Primera part|Un inhibidor de NF-κB i un agonista de l'AMPK: predicció de xarxa i integració multiòmica per obtenir vies de senyalització per a l'acteòsid contra la malaltia d'Alzheimer

Primera part|Acteòsids: com tractar la malaltia d'Alzheimer com un dels ingredients efectius de Cistanche?

Ying-Qi Li1†, Yi Chen1†, Si-Qi Jiang1, Yuan-Yuan Shi2, Xiao-Li Jiang1, Shan-Shan Wu1, Ping Zhou1, Hui-Ying Wang1, Ping Li1* i Fei Li1,2 * 1 State Key Laboratori de Medicina Natural, Universitat Farmacèutica de la Xina, Nanjing, Xina, 2 Col·legi de Farmàcia, Universitat Mèdica de Xinjiang, Urumqi, Xina

La malaltia d'Alzheimer (MA) és el tipus de demència més freqüent.Acteòsid (ACTUAR) és un compost aïllat deCistanche tubulosa, que posseeix excel·lents propietats neuroprotectores. No obstant això, el mecanisme subjacent deACTUARen la regulació de la polarització de la microglia segueix mal definida. Per tant, es va establir un model de xarxa computacional per identificar els objectius de conduccióACTUARi predir el seu mecanisme mitjançant la integració de múltiples bases de dades disponibles. El model d'AD induït per AlCl3-en les larves de peix zebra es va constituir amb èxit per demostrar l'eficàcia terapèutica de l'ACT. Posteriorment, les cèl·lules BV-2 induïdes per LPS van descobrir el paper positiu de l'ACT en la polarització M1/M2. Les vies NF-κB i AMPK es van confirmar encara més mitjançant l'anàlisi transcriptòmica, l'anàlisi metabolòmica, les tècniques de biologia molecular i l'acoblament molecular. La investigació va proporcionar un mecanisme infusiu de l'ACT i va revelar la connexió entre el metabolisme i la polarització de la microglia des de la perspectiva de la funció mitocondrial. Més important encara, va proporcionar un enfocament sistemàtic i complet per al descobriment d'objectius de fàrmacs, inclosos els canvis en gens, metabòlits i proteïnes.

Paraules clau: acteòsid, cèl·lules BV-2, metabolisme, ARN-seq, mitocondris, neuroinflamació

Per obtenir més informació, poseu-vos en contacte amb: ali.ma@wecistanche.com

Feu clic a Cistanche DHT per a la memòria

INTRODUCCIÓ

Amb l'envelliment i el ràpid creixement de la població, el nombre de casos de demència al món ha mostrat una tendència a l'alça.Malaltia d'Alzheimer(AD) és una malaltia neurodegenerativa freqüent acompanyada de deteriorament cognitiu i discinesia (Perea et al., 2020), que és el tipus de demència més freqüent. Es caracteritza per una pèrdua neuronal severa, plaques senils i embolcalls neurofibril·lars (Shiao et al., 2017). La patogènesi deMalaltia d'Alzheimerés multidimensional i està relacionat amb la neuroinflamació. La neuroinflamació està impulsada per l'activació de les cèl·lules glials, que està estretament relacionada amb l'aparició i el desenvolupament de l'AD (Hanslik i Ulland, 2020; Linnerbauer i Rothhammer, 2020). Durant la progressió i l'exacerbació de la neuroinflamació, la microglia es considera un factor clau. La microglia són les cèl·lules immunitàries primàries del sistema nerviós central, que estan estretament associades amb una cascada de processos com el desenvolupament del cervell, el manteniment de l'entorn neuronal, així com les respostes a lesions i reparacions (Perea et al., 2020). A més, la microglia es pot estimular a un fenotip M1 i augmentar l'expressió de citocines proinflamatòries quan es produeixen malalties relacionades amb la neuroinflamació com la MA (Tsukahara et al., 2020). Els estudis també demostren que la polarització al fenotip M1 sovint s'acompanya de trastorns metabòlics (Li L. et al., 2020), que condueixen a un desequilibri del metabolisme energètic i a una disfunció mitocondrial (Agrawal i Jha, 2020). Aquests canvis adversos es deriven de la neurodegeneració, fins i tot de la malaltia d'Alzheimer.

Acteòsid (ACT), a glucòsid feniletanoide, es deriva principalment deCistanche tubulosa. L'evidència creixent ha suggerit que l'ACT posseeix nombroses activitats farmacològiques, inclosesneuroprotector(Wei et al., 2019),antiinflamatori(Lai et al., 2019) iantioxidant(Ji et al., 2019) efectes. En particular, s'ha demostrat que l'acteòsid potmillorar l'aprenentatge i la memòriadeteriorament i regular el metabolisme energètic a les rates induïdes per estreptozotocina (Chen J. et al., 2020). A més, també pot inhibir la mort de cèl·lules apoptòtiques neuronals i el dany mitocondrial en els ratolins experimentals d'encefalomielitis autoimmune (Li W. et al., 2020). No obstant això, l'efecte de l'ACT sobre la polarització de la microglia M1/M2 i el seu mecanisme rarament s'informa. Fins ara, els mecanismes com la reparació de la funció dels mitocondris i la regulació del metabolisme cel·lular no estan clars i es necessiten més investigacions científiques per aclarir el mecanisme exacte.

L'objectiu del present informe és investigar l'eficàcia terapèutica de l'ACT, així com el mecanisme molecular subjacent de l'ACT sobre l'AD. A continuació, s'estableix un mètode sistemàtic in silico d'identificació de diana de fàrmacs basat en les bases de dades consolidades. Investiguem encara més els possibles mecanismes de l'ACT a nivell biològic molecular integrant la seqüenciació d'ARN (ARN-seq) amb mètodes metabolòmics i tècniques de biologia molecular. La combinació d'estratègies de cribratge sistemàtic in silico, in vivo i in vitro proporciona un nou protocol per descobrir objectivament compostos multi-objectiu de la medicina tradicional xinesa.

MATERIALS I MÈTODES

Modelatge de xarxes

Es van combinar quatre plataformes en línia per predir i descobrir els objectiusActeòsid, és a dir, GeneCards1, enfocament de conjunt de semblança (SEA2), SwissTargetPrediction3 i PharmMapper4. Totes les associacions de gens d'AD es van recollir de manera independent de DisGeNET5 i GeneCards. Després de l'anàlisi de la interacció objectiu-objectiu realitzada per String database6, la xarxa es va integrar encara més mitjançant el programari Cytoscape (versió 3.8.2). Es va realitzar una anàlisi d'enriquiment GO i KEGG a la base de dades DAVID7 per anotar i explotar la xarxa.

Animals i agrupació de models

En aquest estudi es van escollir peixos zebra de tipus salvatge (soca AB, de 4 mesos) (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). Es van mantenir sota un cicle de llum/foscor de 14/10-h a 28◦C, seguint el mètode anterior (Li YQ et al., 2020). Tots els experiments amb peix zebra es van dur a terme sota la supervisió del Comitè d'Ètica Animal de la Universitat Farmacèutica de la Xina. Les larves de peix zebra es van dividir en sis grups i es van tractar des de 3 dies després de la fecundació (dpf) fins a 7 dpf: grup control, grup model, grup model més clorhidrat de donepezil (DPZ, Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.) i model plusActeòsidGrups (puresa HPLC superior o igual al 98 per cent, Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd.). El grup control es va mantenir al medi amb 0,2 per cent de DMSO i el grup model es va tractar amb 150 µM AlCl3 (pH 5,8). El grup model més DPZ es va cotractar amb AlCl3 i 8 µM DPZ. El model plusActeòsidels grups van ser cotractats amb AlCl3 i diferents concentracions d'ACT (200, 100 i 50 µM).

Anàlisi de la conducta

Els moviments de larves de peix zebra es van registrar mitjançant un analitzador de comportament ViewPoint (Zebralab, 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) a 28 ◦ C. Breument, els paràmetres de comportament i el processament dels resultats eren coherents amb el mètode que vam establir anteriorment (Li YQ et al., 2020). Aquí, es van seleccionar la velocitat mitjana (AS), el canvi de velocitat (1S), la taxa de recuperació de la discinèsia (DRR) i l'eficiència de la resposta (RE, percentatge) per avaluar la recuperació de la discinèsia en el peix zebra.

Determinació de l'activitat de l'acetilcolinesterasa i la colina acetiltransferasa

Després de tractar de 3 a 7 dpf, es van recollir larves de peix zebra per mesurar les activitats de l'acetilcolinesterasa (AChE) i la colina acetiltransferasa (ChAT). D'acord amb el protocol del fabricant, l'activitat es va detectar mitjançant els kits d'assaig immunoabsorbent lligat a enzims (ELISA) (MLBIO Biotechnology Co., Ltd., Xangai, Xina)

Cultius i tractaments cel·lulars

La línia cel·lular BV-2 es va comprar a la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, Estats Units). Es van cultivar a DMEM (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, Xina). El medi es va complementar amb un 10% de FBS (Gibco, Grand Island, NY, Estats Units), 100 U/ml de penicil·lina i 100 mg/ml d'estreptomicina, acompanyat d'un 95% d'aire/5% de CO2 a 37 ◦ C. Les cèl·lules BV-2 es van incubar amb ACT (50, 25 i 12, 5 µM) o es van estimular amb lipopolisacàrid (LPS, 1 µg/ml; Sigma Aldrich, St Louis, MO, Estats Units) durant 24 h. Les cèl·lules es van observar al microscopi invertit (Nikon ECLIPSE Ti2, Japó).

Assaig de viabilitat cel·lular

Es va utilitzar l'assaig del kit de recompte de cèl·lules-8 (CCK-8) (JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, Xina) per avaluar la viabilitat cel·lular. Breument, l'absorbància es va mesurar a 450 nm amb un lector de microplaques (Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, Estats Units).

Assaig de producció d'òxid nítric

L'òxid nítric (NO) es va determinar mesurant els nivells de nitrits al sobrenedant de cultiu de BV-2 mitjançant el reactiu de Griess. Breument, el medi (100 µl) es va transferir a una nova placa de pous 96-, es va afegir el mateix volum de reactiu de Griess a cada pou i es va reaccionar durant 15 min a la foscor. L'absorció a 540 nm es va determinar mitjançant un lector de microplaques.

Nivells de citocines inflamatòries en el sobrenedant

Les concentracions de TNF-, IL-1 i IL-10 en el sobrenedant de cèl·lules BV-2 es van determinar mitjançant kits ELISA segons les instruccions del fabricant.

Determinació del Metabolisme Cel·lular mitjançant anàlisi HPLC-Q-TOF-MS

Les cèl·lules BV{{0}} es van sembrar en un plat de sis pous per separat (n=6/grup). Després del tractament, es va eliminar el medi i es van rentar les cèl·lules tres vegades amb PBS fred. Després es van exposar immediatament al nitrogen líquid per suprimir el metabolisme cel·lular. Les cèl·lules es van recollir amb un 8{{30}} per cent de metanol fred. Per facilitar la precipitació de proteïnes, les cèl·lules es van vortexar vigorosament durant 1 min i es van centrifugar a 13, 000 rpm (15 min, 4◦C). La suspensió cel·lular es va assecar sota un corrent de nitrogen. El residu assecat es va reconstituir en 150 µl d'acetonitril al 25% prerefredat. Per tal de garantir l'estabilitat i la precisió de l'anàlisi de la seqüència, cada mostra de cèl·lules amb el mateix volum (10 µl) es va combinar com a mostres de control de qualitat. Durant la detecció de metabòlits, aquestes mostres es van injectar cada sis mostres per confirmar la seva estabilitat. Es va injectar una alíquota de 1-µl per a HPLC-Q-TOF-MS. L'anàlisi es va realitzar en un sistema HPLC Agilent 1290 connectat amb l'espectròmetre de masses Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Estats Units). La separació es va dur a terme en una columna ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 min × 100 mm, 1,7 µm). La fase mòbil estava formada per un 0,1 per cent d'àcid fòrmic-aigua (v/v; A) i acetonitril (B). La velocitat d'acompanyament es va establir a 0,4 ml/min amb la següent condició d'elució de gradient òptima: 0 a 2 min, 5 per cent de B; 2 a 20 min, 5 a 95 per cent B (mode d'ions positius); 0 a 2 min, 5 per cent B; 2 a 20 min, 5 a 95 per cent B (mode d'ions negatius). Els paràmetres de funcionament de l'espectròmetre de masses es van establir de la següent manera: temperatura del gas, 320◦C; gas d'assecat, 10 L/min; nebulitzador, 35 psi; VCap, 4,000 V; fragment, 120 V. Les dades en brut es van utilitzar amb MassHunter Workstation Software versió B.07.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Estats Units). Les dades en brut van ser preprocessades per la plataforma XCMS. L'anàlisi de components principals (PCA) i l'anàlisi discriminant de mínims quadrats parcials (PLS-DA) de les dades normalitzades es van realitzar amb MetaboAnalyst8. En combinació amb la literatura, es van identificar els metabòlits diferencials (VIP> 1, t-test p <0, 05)="" a="" hmdb9.="" finalment,="" es="" va="" realitzar="" l'anàlisi="" de="" la="" ruta="" amb="">

Mesura del potencial de la membrana mitocondrial

El potencial de membrana mitocondrial (MMP) es va detectar mitjançant la sonda fluorescent FL JC-1 (Beyotime, Xina) d'acord amb les instruccions del fabricant. Breument, les cèl·lules de diferents grups es van esbandir amb PBS i es van incubar amb una solució de tinció JC-1 durant 20 min a 37 ◦ C. Després de la tinció, les cèl·lules es van rentar dues vegades amb tampó de tinció. Aleshores, es van detectar senyals fluorescents FL mitjançant citometria d'altres companys (BD Accuri C6).

Mesura de l'adenosina mitocondrial 50 -trifosfat

La concentració de 50 -trifosfat d'adenosina (ATP) als mitocondris es va detectar mitjançant un kit d'assaig d'ATP (Beyotime, Xina). Breument, es va descartar el medi de cultiu de cèl·lules BV-2 de diferents grups i es van homogeneïtzar les cèl·lules amb tampó de lisi sobre gel. El sobrenedant obtingut després de la centrifugació (12,000 g, 5 min) es va utilitzar per determinar la concentració d'ATP. La luminescència va ser detectada pel lector de microplaques multimode EnVision (PerkinElmer).

Mesura del nivell d'espècies d'oxigen reactiu intracel·lular

Es va utilitzar el kit d'assaig d'espècies reactives d'oxigen (ROS) (Beyotime, Xina) per mesurar els nivells de ROS. Les cèl·lules de diferents grups es van incubar amb DCFH-DA (10 µM) durant 20 min a 37 ◦ C. Després de la càrrega de la sonda, les cèl·lules es van rentar tres vegades amb DMEM. Aleshores, es van detectar senyals fluorescents FL mitjançant citometria d'altres companys (BD Accuri C6).

Microscòpia electrònica de transmissió

Les cèl·lules BV-2 es van sembrar en un plat de sis pous. Es va eliminar el medi i es va afegir ràpidament 1 ml de glutaraldehid al 2,5 per cent a cada pou. A continuació, es van reunir les cèl·lules i es van fixar amb un nou glutaraldehid al 2,5 per cent a 4 ◦ C durant la nit. Després de la fixació, deshidratació i incrustació, les cèl·lules es van observar amb un microscopi electrònic de transmissió HT7800 (Hitachi, Tòquio, Japó).

RNA-Seq i anàlisi de dades bioinformàtiques

L'ARN total de les cèl·lules BV-2 es va extreure mitjançant el reactiu Trizol (Vazyme Biotech, Xina). Totes les mostres analítiques es van enviar a Majorbio (Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd.) per a l'assaig de la seqüència d'ARN. Les dades es van analitzar a la plataforma en línia de Majorbio Cloud Platform10. RSEM11 es va utilitzar per quantificar l'abundància de gens. Bàsicament, expressió diferencial

l'anàlisi es va realitzar mitjançant el DESeq2/DEGseq/EdgeR amb un valor Q inferior o igual a 0.05; DEG amb|log2FC| > 1 i valor Q Menor o igual a 0.05 (DESeq2 o EdgeR)/Valor Q Menor o igual a 0,001 (DEGseq) es va considerar que eren gens expressats significativament diferents. A més, es van realitzar anàlisis d'enriquiment funcional incloent GO i KEGG per identificar quins DEG es van enriquir significativament en termes i vies de GO al valor p corregit per Bonferroni Menor o igual a 0, 05 en comparació amb el fons del transcriptoma sencer. Les dades de la seqüència original s'han enviat a la base de dades de l'Arxiu de lectura de seqüències de l'NCBI.

Reacció en cadena de la polimerasa en temps real quantitativa

L'ARN total de les cèl·lules BV-2 es va recollir mitjançant el reactiu d'aïllament RNA-easyTM (Vazyme Biotech, Xina) i la reacció de transcripció inversa es va dur a terme amb FastKing-RT SuperMix (TIANGEN Biotech, Xina). Les reaccions es van realitzar segons el protocol del fabricant. L'ADNc es va sotmetre a assaigs quantitatius de reacció en cadena de la polimerasa en temps real (qRT-PCR) amb cebadors específics i TransStart TOP Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, Xina). Els primers es mostren a la taula complementària 1 i es va utilitzar -actina com a control intern. Per a l'anàlisi quantitativa es va utilitzar el mètode 22 1 1 CT.

Anàlisi Western Blot

Les cèl·lules BV-2 es van lisar mitjançant un tampó de lisi RIPA (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, Xina) que contenia un còctel d'inhibidor de proteasa a l'1 per cent (Thermo Fisher) per obtenir proteïnes totals. Les proteïnes es van separar en un 10% de SDS-PAGE i es van transferir a membranes NC. Després de bloquejar-se amb un 5% de llet desnatada/BSA, les membranes es van incubar amb AMPK (Proteintech), p-AMPK (Affiffinity Biosciences), PGC-1 (Proteintech), NF-κB (Proteintech), p-NF-κB (ABclonal) o anticossos GAPDH (ABclonal) en un 5% de TBST a 4 ◦ C durant la nit. Les membranes es van incubar amb un anticòs secundari conjugat amb peroxidasa de rave picant (ABclonal) a temperatura ambient durant 1 h. Per a la visualització i la quantificació es van utilitzar el substrat ECL Western blotting d'alta signatura (Tanon, Xina), el sistema d'imatge en gel (Tanon, Xina) i el programari ImageJ.

Acoblament molecular

L'anàlisi d'acoblament molecular es va realitzar mitjançant el programari Autodock (versió 4.2). L'afinitat entre ACT i proteïnes es va observar pel programari AutodockTools. Les estructures de proteïnes tridimensionals (3D) d'AMPK (PDB ID: 5g5j) i NF-κB (PDB ID: 4q3j) es van recuperar del Protein Data Bank12.

Anàlisi estadística

Totes les dades s'expressen com a mitjana ± desviació estàndard i s'analitzen pel programari GraphPad Prism (versió 8.0.1). Les diferències entre els grups es van analitzar mitjançant l'anàlisi de variància unidireccional (ANOVA), seguida de la prova de comparació múltiple de Tukey. p < 0,05="" es="" va="" considerar="" estadísticament="">

RESULTATS

ACT-AD Targets Interaction Network and Pathway Prediction

Mitjançant la consolidació de múltiples bases de dades, es van adquirir 253 objectius d'ACT, mentre que es van reunir un total de 1.697 objectius relacionats amb l'AD. Després del mapeig de la xarxa objectiu, es van absorbir un total de 70 objectius a la xarxa d'interacció objectiu ACT-AD (figura 1A). L'anàlisi d'enriquiment KEGG va implicar que ACT podria tenir un efecte d'objectiu múltiple i d'espectre ampli (figura 1B). També va suggerir que l'ACT té múltiples vies, punts objectiu i elements en el tractament de la MA. Classifica aquestes vies per obtenir una interpretació precisa dels mecanismes. L'ACT podria correlacionar-se principalment amb la transducció del senyal, el sistema endocrí, el sistema immunitari i el creixement i la mort cel·lulars per tenir un paper de confrontació contra l'AD (figura 1C). Val la pena assenyalar que la gran majoria d'aquestes vies estan relacionades amb reaccions inflamatòries. S'especula que l'acció antiinflamatòria de l'ACT podria ser una part inextricable del seu paper de confrontació contra l'AD.

ACT va alleujar la discinesia i va millorar la funció del sistema colinèrgic a les larves de peix zebra AD

Per verificar el model de xarxa, es va utilitzar el model AD induït per AlCl3-en larves de peix zebra per demostrar l'efecte de l'ACT. Es va observar el moviment de larves de peix zebra dins dels cicles de llum/foscor i es van registrar les seves pistes de natació (figura 1D). Els resultats van mostrar que l'ACT va augmentar eficaçment l'AS i 1S del peix zebra, i l'efecte sinèrgic va augmentar amb l'augment de les dosis (figura 1E). DRR i RE van descobrir una comparació més intuïtiva d'ACT i DPZ (figura 1F). En conseqüència, ACT va alleujar la discinesia, mostrant efectes similars als de DPZ. En general, s'acorda que el sistema colinèrgic té un paper important en els processos d'aprenentatge i memòria. Així, les activitats d'AChE i ChAT es van utilitzar per revelar l'efecte de l'ACT. L'exposició a AlCl3 al peix zebra es va produir amb una alteració colinèrgica cerebral (figura 1G). Va ser significatiu que el tractament amb ACT va suprimir l'activitat de l'AChE. A més, l'activitat de ChAT va mostrar una disminució després del tractament ACT. Per tant, ACT va mostrar un impacte profund en les larves de peix zebra AD induïdes per AlCl3-.

ACT va suprimir la polarització M1 i va promoure la polarització M2 en cèl·lules BV-2 induïdes per LPS

Per confirmar encara més la xarxa, es va estudiar l'efecte antiinflamatori de l'ACT in vitro mitjançant cèl·lules microglials BV-2. Després del tractament amb LPS durant 24 h, la viabilitat de les cèl·lules BV-2 va disminuir significativament. Afortunadament, ACT va augmentar la viabilitat cel·lular de les cèl·lules BV-2 induïdes per LPS (figura 2A). A més, es va observar la morfologia de les cèl·lules BV-2. Després de 24 h d'estimulació amb LPS, va demostrar que les cèl·lules BV-2 van patir un estat de polarització M1. Els canvis morfològics es van prevenir mitjançant el cotractament ACT (figura 2B).

A més, els resultats van indicar que, a diferència de les cèl·lules BV-2 estimulades per LPS, les cèl·lules BV-2 cotractades amb ACT van suprimir significativament les expressions de TNF-, IL{-1 i NO (figura 2C) en el sobrenedant cel·lular. Es tracta de citocines proinflamatòries clàssiques com a indicadors de la polarització de la microglia M1. De manera similar als resultats de l'ELISA, els resultats de la qPCR van descobrir que les expressions d'ARNm de TNF-, òxid nítric sintasa (iNOS), IL-1 i CD{86 es van inhibir significativament pel tractament ACT en comparació amb el grup LPS (Figura 2D). A més, vam mesurar el nivell de polarització de la microglia M2 mitjançant ELISA (figura 2C) i qPCR (figura 2E), i els resultats van indicar que l'ACT va augmentar significativament els nivells d'expressió dels marcadors relacionats amb la microglia M2 (IL-10, CD206, TGF- i Arg-1). En una paraula, aquests resultats ho van demostrarACTUARva suprimir la polarització de la microglia M1 i va promoure el fenotip M2.

Polarització M1/M2 regulada per ACT mitjançant la inhibició de la via NF-κB

L'anàlisi transcriptòmica es va realitzar mitjançant RNA-seq per explorar el mecanisme de l'ACT a les cèl·lules BV-2 des d'un nivell global. PCA va il·lustrar que els grups de control, LPS i ACT es podrien distingir bé (figura 3A). Va revelar 899 gens expressats de manera diferencial (DEG) entre el grup control i el grup LPS, i 49 DEG entre el grup LPS i el grup ACT (figura 3B). De manera consistent, l'anàlisi d'enriquiment GO (figura 3C) i KEGG (figura 3D) van descobrir que l'efecte de l'ACT estava implicat en la via NF-κB. El conjunt de gens associats a la via NF-κB es va confirmar encara més i la seva homeòstasi es va veure certament afectada per LPS. Com era d'esperar, ACT va afectar significativament les seves expressions (figura 3E). La via NF-κB és una via clàssica per regular la progressió de la inflamació, donant lloc, finalment, a l'alliberament de factors proinflamatoris. Per obtenir suport mecanicista, es va avaluar la proteïna clau de la via NF-κB mitjançant Western blot. L'estimulació de LPS va provocar l'activació de NF-κB, associada a la promoció de la polarització M1. D'acord amb l'anàlisi d'ARN-seq, l'ACT va inhibir la fosforilació de NF-κB estimulada per LPS (figura 3F). Per tant, ACT pot alleujar la polarització M1 induïda per LPS mitjançant la via NF-κB a les cèl·lules BV-2.

ACT Biosíntesi d'arginina alterada, així com biosíntesi de pantotenat i CoA

La predicció de la xarxa d'ACT va revelar que estava relacionada amb l'arginina (Arg) i el metabolisme de la prolina (figura 1B). L'ARN seq va demostrar que les vies afectades per ACT també incloïen la biosíntesi d'Arg, així com la biosíntesi de pantotenat i CoA (figura 3D). S'ha suggerit que els trastorns del metabolisme de les cèl·lules BV-2 induïts per l'estimulació LPS estan associats amb la polarització M1 (Orihuela et al., 2016). Així, es va utilitzar un metaboloma cel·lular no dirigit per HPLC-Q-TOF-MS per identificar l'efecte de l'ACT en el metabolisme cel·lular. PCA i PLS-DA (figura 3G) van il·lustrar que els grups de control, LPS i ACT es podrien distingir bé en funció dels metabòlits intracel·lulars. Els nivells de diversos metabòlits a les cèl·lules BV-2 induïdes per LPS es van canviar després del tractament ACT (figura 3H). En comparació amb el grup control, hi va haver 11 metabòlits que van canviar significativament al grup LPS (taula suplementària 2), mentre que 14 metabòlits es van alterar clarament després del tractament de l'ACT (taula suplementària 3), que implicaven 11 vies metabòliques (figura 3I). L'efecte de l'ACT va consistir principalment en la regulació del metabolisme dels aminoàcids, el metabolisme dels nucleòtids, el metabolisme energètic i el metabolisme de cofactors i vitamines. Curiosament, les vies metabòliques obtingudes pel metaboloma eren coherents amb la predicció de la xarxa i l'ARN-seq, inclosa la biosíntesi d'Arg, així com la biosíntesi de pantotenat i CoA. L'anterior va demostrar que l'ACT podria regular la biosíntesi d'Arg, així com la biosíntesi de pantotenat i CoA en cèl·lules BV- 2 estimulades per LPS.

ACTUARDisfunció mitocondrial BV-2 induïda per LPS mitigada

Els mitocondris es troben al nucli de les vies metabòliques. L'evidència en evolució mostra que els mitocondris són un actor clau en la polarització microglial M1/M2. TEM va valorar una visió general de l'estat dels mitocondris en la morfologia i la distribució cel·lular. Després de l'estimulació amb LPS, es va condensar la cromatina de les cèl·lules BV-2 i es va reduir el citoplasma i els mitocondris (figura 4A). A més, les crestas mitocondrials del grup LPS es van desordenar o fins i tot van desaparèixer, mostrant cristòlisi parcial, reducció de mida i morfologia de forma rodona. Curiosament, el tractament ACT podria alleujar els canvis morfològics induïts per LPS en els mitocondris. Per torns, vam examinar la funció mitocondrial de les cèl·lules BV-2 tractades amb LPS, inclosa la producció de MMP i ATP. La producció de MMP (figura 4B) i ATP als mitocondris (figura 4C) es va millorar significativament al grup ACT en comparació amb els del grup LPS. La disfunció mitocondrial pot estar relacionada amb l'augment del nivell de ROS a la cèl·lula. L'anàlisi de citometria de flux va revelar que el contingut de ROS estava sobrecarregat al grup LPS (figura 4D). Afortunadament, ACT va eliminar l'excés de ROS. Suggereix que l'ACT pot restaurar la funció dels mitocondris netejant ROS.

ACT va restaurar la funció mitocòndria mitjançant la regulació a l'alça de PGC-1 i UCP-2

El coactivador del receptor activat per proliferació del peroxisome-1 (PGC-1) té un paper important en la biogènesi mitocondrial (Bi et al., 2019). L'estimulació de LPS va disminuir l'expressió de PGC-1, mostrant una disfunció mitocondrial. Sorprenentment, l'expressió d'ARNm i proteïna del gen PGC-1 es va revertir significativament mitjançant el tractament ACT a les cèl·lules BV-2 tractades amb LPS (figura 4E).

També se sabia que la proteïna de desacoblament mitocondrial-2 (UCP-2) regulava la funció mitocondrial. Com a proteïna aigües avall de PGC-1, pot controlar la despolarització de MMP induïda per LPS i la producció de ROS. Informes recents indiquen que és fonamental per al procés d'activació de la microglia, amb regulació oposada de la polarització M1 i M2 (De Simone et al., 2015). Els resultats de Western blot van mostrar que el nivell de proteïna UCP-2 es va reduir després de l'estimulació de LPS. El cotractament de LPS i ACT podria augmentar l'expressió d'UCP-2 en comparació amb el tractament de LPS. El nivell d'expressió d'ARNm de l'UCP-2 també va mostrar canvis similars (figura 4F). En resum, l'ACT va restaurar la funció dels mitocondris mitjançant la regulació positiva de PGC-1 i UCP-2.

ACT Micròglia reprimida M1

Polarització mitjançant activació AMPK

Com a sensor d'energia cel·lular clau, la proteïna quinasa activada per AMP (AMPK) té un paper important en el manteniment de l'equilibri del metabolisme cel·lular. Al mateix temps, PGC-1 és una proteïna aigües avall de l'AMPK. Com es mostra en l'anàlisi del model de xarxa,ACTUARpodria regular la via AMPK (figura 1B). Els resultats van descobrir que el LPS va inhibir l'activació de l'AMPK, donant lloc a trastorns del metabolisme cel·lular i a la disfunció mitocondrial. Cal destacar que l'ACT podria augmentar en funció de la dosi l'expressió de proteïnes de p-AMPK (figura 5A). Es suggereix que l'ACT podria augmentar l'expressió de PGC-1 i restaurar la funció mitocondrial activant la via de senyalització AMPK. En aquest estudi, per investigar si l'activació d'AMPK va contribuir a l'efecte de regulació deACTUARa la polarització M1/M2, es va utilitzar el compost C (CC) per inhibir l'efecte de l'AMPK. En contrast amb el nivell de NO regulat a la baixa al grup de tractament ACT, CC va bloquejar parcialment l'efecte de l'ACT sobre el nivell de NO (figura 5B). A partir d'aquests resultats, l'ACT podria regular la polarització M1/M2 de les cèl·lules BV-2 mitjançant l'activació d'AMPK.

ACTUAREnllaç amb NF-κB inhibit i amb AMPK activat

Es va aplicar l'acoblament molecular per confirmar si ACT s'uneix a les proteïnes NF-κB i AMPK. Les troballes van demostrar que l'energia d'unió deACTUARi NF-κB era de -8,4 kcal/mol, mentre que el deACTUARi l'AMPK era de -10,8 kcal/mol. Afinitats significatives van verificar que l'ACT s'uneix directament a NF-κB i AMPK (figures 5C, D, F, G). Posteriorment, es van explorar més a fons els possibles modes d'unió i interaccions dins de les butxaques d'aminoàcids, inclosos 11 residus d'aminoàcids de NF-κB (figura 5E), així com 12 residus d'aminoàcids d'AMPK (figura 5H). Aquests resultats van indicar que l'ACT podria afectar directament NF-κB i AMPK per atenuar la polarització M1 de la microglia BV-2 i promoure el fenotip M2.