançant TRlzol (Life Technologies, Gaithersburg, MD). L'ADNc obtingut de rates es va utilitzar com a referència interna durant la PCR per provar l'eficiència del cebador. L'expressió gènica es va normalitzar amb la mitjana del contingut d'ARNm de -actina. Els resultats es van expressar com a 2- △ACT, on el valor CT representa la diferència entre els valors del llindar del cicle.
Figura 2Paràmetres de perfusió i funció renal avaluats durant i després de la perfusió en màquina normotèrmica de ronyons de rata i porc. Eliminació total de creatinina dels ronyons de rata (a) i porc (b). Producció total d'orina (c, d) i proteïna total excretada a l'orina (e, f) dels ronyons de rata i porc, respectivament. Les dades es presenten com a mitjana ± error estàndard de la mitjana. Els grups contenen entre 5 i 7 ronyons. *P < 0.05="" i="" **p=""><>
Puntuació morfològica.Les biòpsies emmagatzemades en un 4% de formaldehid es van incrustar en parafina i es van tallar en rodanxes de 4 μm. Posteriorment es van tenyir les cups amb àcid periòdic Schiff i es van puntuar en la necrosi de cèl·lules tubulars proximals (que va de lleu a greu: 1-5), edema (que va de lleu a greu: 1-4) i vacuolització de cèl·lules tubulars proximals ( que van de lleu a greu: 1-4).21 L'avaluació histopatològica es va fer cegues per dos investigadors. Un patòleg clínic independent amb una àmplia experiència en l'avaluació de signes histopatològics de lesió després de la perfusió mecànica d'òrgans de rata i porc va validar les puntuacions.
Càlculs.La resistència vascular intrarenal (IVR) es va calcular dividint la pressió arterial mitjana pel flux (expressat en mmHg/ml min). La depuració de creatinina es va calcular per estimar la taxa de filtració glomerular mitjançant l'equació següent: [creatinina a l'orina]* flux d'orina/[creatinina al perfusat].
Anàlisi estadística.Totes les dades s'expressen com a mitjana ± error estàndard de la mitjana. Quan es van comparar dos grups en un sol moment, es van avaluar les diferències mitjançant una prova t de Student no aparellada. Les diferències per a la producció total d'orina, les puntuacions morfològiques i l'expressió gènica es van provar mitjançant l'anàlisi de la variància. Totes les proves estadístiques són de dues cues i P inferior o igual a 0,05 es va considerar estadísticament significatiu. Per a totes les anàlisis es va utilitzar la versió 23 de SPSS Statistics (IBM, Armonk, NY). L'àrea sota la corba (AUC) es va calcular segons la regla del trapezi i es va utilitzar per aproximar la depuració total de creatinina, la quantitat total de proteïna excretada a l'orina i els nivells totals d'ASAT i LDH al perfusat.
Nota: l'herba medicinal tradicional xinesa cistanche (també coneguda com "herba del drac" i "ginseng del desert"), creix només als deserts àrids i càlids. Com a una de les nou herbes immortals, el Cistanche (cistanche tubulosa/cistanche deserticola/desertliving cistanche/cistanche salsa) conté ingredients rics i efectius com ara echinacòsid, acteòsid, glicòsids feniletanoides totals, flavonoides, polisacàrids, etc., aquests ingredients efectius van fer del cistanche un preuat. herba nutritiva i material alimentari per a la immunitat de les persones, òrgans interns i cèl·lules cerebrals i neurones, etc. Els estudis farmacològics moderns han confirmat els efectes següents del cistanche (beneficis del cistanche): millorar la immunitat; millorar la funció sexual i la funció renal; antifatiga; anti edat; millorar la memòria; anti-malaltia de Parkinson; la malaltia d'Alzheimer; antioxidant; alleujar el restrenyiment; antiinflamatori; promoure el creixement dels ossos, blanquejar la pell; protegir el fetge; etc.